CS206815B1

CS206815B1 - Amino acid manufacturing method

Info

Publication number: CS206815B1
Application number: CS275579A
Authority: CS
Inventors: Nina V Gluscenko; Vasilij N Bukin; Martin J Beker; Leonid V Dmitrenko; Varvara A Utenkova; Marija A Kuzmina; Lidija S Kuceva; Natalija M Bazdyreva; Gunar K Lijepins; Eleonora B Trusle; Tamara A Pavlova
Original assignee: Nina V Gluscenko; Vasilij N Bukin; Martin J Beker; Leonid V Dmitrenko; Varvara A Utenkova; Marija A Kuzmina; Lidija S Kuceva; Natalija M Bazdyreva; Gunar K Lijepins; Eleonora B Trusle; Tamara A Pavlova
Priority date: 1979-04-20
Filing date: 1979-04-20
Publication date: 1981-07-31

Description

Vynález se vztahuje k mikrobiologickému průmyslu a zvláště ke způsobu výroby aminokyseliny, která nachází použití v lékařství, při výrobě syntetických vláken, v potravinářském průmyslu a chovu zvířat.The invention relates to the microbiological industry, and in particular to a method for producing an amino acid which is used in medicine, in the manufacture of synthetic fibers, in the food industry and in animal husbandry.

Je znám způsob výroby aminokyselin submerní fermentací určitých mikroorganismů, které produkují aminokyseliny, na živném prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje uhlovodíky a jejich deriváty, například n-parafiny s 11 až 18 atomy uhlíku, cyklohexan, benzen z ropy, ethylalkohol a methylalkohol, kyselinu octovou, uhlohydráty, například melasu, produkty hydrolýzy škrobů, brambor nebo obilniny, hexózové hydrolyzáty selektivních druhů z rostlinných surovin.A method for producing amino acids by submerged fermentation of certain amino acid-producing microorganisms on a culture medium containing hydrocarbons and derivatives thereof, such as C 11 -C 18 n-paraffins, cyclohexane, benzene from petroleum, ethyl alcohol and methanol, acid is known acetic acid, carbohydrates such as molasses, hydrolysis products of starches, potatoes or cereals, hexose hydrolysates of selective species from vegetable raw materials.

Zjpůsob výroby aminokyselin v uhlovodíkovém prostředí je znám. Způsob se provádí kultivací směsi mikroorganismů Micrococcus glutamicus v přítomnosti Arthrobacter paraffineus nebo Brevibacterium ketoglutamicum, které mohou asimilovat uhlovodíky a produkovat kyselinu L-glutaminovou, L-lysin, L-valin a L-homoserin (francouzský patent č. 1 577 264).A method for producing amino acids in a hydrocarbon medium is known. The method is carried out by culturing a mixture of Micrococcus glutamicus microorganisms in the presence of Arthrobacter paraffineus or Brevibacterium ketoglutamicum, which can assimilate hydrocarbons and produce L-glutamic acid, L-lysine, L-valine and L-homoserine (French Patent No. 1,577,264).

J e znám způsob výroby aminokyseliny kultivací Pseudomonas, Corynebacterium neboA method for the production of an amino acid by cultivation of Pseudomonas, Corynebacterium or

Sacchromyces v živném prostředí, které obsahuje nenasycené uhlovodíky jako zdroj , uhlíku, minerální soli a stimulátory růstu. Fermentací se z 15 litrů živného prostředí dostane 3,5 g L-asparaginu (japonský patent č. 50-11472).Sacchromyces in a nutrient medium that contains unsaturated hydrocarbons as a source, carbon, mineral salts and growth promoters. Fermentation yields 3.5 g of L-asparagine from Japanese (50-11472) from 15 liters of culture medium.

Je znám způsob výroby L-lysinu kultivací kmene Brevibacterium ketoglutamicum 2473-Np-107 (ATCC 21297) a Arthrobacter paraffineus 2411-Np-82 (ATCC 21298) v živném prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje n-parafiny s 10 až 50 atomy uhlíku, aromatické uhlovodíky, frakce z destilace ropy nebo surovou ropu. V prostředí, které obsahuje 5% hmotnostních n-parafinu s 12 až 17 atomy uhlíku, se nahromadí 3,2 mg/ml lysinu (sovětské autorské osvědčení č. 415 890).A method for producing L-lysine is known by culturing a strain of Brevibacterium ketoglutamicum 2473-Np-107 (ATCC 21297) and Arthrobacter paraffineus 2411-Np-82 (ATCC 21298) in a culture medium containing 10-50 carbon atoms n-paraffins , aromatic hydrocarbons, petroleum distillation fractions or crude oil. In an environment containing 5% by weight of C12-C17 n-paraffin, 3.2 mg / ml of lysine is accumulated (Soviet Patent Certificate No. 415 890).

Je znám rovněž způsob výroby aminokyselin, jako L-lysinu, kyseliny L-asparaginové, L-alaninu, L-valinu, L-leucinu a L-argininu, fermenltací v kulturním prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje methanol. Koncentrace metanolu v prostředí činí pod 3 % objemová. Jako zdroj dusíku se použijí amoniové soli, amoniak, močovina, pepton nebo kvasnicový extrakt. Do prostředí se přidají minerálníIt is also known to produce amino acids such as L-lysine, L-aspartic acid, L-alanine, L-valine, L-leucine and L-arginine by fermentation in a culture medium containing methanol as the carbon source. The concentration of methanol in the medium is below 3% by volume. Ammonium salts, ammonia, urea, peptone or yeast extract are used as the nitrogen source. Mineral is added to the environment

Ž složky a jako producent se použije 'kmen Protaminophagus ATCC 21 927. Výtěžek konečných produktů je tento:The ingredient and the producer is a strain of Protaminophagus ATCC 21 927. The yield of the end products is as follows:

L-iysin 0,21 g/1, kyselina L-asparaginová 0,14 g/1, L-alanin 0,48 g/1, L-valin 0,6 g/1, L-leucin 0,72 g/1, L-arginin 0,49 g/1 (americký patent č. 3907641).L-iysine 0.21 g / l, L-asparaginic acid 0.14 g / l, L-alanine 0.48 g / l, L-valine 0.6 g / l, L-leucine 0.72 g / l L-arginine 0.49 g / L (US Patent No. 3907641).

Je znám také způsob výroby kyseliny L-glutaminové mikrobiologickou syntézou, za použití nečištěné látky obsahující uhlohydrát, jako je produkt hydrolýzy. škrobů, brambor nebo obiloviny, nečištěného cukerného sirupu, melasy z řepy cukrovky a cukrové třtiny, jako zdroje uhlíku. Způsob čištění uvedených zdrojů uhlíku od přebytečného biotinu mikrobiologickým postupem předpokládá sterilizaci materiálu obsahujícího uhlohydrát po jeho vyčištění fermentací, kultivaci producentu kyseliny glutaminové a oddělení konečného produktu. Maximální výtěžek kyseliny glutaminové činí 39,2 g/1 při obsahu 10% uihlohydrátů v živném prostředí. Jako producent se používají tyto mikroorganismy: Micrococous glutamicus, Bacillus subtilis,, Brevibacterium lactofermentum a podobně (americký patent č. 3451891).It is also known to produce L-glutamic acid by microbiological synthesis using a non-purified carbohydrate-containing substance such as a hydrolysis product. starches, potatoes or cereals, unpurified sugar syrup, sugar beet molasses and sugar cane as carbon sources. The method of purifying said carbon sources from excess biotin by a microbiological process involves sterilizing the carbohydrate-containing material after purification by fermentation, cultivating the glutamic acid producer and separating the final product. The maximum yield of glutamic acid is 39.2 g / l at 10% carbohydrate in the culture medium. The following microorganisms are used as a producer: Micrococous glutamicus, Bacillus subtilis, Brevibacterium lactofermentum and the like (U.S. Patent No. 3451891).

Je znám způsob výroby L-lysinu v živném prostředí, které jako zdroj uhlíku obsahuje hydrolyzát polysacharidů. Tento použitý hydrolyzát není konkretizován, ale je známo, že polysacharidy jsou obsaženy v buněčné bláně jak rostlinných materiálů, tak také živých organismů, například kvasnic a hub (sovětské autorské osvědčení č. 171 727).It is known to produce L-lysine in a culture medium which contains a polysaccharide hydrolyzate as a carbon source. The hydrolyzate used is not specific, but it is known that polysaccharides are contained in the cell membrane of both plant materials and living organisms, such as yeast and fungi (Soviet Patent Certificate No. 171,727).

Je znám způsob výroby L-lysinu, který předpokládá použít hexózové hydrolyzáty z cupaniny z bavlnífcových semen nebo celloligninu z jehličnatých druhů dříví. Postup se provádí pomocí producentů, bakterií Micrococcus nebo Brevibacterium. Výtěžek lysinu je 25 g/1 při použití 12 % hmotnostních (přepočteno na cukr) hydrolyzátů z cupaniny z bavlníkových semen (sovětské autorské osvědčení č. 262 053).A method for producing L-lysine is known which envisages using hexose hydrolysates of cottonseed lint or cellolignin from coniferous wood species. The process is carried out by producers, Micrococcus or Brevibacterium. The lysine yield is 25 g / l using 12% by weight (calculated on sugar) of cottonseed lint hydrolyzates (Soviet author's certificate No. 262 053).

Hydrolyzát z cupaniny z bavlnífcových semen a hexózové hydrolyzáty z celloligninu z jehličnatého dříví obsahují monosacharidy se šesti atomy. Nepřítomnost pentózových monosaoharidů negativně ovlivňuje postup mikrobiologické syntézy.Cottonseed Lint Hydrolysate and Coniferous Cellolignin Hexose Hydrolysates contain six atom monosaccharides. The absence of pentose monosaoharides adversely affects the progress of microbiological synthesis.

Uvedené způsoby nebyly realizovány ve velkém technickém rozsahu, protože se cupanina z bavlníkovýoh semen po bezvýznamné úpravě používá na výkrm dobytka a hexózové hydrolyzáty celloligninu z jehličnatého dříví se bez dodatečného zpracování nemohou použít, protože hydrolyzáty rostlinných surovin vedle monosacharidů obsahují příměsi, které zabraňují růstu mikroorganismů.The methods have not been implemented to a large extent because cottonseed lint after insignificant treatment is used for cattle fattening and cellulose lignin hexose hydrolysates cannot be used without further processing because the hydrolyzates of plant raw materials contain, besides monosaccharides, additives which prevent the growth of microorganisms.

Jmenované způsoby mají řadu nedostatků a sice:These methods have a number of drawbacks, namely:

— nízké výtěžky konečných produktů, pokud se jako zdroj uhlíkaté živiny použijí uhlovodíky z ropy, — použití cenných surovin, jako melasy, škrobu a jiných, které se používají jako krmivo pro dobytek, — komplikovaný postup mikrobiologického čištění surového uhlohydrátu. od biotinu v případě použití kyseliny L-glutaminové.- low yields of end products when hydrocarbons from petroleum are used as the carbon nutrient source, - use of valuable raw materials such as molasses, starch and others used as cattle feed, - complicated microbiological purification process for crude carbohydrate. from biotin when L-glutamic acid is used.

Účelem tohoto vynálezu je vyvarovat se uvedených nedostatků.The purpose of the present invention is to avoid these drawbacks.

V souladu s cílem byl stanoven úkol vyvinout způsob výroby aminokyseliny volbou vhodného živného prostředí pro produkční mikroorganismy, které umožňuje intenzifikovat postup a zlepšit jakost konečného produktu a zvýšit jeho výtěžek.In accordance with the objective, the objective was to develop a method for producing an amino acid by selecting a suitable culture medium for producing microorganisms which makes it possible to intensify the process and improve the quality of the final product and increase its yield.

Tento úkol je vyřešen tím, že se podle vynálezu při způsobu výroby aminokyseliny submersní fermentací mikroorganismů produkujících aminokyselinu v živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku, dusíku a minerální soli, jako zdroj uhlíku použije směs hexózových a pentózových monosacharidů, získaných perkolační hydrolýzou rostlinných surovin obsahujících celulózu, vyčištěná od furfurolu a Obsahující 1 až 3 % hmot. hydroxymethylfurfurolu a lignohuminových látek, vztaženo na hmotnost monosacharidů, při hmotnostním poměru hexózových a pentózových monosacharidů 52 až 98 :48 až 2.This object is achieved by the use of a mixture of hexose and pentose monosaccharides obtained by percolating hydrolysis of cellulose-containing vegetable raw materials as a source of carbon according to the invention in a process for the production of an amino acid by submersive fermentation of amino acid-producing microorganisms containing a source of carbon, nitrogen and mineral salt. %, purified from furfurol and containing 1 to 3 wt. hydroxymethylfurfurol and lignumuminous substances, based on the weight of the monosaccharides, at a weight ratio of hexose to pentose monosaccharides of 52 to 98: 48 to 2.

Přednost použití směsi monosacharidů, získaných perkolační hydrolýzou rostlinných surovin obsahujících celulózu, spočívá v tom, že přítomnost pentózových monosacharidů stimuluje růlst mikroorganismů a jejich produkční schopnost.The advantage of using a mixture of monosaccharides obtained by percolating hydrolysis of cellulose-containing vegetable raw materials is that the presence of pentose monosaccharides stimulates the growth of microorganisms and their production ability.

Odstranění furfurolu, hydroxymethylfurfurolu a ligninhuminových látek způsobuje intenzifikaci postupu mikrobiologické syntézy aminokyseliny.Removal of furfurol, hydroxymethylfurfurol and ligninhumines causes intensification of the microbiological amino acid synthesis process.

Aby se umožnilo pokud možno co nejúplnější odstranění shora uvedených příměsí, čištěni udané směsi hexózových a pentózových monosacharidů se účelně provádí filtrací při hodnotě pH 3,3 až 3,7, vakuovým odpařením při teplotě 60 až 80 °C na obsah monosacharidů 6 až 11 % hmotnostních, oxidací plynem obsahujícím kyslík v přítomnosti adsorpčního činidla nebo alkalie a sterilací.In order to allow the removal of the abovementioned impurities as completely as possible, the purification of said mixture of hexose and pentose monosaccharides is expediently carried out by filtration at a pH of 3.3 to 3.7, by vacuum evaporation at 60 to 80 ° C to a monosaccharide content of 6 to 11%. by oxidation with an oxygen-containing gas in the presence of an adsorbent or alkaline and sterilization.

Pro zvýšení výtěžku konečného produktu a zlepšení jeho jakosti se s výhodou používá směs hexózových a pentózových monosacharidů z perkolační hydrolýzy listnatého a jehličnatého dříví, přičemž poměr hexózových monosacharidů k pentózovým monosacharidům, vyjádřený jako hmotnostní %, činí 79 až 96,4 : 21 až 3,6.A mixture of hexose and pentose monosaccharides from percolational hydrolysis of deciduous and coniferous wood is preferably used to increase the yield of the final product and improve its quality, the ratio of hexose monosaccharides to pentose monosaccharides expressed as% by weight being 79 to 96.4: 21 to 3, 6.

Způsob výroby aminokyseliny podle vynálezu se provádí jak je uvedeno dále.The process for producing the amino acid of the invention is carried out as follows.

Při způsobu výroby aminokyselin se předpokládá, že se jako zdroj uhlíku použije čistá směs hexózových a pentózových monosacharidů z perkolační hydrolýzy rostlinných surovin obsahujících celulózu,In the amino acid production process, a pure mixture of hexose and pentose monosaccharides from percolational hydrolysis of cellulose-containing vegetable raw materials is assumed to be the carbon source,

V SSSR se zpracovává rostlinná surovina perkolační metodou hydrolýzy zředěnou kyselinou sírovou. Perkolační metoda hydrolýzy umožňuje zpracovat všechny druhy rostlinných surovin obsahujících celulózu, jako zemědělských odpadů (rýžová a bavlněná pouzdra, kukuřiční palice, slupky ze slunečnicových semen), odpadů při zpracování dřeva a z pil (krajinky, kraje, třísky) a dřeva nezávisle na jeho druhu.In the USSR, the plant material is processed by the percolation method of dilute sulfuric acid hydrolysis. The percolational hydrolysis method makes it possible to treat all types of cellulose-containing vegetable raw materials, such as agricultural waste (rice and cotton shells, corn sticks, sunflower seed husks), wood and sawmill waste (landscapes, regions, chips) and wood regardless of its type.

Při dvojstupňové hydrolýze, například listnatého dříví, se postup provádí v prvním stupni za vzniku hlavně pentózových monosacbaridů pro následující výrobu furfurolu. V druhém stupni postupu se dostane roztok směsi monosacharidů, který odpovídá výhodnému poměru pro mikrobiologickou syntézu aminokyseliny a sice obsahuje 90 až 95 % hexózových monosacharidů a 5 až 10 % pentózových monosacharidů.In a two-stage hydrolysis, for example of deciduous wood, the process is carried out in the first step to produce mainly pentose monosacbarides for the subsequent production of furfurol. In the second step of the process, a solution of a monosaccharide mixture is obtained which corresponds to a preferred ratio for microbiological amino acid synthesis, namely comprising 90 to 95% hexose monosaccharides and 5 to 10% pentose monosaccharides.

Při zpracování jehličnatého dříví hydrolyzát z prvního stupně obsahuje směs hexó3 zovýóh monosacharidů (70 až 80 %) a pentózových monosacharidů (20 až 30 %). Uvedená směs monosacharidů se používá pro výrobu kvasinkové bílkoviny. Hydrolyzát z druhého stupně hydrolýzy jehličnatého dříví obsahuje 95 až 98 % hexózových monosacharidů a 2 až 5 % pentózových monosacharidů.In the processing of coniferous wood, the hydrolyzate of the first step comprises a mixture of hexobenzylated monosaccharides (70-80%) and pentose monosaccharides (20-30%). Said mixture of monosaccharides is used for the production of yeast protein. The second hydrolyzate of coniferous hydrolysis comprises 95-98% hexose monosaccharides and 2-5% pentose monosaccharides.

Technické hydrolyzáty perkolační hydrolýzy rostlinné suroviny obsahující celulózu obsahují směs hexózových a pentózových monosadharidů v množství 2 až 3 % hmotnostní. Změnou podmínek perkolační hydrolýzy a suroviny se získá roztok směsi monosacharidů, . která je uvedena v tabulce.The technical hydrolysates of the percolational hydrolysis of the cellulose-containing vegetable feedstock contain a mixture of hexose and pentose monosadharides in an amount of 2 to 3% by weight. By changing the conditions of the percolation hydrolysis and the feedstock, a solution of a mixture of monosaccharides is obtained. in the table.

TabulkaTable

Složení monosacharidů z hydrolyzátů, získaných perkolační hydrolýzou rostlihnýoh surovin obsahujících celulózuComposition of monosaccharides from hydrolysates obtained by percolational hydrolysis of plant cellulose-containing raw materials

Typ hydrolyzátů Type hydrolyzates Rostlinná surovina obsahující celulózu Vegetable raw material containing cellulose Relativní obsah monosacharidů, % Relative monosaccharide content,% glukóza glucose mannóza mannosis galaktóza galactose xylóza xylose arabinóza arabinose Jednostupňová Single stage Jehličnaté dříví Coniferous wood 70,94 70.94 17,41 17.41 2,59 2.59 7,34 7.34 1,72 1.72 perkolační percolation Listnaté dříví Deciduous firewood 61,93 61.93 2,78 2.78 1,61 1.61 32,36 32.36 1,31 1.31 hydrolýza hydrolysis Směs listnatého Deciduous mixture a jehličnatého dříví Slupky ze sluneční- and coniferous skins 66,57 66.57 10,17 . 10.17. 2,03 2.03 19,77 19.77 1,45 1.45 cových semen seeds 55,15 55.15 3,11 3.11 1,94 1.94 32,62 32.62 5,44 5.44 Kukuřičné palice Corn cobs 49,49 49.49 — - 2,72 2.72 43,43 43.43 4,79 1,30 4.79 1.30 Bavlněná pouzdra Cotton cases 61,22 61.22 1,46 1.46 1,30 1.30 36,42 36.42 Druhý stupeň Second level Jehličnaté dříví Coniferous wood 92,66 92.66 5,06 5.06 2,08 2.08 dvojstupňové two-stage Listnaté dříví Deciduous firewood 92,87 92.87 1,84 1.84 — - 5,29 5.29 — - perkolační percolation Směs jehličnatého Mixture coniferous hydrolýzy^x)hydrolysis ^x ) a listnatého dříví Směs slupek ze slunečnicových semen and deciduous wood A mixture of sunflower seed husks 92,75 92.75 3,62 3.62 3,62 3.62 a kukuřičných palic and corn cobs 90,30 90.30 1,95 1.95 7,77 7.77 Druhý stupeň dvojstupňové perkolační hydrolýzy*) Second stage of two-stage percolation hydrolysis *) Bavlněná pouzdra Cotton cases 92,82 92.82 2,39 2.39 — - 4,79 4.79

^x> Hydrolyzát z prvního stupně hydrolýzy se použije pro výrobu furfurolu nebo xylitu nebo krmných kvasnic ^x > The hydrolyzate from the first hydrolysis stage is used for the production of furfurol or xylite or feed yeast

Hydrolyzáty z rostlinné suroviny obsahují vedle cukru příměsi, které představují komplikovanou směs sloučenin, odlišujících se množstvím a vlastnostmi. Příměsi přítomné v hydrolyzátech se mohou rozdělit do dvou skupin, na těkavé a netěkavé složky. Těkavé inhibující příměsi činí 1 až 3 % hmotnostní směsi monosacharidů a netěkavé jsou obsaženy v množství 5 až 6 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.In addition to sugar, the hydrolyzates from the vegetable raw material contain admixtures which represent a complicated mixture of compounds differing in quantity and properties. The impurities present in the hydrolysates can be divided into two groups, the volatile and the non-volatile components. The volatile inhibitory ingredients are 1 to 3% by weight of the monosaccharide mixture and the non-volatile are present in an amount of 5 to 6% by weight, based on the monosaccharide mixture.

Furfurol, přítomný v hydrolyzátů rostlinné suroviny Obsahující celulózu v množství 0,03 až 0,07 % hmotnostních, otravuje fermentační systém mikroorganismů. Přítomnost hydroxymethylfurfurolu v prostředí hydrolýzy prodlužuje růst mikroorganismů a brání jejich produkční schopnosti. Lignohuminové látky a barviva, které jsou obsaženy v hydrolyzátu, se zachycují na buněčných blánách mikroorganismů a ztěžují pronikání živin do buňky.Furfurol, present in the hydrolyzates of the plant material containing cellulose in an amount of 0.03 to 0.07% by weight, poisons the fermentation system of microorganisms. The presence of hydroxymethylfurfurol in the hydrolysis environment prolongs the growth of microorganisms and hinders their production ability. Lignohumine substances and dyes contained in the hydrolyzate are trapped on the cell membranes of microorganisms and make it difficult for nutrients to enter the cell.

Protože se perkolační hydrolýza rostlinných surovin obsahujících celulózu provádí v přítomnosti kyseliny sírové jako katalyzátoru postupu, získaný roztok směsi monosacharidů se především neutralizuje.Since the percolation hydrolysis of the cellulose-containing vegetable raw materials is carried out in the presence of sulfuric acid as the catalyst for the process, the obtained solution of the monosaccharide mixture is primarily neutralized.

Kyselý hydrolyzát se neutralizuje vápeným mlékem nebo čpavkovou vodou, s výhodou na hodnotu pH 3,3. až 3,7 a odfiltruje se od suspendovaných látek.The acid hydrolyzate is neutralized with lime milk or ammonia water, preferably to a pH of 3.3. to 3.7 and filtered from the suspended solids.

Filtrát se odpaří ve vakuu při teplotě 60 až 80 °C ha obsah monosacharidů 6 až 11 % hmotnostních, který je pro mikrobiologickou syntézu aminokyseliny optimální.The filtrate is evaporated under vacuum at 60-80 ° C and a monosaccharide content of 6-11% by weight, which is optimal for microbiological amino acid synthesis.

Dodržování uvedených parametrů odpařovacího procesu umožňuje nejen snížit rozpad cuíkru, ale také dosáhnout úplného odstranění těkavých inhibujícíah příměsí, furfurolu a methylfurfurolu.Compliance with these parameters of the evaporation process allows not only to reduce the decomposition of the sulfur, but also to achieve complete removal of the volatile inhibitory impurities, furfurol and methylfurfurol.

Netěkavé organické příměsi hydrolyzátu, jako hydroxymethylřurfurol, lignohuminové látky a barviva, se oxidují.Non-volatile organic impurities of the hydrolyzate, such as hydroxymethylurfurol, lignumuminous substances and dyes, are oxidized.

Oxidace odpařeného filtrátu směsi monosachiaridů se provádí plyneim obsahujícím kyslík v přítomnosti adsorpčního prostředku, například aktivního uhlí, nebo alkalie. Provzdušňování se účelně provádí 60 minut při teplotě 45 °C.The oxidation of the vaporized monosaccharide mixture filtrate is carried out with oxygen-containing gas in the presence of an adsorbent such as activated carbon or alkaline. The aeration is expediently carried out for 60 minutes at 45 ° C.

Vedle oxidace netěkavýoh příměsí se při provzdušňování uspíší kongulace lignohuminových látek, které jsou v hydrolyzátu v koloiidním stavu.In addition to the oxidation of nonvolatile impurities, the conglomeration of the lignumuminous substances, which are colloidal in the hydrolyzate, is accelerated during aeration.

Zmíněné operace umožňují, aby byl snížen obsah hydroxymetylfurřurolu a lignohuminových látek na 1 až 3 %, vztaženo na hmotnost monosacharidů v roztoku.Said operations allow the content of hydroxymethylfurururol and lignumuminous substances to be reduced to 1 to 3%, based on the weight of the monosaccharides in solution.

Navržené čištění intenzifikuje postup mikrobiologické syntézy aminokyseliny odstraněním těkavých a netěkavých inhibujících příměsí z hydrolyzátu.The proposed purification intensifies the microbiological amino acid synthesis process by removing volatile and nonvolatile inhibitory impurities from the hydrolyzate.

Do vyčištěného roztoku směsi monosacharidů se přidá zdroj dusíku a minerální soli a rotztok se steriluje.To the purified solution of the monosaccharide mixture is added a source of nitrogen and mineral salt and the solution is sterilized.

Živné prostředí získané tímto způsobem se naočkuje 24 hodinovou kulturou mikroorganismu producentu a provádí se fermentace za aerobních podmínek.The culture medium obtained in this way is inoculated with a 24-hour culture of the producer microorganism and fermented under aerobic conditions.

Po skončení fermentace se konečný produkt ve formě aminokyseliny oddělí o sobě známým způsobem.After the fermentation is complete, the final amino acid product is separated in a manner known per se.

Způsob podle vynálezu umožňuje postup intenszifikovat, zlepšit jakost aminokyseliny a zvýšit její výtěžek použitím směsi hexózových a pentózových monosacharidů jako zdroje uhlíku, přičemž tyto monosacharidy se získají perkolační hydrolýzou rostlinně suroviny obsahující celulózu, která je k dispozici v neohraničeném. množství.The process according to the invention allows the process to be intensified, to improve the quality of the amino acid and to increase its yield by using a mixture of hexose and pentose monosaccharides as a carbon source, these monosaccharides being obtained by percolating hydrolysis of the cellulose-containing vegetable feedstock available unlimited. amount.

Další výhoda tohoto vynálezu spočívá v dostupnosti a nízké ceně zdroje uhlíku, protože směs monosacharidů, získaná perkolační hydrolýzou suroviny, obsahující celulózu, například dříví, je o 30 % levnější než nejvíce rozšířený zdroj uhlíku k výrobě aminokyselin, melasa.A further advantage of the present invention lies in the availability and low cost of the carbon source, since the monosaccharide mixture obtained by percolating the hydrolysis of the cellulose-containing feedstock, e.g.

Kromě toho je možné při použití směsi monosacharidů, jako zdroje uhlíku, zkrátit technologickou operaci proti známým způsobům (americký patent č. 3 451 891), kdy je zapotřebí komplikovaného mikrobiologidkého čištění zdroje uhlíku, melasy, od přebytečného biotinu.In addition, using a mixture of monosaccharides as a carbon source, it is possible to shorten the technological operation over the known methods (U.S. Patent No. 3,451,891) where complicated microbiologic purification of the carbon source, molasses, from excess biotin is required.

Dodatková výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že roztok směsi monosacharidů, použitý jako zdroj uhlíku, obsahuje v dostatečně čistém a optimálním množství také růstové látky pro mikroorganismy, protože materiály obsahující celulózu mají přírodní rostlinný základ.An additional advantage of the process according to the invention is that the solution of the monosaccharide mixture used as the carbon source also contains growth substances for microorganisms in a sufficiently pure and optimal amount, since cellulose-containing materials have a natural plant base.

Výhoda způsobu podle vynálezu spočívá také v tom, že je možné použít také nové zdroje uhlíku k syntéze aminokyseliny, například L-lysinu, pro získání nehygroskopického produktu, který se při deíšim skladování nespéká.An advantage of the process according to the invention is also that new carbon sources can also be used to synthesize an amino acid, for example L-lysine, to obtain a non-hygroscopic product which does not sinter during storage.

Pro lepší porozumění způsobu výroby aminokyseliny podle vynálezu jsou uvedeny následující příklady.In order to better understand the method of making the amino acid of the invention, the following examples are provided.

Příklad 1 ‘Example 1 ‘

Hydrolyzát, získaný dvojstupňovou perkolační hydrolýzou směsi jehličnatého a listnatého dříví, který obsahuje 2,51 % hmotnostních hexózových a 0,09 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,3, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 60 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 6,0 % hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosacharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem 60 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti aktivního Uhlí a filtruje.The hydrolyzate obtained by the two-stage percolational hydrolysis of a mixture of coniferous and deciduous wood containing 2.51% by weight of hexose and 0.09% by weight of pentose monosaccharides is neutralized to pH 3.3, filtered and the filtrate evaporated in vacuo at 60 ° C. up to 6.0% by weight of the monosaccharide. The evaporated solution of the monosaccharide mixture is oxidized with air oxygen for 60 minutes at 45 ° C in the presence of activated carbon and filtered.

Čištěním hydrolyzátu se zcela odstraní furfurol, co se potvrdí plynovou chromatografickou analýzou. Obsah hydroxymethylfurfurolu a lignohuminovýeh látek po čištění činí 2,5 %, vztaženo ná hmotnost monosacharidů. Jejich Obsah se stanoví spektrofotometrickou metodou u hydrolyzátu před čištěním a po něm.Purification of the hydrolyzate completely removed furfurol, which was confirmed by gas chromatography analysis. The content of hydroxymethylfurfurol and lignum aluminum after purification is 2.5% based on the weight of the monosaccharides. Their content is determined by the spectrophotometric method of the hydrolyzate before and after purification.

K vyčištěnému roztoku monosacharidů, vztaženo na množství 1000 ml, se přidá 15 g síranu amonného (NH₄)₂SO₄, 0,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO₄, 0,5 g kyselého fosforečnanu draselného KH₂PO₄, 0,2 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO₄.7 H₂O, 2,5 g kukuřičného extraktu a 0,4 g homoserinu a hodnota pH prostředí se upraví alkálií na 7,0. Prostředí se nalije, vždy v množství 50 ml, do třepací baňky o objemu 750 ml. Do každé baňky se vnese 0,5 g křídy a steriluje za přetlaku 80 kPa během 30 minut. Potom se vnese vždy 2,5 ml 24 hodinové kultury Brevibacterium 22. Tato kultura se připraví na očkovacím prostředí tohoto složení: ' glukóza 2,0 % hmotnostní, kukuřičný extrakt 2,0 % hmotnostní, chlorid sodný NaCl 0,3 % hmotnostního, pH prostředí 7,0. Očkovací prostředí se sterilizuje, očkuje na šikmý agar s 24 hodinovou kulturou a kultivuje 24 hodiny při teplotě 28 až 32 °C na třepačce.To the purified monosaccharide solution, based on 1000 ml, add 15 g of ammonium sulphate (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.5 g of potassium K ₂ HPO ₄ , 0.5 g of potassium K ₂ PO ₄ , 0 2 g of magnesium sulfate heptahydrate MgSO ₄ .7H ₂ O, 2.5 g of corn extract and 0.4 g of homoserine and the pH of the medium is adjusted to 7.0 with alkali. Pour the medium in 50 ml portions into a 750 ml shake flask. 0.5 g of chalk is added to each flask and sterilized under a positive pressure of 80 kPa for 30 minutes. Then 2.5 ml of a 24-hour culture of Brevibacterium 22 are then introduced. This culture is prepared in a vaccine medium of the following composition: glucose 2.0% by weight, corn extract 2.0% by weight, sodium chloride NaCl 0.3% by weight, pH environment 7.0. The inoculation medium is sterilized, inoculated on a 24 hour culture agar and cultured for 24 hours at 28-32 ° C on a shaker.

Jako producent L-lysinu se používá kmen Brevibacterium 22, který je deficitní na homoserin.As a L-lysine producer, a homoserine deficient strain of Brevibacterium 22 is used.

Fermentace se provádí při teplotě 28 až 30 °C na třepačce s počtem otáček 200 za minutu po dobu 60 hodin. Koncentrace L-lysinu činí 18 mg/ml a výtěžek aminokyseliny 30 %, vztaženo na směs monosacharidů v živném prostředí. Kulturní kapalina se oddělí od bakteriální biomasy, okyselí na hodnotu pH 4 až 5 a stabilizuje kyselým pyrosiřičitanem sodným v množství 0,2 % hmotnostního. Stabilní kapalina se vede ionoměničovými kolonami naplněnými ionexem. Získaný eluát se odpaří na obsah L-lysinu 40 % hmotnostních, potom se roztok okyselí na hodnotu pH asi 5,0, ochladí na teplotu 12 až 14°C a krystaluje.The fermentation is carried out at 28 to 30 ° C on a shaker at 200 rpm for 60 hours. The concentration of L-lysine is 18 mg / ml and the amino acid yield is 30% based on the mixture of monosaccharides in the culture medium. The culture liquid is separated from the bacterial biomass, acidified to a pH of 4-5 and stabilized with 0.2% by weight sodium bisulfite. The stable liquid is passed through ion exchange columns filled with an ion exchange resin. The eluate obtained is evaporated to a L-lysine content of 40% by weight, then the solution is acidified to a pH of about 5.0, cooled to 12-14 ° C and crystallized.

swith

Příklad 2Example 2

Hydroíyzát, získaný dvojstupňovou peťkolační hydrolýzou jehličnatého dříví, který obsahuje 2,73 % hmotnostních hexózových a 0,07 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,5, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 70 °C až se dosáhne koncentrace monosacharidů 11 % hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosacharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem v přítomnosti aktivního uhlí 30 minut při teplotě 45 ’C. Roztok se potom filtruje. Po vyčištění se získá roztok směsi monosacharidů, který neobsahuje furfurol, jak se stanoví chromatografickou metodou nsa fázovém rozhraní plyn — kapalina. Množství hydroxymethylfiurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 1 % hmotnostní, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví epektrofotometrickou metodou před a po vyčištění. K vyčištěnému roztoku směsi monosacharidů, použitému v množství 9,6 litrů, se přidá 225 g síranu amonného (NH^aSOí 7,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO$, 7,5 g akyselého fosforečnanu draselného ΚΉ2ΡΟ4, 3 g heptahýdrátu síranu horečnatého MgSÓ₄. 7H₂O, 600 g kukuřičného extraktu a 50 g živných kvasinek a doplní se vodou na 15 litrů. Prostředí se vnese do enzymatického aparátu o objemu 30 litrů a steriluje při tlaku 100 kPa po dobu 30 minut. Po sterilaci se hodnota pH upraví na 7,0 čpavkovou vodou. Potom se vnese 750 ml 24 hodinové kultury Brevibacterium 22, která'se získala obdobně jako v příkladu 1. Fermentace se provádí při teplotě 28 až 30 °C za proťukávání vzduchem v množství 1 m³/m³ prostředí za míchání při počtu otáček 400 až 500 za minutu. Během fermentace se udržuje hodnota pH prostředí čpavkovou vodou nebo kyselinou sírovou. Fermentace trvá 60 hodin. Koncentrace L-lysinu činíThe hydrolyzate obtained by the two-stage five-year hydrolysis of coniferous wood containing 2.73% by weight of hexose and 0.07% by weight of pentose monosaccharides is neutralized to pH 3.5, filtered and the filtrate is evaporated under vacuum at 70 ° C until monosaccharide concentration of 11% by weight. The vaporized solution of the monosaccharide mixture is oxidized with air oxygen in the presence of activated carbon for 30 minutes at 45 ° C. The solution is then filtered. After purification, a solution of the monosaccharide mixture is obtained which is furfurol-free as determined by the gas-liquid phase interface chromatography method. The amount of hydroxymethylfururfurol and lignumumin substances in the purified solution is 1% by weight, based on the weight of the monosaccharides. Their content is determined by an epectrophotometric method before and after purification. A purified solution of a mixture of monosaccharides used in an amount of 9.6 liters was added 225 g of ammonium sulfate (NH ^ aSOí 7.5 g of potassium phosphate medium K ₂ HPO $, 7.5 g of potassium phosphate akyselého ΚΉ2ΡΟ4, 3 g of magnesium sulfate heptahydrate MgSO ₄ , 7H ₂ O, 600 g of corn extract and 50 g of nutrient yeast and made up to 15 liters with water are added to a 30-liter enzymatic apparatus and sterilized at 100 kPa for 30 minutes. 750 ml of a 24-hour culture of Brevibacterium 22, obtained in analogy to Example 1, are introduced. Fermentation is carried out at a temperature of 28 to 30 [deg.] C. with air purging at a rate of 1 m ³ / m ^3. with stirring at 400 to 500 rpm, during fermentation the pH of the medium is maintained with ammonia water or sulfuric acid, and the fermentation lasts 60 hours.

22,4 g gramů na litr a výtěžek aminokyseliny 32 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.22.4 g grams per liter and an amino acid yield of 32% by weight based on the monosaccharide mixture.

Po fermentací se kulturní kapalina okyselí na hodnotu pH 4 až 5 a stabilizuje kyselým pyrosiřičitanem sodným v množství 0,2 % hmotnostního. Stabilizovaná kulturní kapalina se suší v rozstřikovací sušárně. Hotový produkt není hydroskopický a při delším skladování se nespéká a netvoří hrudky. Příklad 3After fermentation, the culture liquid is acidified to a pH of 4-5 and stabilized with 0.2% by weight sodium bisulfite. The stabilized culture liquid is dried in a spray drier. The finished product is not hygroscopic and does not sinter and form lumps upon prolonged storage. Example 3

Hydroíyzát, získaný při dvojstupňové perkolační hydrolýze listnatého dříví, který obsahuje směs 2,26 % hmotnostních hexózových a 0,14 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,7, filtruje a filtrát odpařuje ve vakuu při teplotě 80 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 9 % hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosacharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem po dobu 60 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti aktivního uhlí a filtruje.The hydrolyzate obtained in the two-stage percolational hydrolysis of deciduous wood containing a mixture of 2.26% by weight of hexose and 0.14% by weight of pentose monosaccharides is neutralized to pH 3.7, filtered and the filtrate evaporated under vacuum at 80 ° C until reaching a monosaccharide concentration of 9% by weight. The vaporized solution of the monosaccharide mixture is oxidized with atmospheric oxygen for 60 minutes at 45 ° C in the presence of activated carbon and filtered.

Čištěním hydrolyzátů Se kvantitativně odstraní furfurol, 00 se stanoví chromatografickou metodou na fázovém rozhraní plyn— kapalina. Množství hydroxymethylfiurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 1,8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrofotometrickou metodou z roztoku před a po vyčištění.Purification of the hydrolysates Furfurol 100 is quantitatively removed by gas-liquid phase interface chromatography. The amount of hydroxymethylfururfurol and the lignumumin substances in the purified solution is 1.8% by weight, based on the weight of the monosaccharides. Their content is determined by spectrophotometric method from solution before and after purification.

K vyčištěnému roztoku monosacharidů, použitému v množství 660 ml, se přidá zdroj dusíku, minerální soli a růstové látky, analogicky jako v příkladu 1 a živné prostředí se doplní na objem 1 litru. Fermentace se provádí v třepací baňce, obdobně jako v příkladu 1. Koncentrace L-lysinu činí 21,1 mg/ ml a výtěžek aminokyseliny 28 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.To the purified monosaccharide solution used in an amount of 660 ml, a nitrogen source, mineral salts and growth agents are added, analogously to Example 1, and the medium is brought to a volume of 1 liter. The fermentation was carried out in a shake flask, similar to Example 1. The concentration of L-lysine was 21.1 mg / ml and the amino acid yield was 28% by weight based on the monosaccharide mixture.

Příklad 4Example 4

Hydroíyzát, získaný jednostupňovou hydrolýzou jéhličnatého dříví, který obsahuje 2,55 % hmotnostních hexózových a 0,25 % hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,4, filtruje a filtrát odpaří ve vakuu při teplotě 75 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 10 % hmotnostních. Odpařený roztok se oxiduje vzdušným kyslíkem po dobu 60 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti hydroxidu draselného. Vzniklá sraženina se odfiltruje. Naprostá nepřítomnost furfurolu ve vyčištěném roztoku monosacharidů se kontroluje chromatografickou metodou na fázovém rozhraní plyn—kapalina. Množství hydroxymethylfurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 1,8 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrafotometrickou metodou.The hydrolyzate obtained by the single-stage hydrolysis of coniferous wood, which contains 2.55% by weight of hexose and 0.25% by weight of pentose monosaccharides, is neutralized to pH 3.4, filtered and the filtrate is evaporated under vacuum at 75 ° C until the monosaccharide concentration is reached 10% by weight. The evaporated solution was oxidized with atmospheric oxygen for 60 minutes at 45 ° C in the presence of potassium hydroxide. The resulting precipitate was filtered off. The absolute absence of furfurol in the purified monosaccharide solution is checked by the gas-liquid phase interface chromatography method. The amount of hydroxymethylfurfurol and lignumumin substances in the purified solution is 1.8% by weight, based on the weight of the monosaccharides. Their content is determined by the spectrophotometric method.

Do čistého roztoku monosacharidů, v množství 860 ml, se vnese 25 g síranu amonného (NH^SOé, 0,5 g středního fosforečnanu draselného Κ2ΗΡΌ4, 0,5 g kyselého fosforečnanu draselného Κ₂ΗΡΟ₄ a 0,4 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO4.7H₂O a doplní vodou na objem 1 litru. Hodnota pH se potom upraví čpavkovou vodou na 7,0. Prostředí se nalije, vždy v množství 50 ml, do třepací baňky o objemu 750 ml. Do každé baňky se vnese 1 g křídy a steriluje za přetlaku 80 kiPa během 30 minut. Potom se vnese vždy 2,5 ml 24 hodinové kultury Brevibacterium flavum ATCC 14 067.To a clear solution of monosaccharides in an amount of 860 ml was charged with 25 g of ammonium sulfate (NH ^ Soe, 0.5 g of potassium secondary phosphate Κ2ΗΡΌ4, 0.5 g potassium dihydrogen phosphate ₂ Κ ΗΡΟ ₄ and 0.4 g of magnesium sulfate heptahydrate MgSO4 7H ₂ O and adjusted with water to a volume of 1 liter. the pH was then adjusted to 7.0 with ammonia water. the medium is poured each in an amount of 50 ml to shake flask of 750 ml. to each flask, 1 g of chalk 2.5 ml of a 24 hour culture of Brevibacterium flavum ATCC 14 067 was added.

Prostředí pro očkovací materiál má toto složení:The vaccine environment has the following composition:

glukóza 2,0 % hmotnostní, kukuřičný extrakt 2,0 % hmotnostní, chlorid sodný NaCl 0,3 % hmotnostního, pH prostředí 7,0 až 7,2. Prostředí se steriluje při přetlaku 80 kPa po dobu 40 minut. Očkovací materiál se kultivuje v třepací baňce při teplotě 28 až 30 °C po dobu 24 hodin. Jako producent se použije mikroorganismus Brevibacterium flavum ATCC 14 067.glucose 2.0% by weight, corn extract 2.0% by weight, sodium chloride NaCl 0.3% by weight, pH of the environment 7.0 to 7.2. The medium is sterilized at a pressure of 80 kPa for 40 minutes. The seed material is cultured in a shake flask at 28-30 ° C for 24 hours. Brevibacterium flavum ATCC 14 067 is used as producer.

Hlavní fermentace se provádí na třepačce při teplotě 28 až 30 ^ŮC při počtu otáček míchaidla 140 za minutu po dobu 72 hodin. Koncentrace kyseliny L-glutaminové činí 42 mg/ ml a výtěžek aminokyseliny 49 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů.The main fermentation is performed in a shaker at 28 DEG C. at 30 ^for speed míchaidla 140 rpm for 72 hours. The concentration of L-glutamic acid is 42 mg / ml and the amino acid yield is 49% by weight based on the weight of the monosaccharides.

Příklad 5Example 5

Hydrolyzát, získaný dvojstupňovou perkolační hydrolýzou listnatého dříví, který obsahuje 2,23 % hmotnostních hexózových a 0,17% hmotnostního pentózových monosacharidů, se neutralizuje na hodnotu pH 3,6, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 72 °C. až se dosáhne koncentrace monosaoharidů 10% hmotnostních. Odpařený roztok směsi monosaoharidů se oxiduje vzdušným kyslíkem v přítomnosti aktivního uhlí 30 minut při teplotě 45 °C a filtruje.The hydrolyzate obtained by the two-step percolational hydrolysis of deciduous wood containing 2.23% by weight of hexose and 0.17% by weight of pentose monosaccharides is neutralized to pH 3.6, filtered and the filtrate evaporated in vacuo at 72 ° C. until a monosaoharide concentration of 10% by weight is reached. The evaporated solution of the monosaoharide mixture is oxidized with atmospheric oxygen in the presence of activated carbon at 45 ° C for 30 minutes and filtered.

Čistý roztok neobsahuje furfurol, jak se stanoví chromatografickou metodou na fázovém rozhraní plyn—kapalina. Množství hydroxymethylfurfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku směsi monosacharidů; činí 2,2 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrofotometriokou metodou u roztoku před a po vyčištění.The pure solution does not contain furfurol as determined by the gas-liquid phase interface chromatography method. Amounts of hydroxymethylfurfurol and lignumumin substances in the purified monosaccharide mixture solution; it is 2.2% by weight, based on the weight of the monosaccharides. Their content is determined by the spectrophotometric method of the solution before and after purification.

K vyčištěnému roztoku směsi monosacharidů použitému v množství 15 litrů, se přidá 450 g síranu amonného (NH₄)₂SO₄, 7,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO₄, 7,5 g •kyselého fosforečnanu draselného KH₂PO₄a 6 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO₄.7H₂O.To the purified solution of the monosaccharide mixture used in an amount of 15 liters, add 450 g of ammonium sulphate (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 7.5 g of K ₂ HPO ₄ medium, 7.5 g of KH ₂ PO ₄ acidic potassium phosphate and 6 g magnesium sulphate heptahydrate MgSO ₄ .7H ₂ O.

Prostředí se vnese do enzymatického aparátu o objemu 30 litrů a steriluje za přetlaku 100 kPa po dobu 30 minut. Potom se vnese 750 ml 24 hodinové kultury Brevibactetium flavum ATCC 14 067.The medium is placed in a 30-liter enzymatic apparatus and sterilized at a pressure of 100 kPa for 30 minutes. Then, 750 ml of a 24-hour culture of Brevibactetium flavum ATCC 14 067 is introduced.

Očkovací materiál se připraví obdobně jako v příkladu 4.The seeding material was prepared analogously to Example 4.

Hlavní fermentace se provádí při teplotě 30 až 32 °C při počtu otáček míchadla 200 za minutu, za použití vzduchů v množství 1 m^{1 * 3}/ m³ prostředí při trvání fermentace 56 hodin. Během fermentace se udržuje hodnota pH prostředí čpavkovou vodou. Koncentrace kyseliny L-glutaminové v kulturní kapalině činí 49,2 gramů na litr, výtěžek aminokyselinyThe main fermentation is carried out at a temperature of 30 to 32 ° C at a stirrer speed of 200 rpm, using air at a rate of 1 m ^{3 * 3} / m ^{3 of} medium for a fermentation duration of 56 hours. During the fermentation, the pH of the medium is maintained with ammonia water. The concentration of L-glutamic acid in the culture liquid was 49.2 grams per liter, amino acid yield

49,2 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.49.2% by weight, based on the mixture of monosaccharides.

Příklad 6Example 6

Hydrolyzát, získaný jednostupňovou hydrolýzou směsi jehličnatého a listnatého dříví, který obsahuje 2,06 % hmotnostních hexózovýah a 0,54 % hmotnostního pentózových monosacharidů se neutralizuje na hodnotu pH 3,5, filtruje a filtrát se odpařuje ve vakuu při teplotě 65 °C až do dosažení koncentrace monosacharidů 9,55 % hmotnostních. Odpařená směs monosacharidů se oxiduje vzdušným-kyslíkem 30 minut při teplotě 45 °C v přítomnosti hydroxidu sodného. Vzniklá sraženina se odfiltruje. Po vyčištění se získá roztok směsi monosacharidů neobsahující furfurol, jak se stanoví plynovou chromatografickou analýzou. Množství hydroxymethýlfůrfurolu a lignohuminových látek ve vyčištěném roztoku činí 3,0 % hmotnostní, vztaženo na hmotnost monosacharidů. Jejich obsah se stanoví spektrofotometrickou analýzou před a po vyčištění. K vyčištěnému roztoku směsi monosacharidů, použitému v množství 12 litrů se přidá 450 g síranu amonného (NH₄)2SO₄, 7,5 g středního fosforečnanu draselného K₂HPO, 7,5 g kyselého fosforečnanu draselného KH₂PO₄ a 6 g heptahydrátu síranu hořečnatého MgSO₄.7H₂O a doplní vodou na 15 litrů. Připravené prostředí se vnese do enzymatického aparátu o objemu 30 litrů a steriluje za přetlaku 100 kPa po dobu 30 minut. Potom se vnese 750 ml 24 hodinové kultury Micrococcus glutamicus.The hydrolyzate obtained by single-stage hydrolysis of a mixture of coniferous and deciduous wood containing 2.06% by weight of hexose and 0.54% by weight of pentose monosaccharides is neutralized to pH 3.5, filtered and the filtrate is evaporated under vacuum at 65 ° C until achieving a monosaccharide concentration of 9.55% by weight. The evaporated monosaccharide mixture is oxidized by air-oxygen for 30 minutes at 45 ° C in the presence of sodium hydroxide. The resulting precipitate was filtered off. After purification, a solution of a furfurol-free monosaccharide mixture is obtained as determined by gas chromatography analysis. The amount of hydroxymethylfurfurol and the lignumumin species in the purified solution is 3.0% by weight based on the weight of the monosaccharides. Their content is determined by spectrophotometric analysis before and after purification. A purified solution of a mixture of monosaccharides used in an amount of 12 liters was added 450 g of ammonium sulfate (NH ₄₎ 2 SO _4, 7.5 g of potassium secondary phosphate, K ₂ HPO, 7.5 g of potassium dihydrogen phosphate KH ₂ PO ₄ and 6 gr MgSO ₄ .7H ₂ O and make up to 15 liters with water. The prepared medium is placed in a 30 liter enzymatic apparatus and sterilized under a positive pressure of 100 kPa for 30 minutes. Then, 750 ml of a 24 hour culture of Micrococcus glutamicus is introduced.

Očkovací materiál se připraví analogicky jako v příkladu 4. Jako producent se použije mikroorganismus Micrococcus glutamicus.The seeding material was prepared analogously to Example 4. The micro-organism Micrococcus glutamicus was used as the producer.

Hlavní fermentace se provádí při teplotě 28 až 30 °C při počtu otáček míchadla 200 za minutu, za použití vzduchu v množství 0,8 m³/ m³ prostředí při trvání fermentace 60 hodin, přičemž během fermentace se udržuje hodnota pH prostředí čpavkovou vodou. Koncentrace kyseliny L-glutaminové v kulturní kapalině činí 32,5 gramů na litr, výtěžek aminokyseliny 32,5 % hmotnostních, vztaženo na směs monosacharidů.The main fermentation is carried out at a temperature of 28 to 30 ° C at a stirrer speed of 200 rpm, using air at a rate of 0.8 m ³ / m ^{3 of} medium for a fermentation duration of 60 hours while maintaining the pH of the medium with ammonia water. The concentration of L-glutamic acid in the culture liquid was 32.5 grams per liter, the amino acid yield 32.5% by weight based on the monosaccharide mixture.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

1. A method for producing a submersible amino acid

fermentation of the microorganisms producing it in a nutrient-containing medium containing a carbon source, a nitrogen source and a mineral salt, characterized in that the carbon source used is a mixture of hexose and pentose monosaccharides obtained by percolating hydrolysis of furfurol-free cellulose-containing vegetable raw materials 1 to 3% by weight of hydroxymethylfurfurol and lignumuminous substances, based on the weight of monosaccharides, at a weight ratio of hexose to pentose monosaccharides of 52 to 98: 48 to 2.

2. A process according to claim 1, wherein a mixture of hexose and pentose monosaccharides from percolating coniferous or deciduous wood is obtained, wherein the ratio of hexose monosaccharides to pentose monosaccharides, expressed as% by weight, is 79 to 96.4: 21 to 3 , 6.