CS224345B1

CS224345B1 - A method of isolating monoclonal antibodies by electrodesorption in a DC electric field

Info

Publication number: CS224345B1
Application number: CS256782A
Authority: CS
Inventors: Zdenek Rndr Csc Prusik; Vaclav Rndr Kasicka; Frantisek Rndr Drsc Cle Franek; Vladimir Doc Ing Csc Kubanek
Original assignee: Zdenek Rndr Csc Prusik; Vaclav Rndr Kasicka; Franek Frantisek; Kubanek Vladimir
Priority date: 1982-04-09
Filing date: 1982-04-09
Publication date: 1984-01-16

Abstract

Vynález se týká způsobu isolace monoklonálních protilátek elektródesorpcí z imobilizováného antigenu ve stejnosměrném elektrickém poli.· Protilátky sloužící diagnostickým účelům se v některých případech mohou používat bez čištění, tj. jako séra případně jako ascitické tekutiny produkčních zvířat. Pro přesné imunochemické mikroanalysy, pro léčebné účely nebo pro účely isolace antigen- ních substancí pomocí imobilizováných protilátek je třeba vyrobit preparáty protilátek, v nichž je obsah balastních bílkovin potlačen na minimum. Potlačení obsahu balastních bílkovin v preparátech protilátek se dosud dosahuje několika způsoby. Nespecifickými metodami,jako je vysolování nebo chromatografie na DEAE- -celulose,se získává méně čistý imunoglobulin, v němž vedle žádané protilátky převažují imunoglobuliny jiné povahy. V takto získaných preparátech mohou být ve stopových množstvích přítomny proteolytické enzymy pocházející z výchozí tělní tekutiny;·těmito enzymy jsou protilátky během skladování postupně degradovány. Dále jsou používány způsoby založené na principu afinitní chromatografie. Imobilizovanou složkou může být např. stafylokokový protein A, na nějž se váží téměř všechny imunoglobuliny. Z afinitního sorbentů vytěsněný preparát je poměrně čistý imunoglobulin. Tento postup však nerozlišuje mezi aktivní protilátkou a nespecifickým imunoglobulinem. Aktivní protilátka ae účinně isoluje pomocí k ní příslušného komplementárního antigenu v imobilizované formě. Způáoby využívající imobilizovaných antigenů poskytují prepařáty zbavené všech příměsí a jsou vhodné jak pro náročné analytické účely,The invention relates to a method for isolating monoclonal antibodies by electrodesorption from an immobilized antigen in a direct electric field. Antibodies used for diagnostic purposes can in some cases be used without purification, i.e. as sera or ascitic fluids of production animals. For precise immunochemical microanalyses, for therapeutic purposes or for the purpose of isolating antigenic substances using immobilized antibodies, it is necessary to produce antibody preparations in which the content of ballast proteins is suppressed to a minimum. Suppression of the content of ballast proteins in antibody preparations has so far been achieved in several ways. Non-specific methods, such as salting out or chromatography on DEAE-cellulose, yield a less pure immunoglobulin in which, in addition to the desired antibody, immunoglobulins of a different nature predominate. Proteolytic enzymes originating from the starting body fluid may be present in trace amounts in the preparations obtained in this way; antibodies are gradually degraded by these enzymes during storage. Furthermore, methods based on the principle of affinity chromatography are used. The immobilized component can be, for example, staphylococcal protein A, to which almost all immunoglobulins bind. The preparation displaced from the affinity sorbent is a relatively pure immunoglobulin. However, this procedure does not distinguish between active antibody and non-specific immunoglobulin. Active antibody is effectively isolated using its corresponding complementary antigen in immobilized form. Methods using immobilized antigens provide preparations free from all impurities and are suitable for demanding analytical purposes,

Description

Vynález se týká způsobu isolace monoklonálních protilátek elektródesorpcí z imobilizováného antigenu ve stejnosměrném elektrickém poli.·The invention relates to a method of isolating monoclonal antibodies by electrodesorption from immobilized antigen in a direct electric field.

Protilátky sloužící diagnostickým účelům se v některých případech mohou používat bez čištění, tj. jako séra případně jako ascitické tekutiny produkčních zvířat. Pro přesné imunochemické mikroanalysy, pro léčebné účely nebo pro účely isolace antigenních substancí pomocí imobilizováných protilátek je třeba vyrobit preparáty protilátek, v nichž je obsah balastních bílkovin potlačen na minimum. Potlačení obsahu balastních bílkovin v preparátech protilátek se dosud dosahuje několika způsoby. Nespecifickými metodami,jako je vysolování nebo chromatografie na DEAE-celulose,se získává méně čistý imunoglobulin, v němž vedle žádané protilátky převažují imunoglobuliny jiné povahy. V takto získaných preparátech mohou být ve stopových množstvích přítomny proteolytické enzymy pocházející z výchozí tělní tekutiny;·těmito enzymy jsou protilátky během skladování postupně degradovány.Antibodies for diagnostic purposes may in some cases be used without purification, i.e. as sera or ascitic fluids in production animals. For accurate immunochemical microanalyses, for medical purposes, or for the isolation of antigenic substances using immobilized antibodies, antibody preparations in which the ballast protein content is reduced to a minimum are required. So far, the suppression of ballast proteins in antibody preparations has been achieved in several ways. By non-specific methods, such as salting-out or chromatography on DEAE-cellulose, less pure immunoglobulin is obtained in which immunoglobulins of a different nature predominate in addition to the antibody of interest. Proteolytic enzymes derived from the starting body fluid may be present in trace amounts in the preparations thus obtained, by which the antibodies are gradually degraded during storage.

Dále jsou používány způsoby založené na principu afinitní chromatografie. Imobilizovanou složkou může být např. stafylokokový protein A, na nějž se váží téměř všechny imunoglobuliny.Further, methods based on the principle of affinity chromatography are used. For example, the immobilized component may be staphylococcal protein A to which almost all immunoglobulins bind.

Z afinitního sorbentů vytěsněný preparát je poměrně čistý imunoglobulin. Tento postup však nerozlišuje mezi aktivní protilátkou a nespecifickým imunoglobulinem.The preparation displaced from the affinity sorbents is a relatively pure immunoglobulin. However, this procedure does not distinguish between the active antibody and non-specific immunoglobulin.

Aktivní protilátka ae účinně isoluje pomocí k ní příslušného komplementárního antigenu v imobilizované formě. Způáoby využívající imobilizovaných antigenů poskytují prepařáty zbavené všech příměsí a jsou vhodné jak pro náročné analytické účely,The active antibody ae is effectively isolated by means of its complementary antigen in immobilized form. Methods using immobilized antigens provide preparaids free of all impurities and are suitable for both demanding analytical purposes,

- 2 224 345 tak pro účely preparativní, kde jinak příměsi citelně snižují kapacitu sorbentu s zmobilizovanou protilátkouj a tím nepříznivě ovlivňují ekonomiku preparačního postupu. Adsorbovanou protilátku je třeba z zmobilizovaného antigenu uvolnit. Nejšetrnější způsob je vytěsnění protilátky nízkomolekulárním haptenem. Tento způsob se dá však použít pouze u protilátek proti syntetickým strukturám, kde lze hapten syntetizovat a nemá význam u protilátek nejčastěji připravovaných a v průmyslu používaných, tj. u protilátek proti přírodním antigenům. Kromě toho představuje odstraněni haptenu z vazebných míst protilátky další nezbytnou operaci.Thus, for preparative purposes, where the admixtures significantly reduce the capacity of the sorbent with the immobilized antibody, it adversely affects the economics of the preparation process. The adsorbed antibody should be released from the mobilized antigen. The most gentle method is to displace the antibody with a low molecular weight hapten. However, this method can only be applied to antibodies against synthetic structures where the hapten can be synthesized and is not of interest in the antibodies most commonly produced and used in industry, i.e. antibodies against natural antigens. In addition, removal of hapten from antibody binding sites is another necessary operation.

Obecně použitelné způsoby vytěsnění jsou: změna pH elučního pufru, změna iontové síly elučního pufru, změna teploty elučního pufru, přídavek chaotropních činidel nebo detergentů do elučního pufru, případně kombinace uvedených metod. Společnou nevýhodou užívaných způsobů uvolňování protilátek je, že po odstranění disociačního agens nebo po neutralizaci ztratí část protilátky rozpustnost, čímž dochází k citelným ztrátám, které mohou činit až 50 %.Generally applicable displacement methods are: changing the pH of the elution buffer, changing the ionic strength of the elution buffer, changing the temperature of the elution buffer, adding chaotropic agents or detergents to the elution buffer, or a combination thereof. A common disadvantage of the methods of releasing antibodies used is that upon removal of the dissociative agent or after neutralization, a portion of the antibody loses solubility, resulting in appreciable losses, which may be up to 50%.

Je znám též způsob elektrodesorpce protilátek z zmobilizovaného antigenu stejnosměrným elektrickým polem v homogenním elektrolytu. Elektrodesorpce nevyžaduje přídavku žádného disociačního agens a zpravidla se dá provést v nedenaturujících podmínkách. Nevýhodou tohoto postupu je pomalé uvolňování protilátek ve velmi zředěném stavu.There is also known a method of electrodesorption of antibodies from a mobilized antigen by a direct electric field in a homogeneous electrolyte. Electrodesorption does not require the addition of any dissociating agent and can generally be performed under non-denaturing conditions. A disadvantage of this procedure is the slow release of antibodies in a very dilute state.

Uvedené nevýhody dosud používaných způsobů odstraňuje způsob isolace monoklonálních protilátek podle tohoto vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom, že adsorbované protilátky na zmobilizovaném antigenu se desorbují v izotachoforetickém systému elektrolytů. Izotachoforetický systém elektrolytů se skládá z vedoucího elektrolytu, jenž obsahuje vedoucí ion s efektivní pohyblivostí vyšší_z než je efektivní pohyblivost protilátky, a protiion s ionogenní skupinou, jejíž pKa je v rozsahu 4,5 až 9,5 a z koncového elektrolytu, který obsahuje koncový ion s efektivní pohyblivostí nižší než je efektivní pohyblivost desorbované- proti- 3The disadvantages of the methods used hitherto are overcome by the method of isolating the monoclonal antibodies of the invention. Its essence is that adsorbed antibodies on the mobilized antigen are desorbed in the isotachophoretic electrolyte system. Isotachophoretic electrolyte system is made up of the electrolyte, which contains the leading ion with effective mobility is _greater than the effective mobility of the antibody, and the counterion of the ionic group whose pKa is in the range from 4.5 to 9.5 and the final electrolyte containing the ion end with an effective mobility lower than that of the desorbed-counter-3

224 34S lótiQ^ a libovolný protilon. Koncentrace vedoucího iontu je v rozmezí 0,001 až 0,05 molA a koncentrace koncového iontu 0,001 až 0,1 mol A* Adsorbované protilátky se z imobilizováného antigenu uvolňují do roztoku působením stejnosměrného elektrického pole intensity 5 až 500 V/cm v izotachoforetickém systému elektrolytů.224 34S 10 and any antibody. The lead ion concentration is in the range of 0.001 to 0.05 molA and the terminal ion concentration is 0.001 to 0.1 mol A * The adsorbed antibodies are released from the immobilized antigen into the solution by a DC electric field intensity of 5 to 500 V / cm in the isotachophoretic electrolyte system.

* Výhodou způsobu podle vynálezu je rychlé uvolňování protilá tek z imobilizováného antigenu v nedestruktivních a nedenaturujících podmínkách a možnost získání roztoků čistých protilátek v koncentracích až několika hmotnostních %, kde koncentraci desorbované protilátky lze řídit koncentrací vedoucího iontu ve vedoucím elektrolytu.The advantage of the method of the invention is the rapid release of antibodies from the immobilized antigen under non-destructive and non-denaturing conditions, and the possibility of obtaining pure antibody solutions at concentrations up to several weight%, where the desorbed antibody concentration can be controlled by the lead ion concentration in the lead electrolyte.

Vynález a jeho výhody jsou blíže vysvětleny pomocí dále uve děných příkladů jeho provedení.The invention and its advantages are explained in more detail by means of the following examples.

Příklad 1Example 1

Imunoglobulin získaný z myší ascitické tekutiny/obsahující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transferinu. preparativní zonovou elektroforesou ve škrobovém bloku při pH 8,6 v 50 mmolA diethylbarbituratovém pufru /diethylbarbiturót sodný - kyselina diethylbarbiturová/j byl rozpuštěn v 0,15 molA chloridu sodném na koncentraci 0,28 hmotnostních %. Odděleně. byl připraven vedoucí elektrolyt o pH 5,9 sestávající z 0,01 molA hydroxidu sodného a 0,0? molA kyseliny 2-/N-morfolino/ethansulfonové a koncový elektrolyt sestávající z 0,01 molA kyseliny 6-aminokapronové adjustované kyselinou chlorovodíkovou na pH. 5,2.0,5 ml roztoku imunoglobulinu bylo smíseno s 5 ml vedoucího elektrolytu a k výslednému roztoku bylo přidáno 100 mg afinitního sorbentu připraveného z 15 mg prasečího transferinu a 85 mg jemně granulovaného polyethylenglykoltereftalátu polymerací pomocí glutaraldehydu. Po 20 min. průběhu adsorpce protilátek za míchání byla tekutina odstraněna a afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl promyt 20 ml vedoucího elektrolytu. Promytý afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl umístěn na rozhraní mezi vedoucí elektrolyt a koncový elektrolyt. Na tento systém bylo zavedeno; stejnosměrné elektrické póly, anoda do koncového elektrolytu, katoda do vedoucího elektrolytu. De224 345Immunoglobulin derived from murine ascites fluid / containing a monoclonal antibody of IgG1 subclass against porcine transferrin. by preparative zone electrophoresis in a starch block at pH 8.6 in 50 mmolA of diethylbarbiturate buffer (sodium diethylbarbiturate-diethylbarbituric acid) was dissolved in 0.15 molA of sodium chloride to a concentration of 0.28% by weight. Separately. a lead electrolyte of pH 5.9 consisting of 0.01 M sodium hydroxide and 0.0? molA of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid and a terminal electrolyte consisting of 0.01 molA of 6-aminocaproic acid adjusted to pH by hydrochloric acid. 5.2.0.5 ml of the immunoglobulin solution was mixed with 5 ml of the lead electrolyte and to the resulting solution was added 100 mg of affinity sorbent prepared from 15 mg of porcine transferrin and 85 mg of finely granulated polyethylene glycol terephthalate by polymerization with glutaraldehyde. After 20 min. during the adsorption of the antibodies while stirring, the liquid was removed and the affinity sorbent with the adsorbed antibody was washed with 20 ml of the lead electrolyte. The washed affinity sorbent with the adsorbed antibody was placed at the interface between the lead electrolyte and the terminal electrolyte. This system has been introduced; DC electric poles, anode to the terminal electrolyte, cathode to the lead electrolyte. De224 345

- 4 sorpce probíhala při intensitě pole od 8 do 80 V/cm 60 min. při teplotě vrstvy sorbentu 2O$a25°C. Z prostoru mezi vrstvou sorbentu a katodou bylo získáno 25jul 1% roztoku protilátky o pH 5,3. Po zředění na 0,5 ml a úpravě pH na 7,0 zůstal roztok protilátky zce la čirý. Vazebná aktivita protilátky zůstala zachována, jak bylo ověřeno imunoprecipitačníni testem.- 4 sorption took place at a field strength of 8 to 80 V / cm for 60 min. at a sorbent layer temperature of 20 ° C and 25 ° C. 25 µl of a 1% antibody solution at pH 5.3 was obtained from the space between the sorbent layer and the cathode. After diluting to 0.5 ml and adjusting the pH to 7.0, the antibody solution remained clear. Antibody binding activity was retained as verified by immunoprecipitation assay.

Příklad 2.Example 2.

Imunoblobulin získaný z myší ascitické tekutiny^obsahující protilátku podtřídy IgGl proti prasečímu transferinu_fbyl rozpuštěn v 0,15 mo.1/1 chloridu sodném na koncentraci 0,28 hmotnostních %. Odděleně byl připraven vedoucí elektrolyt sestávající z 0,02 mol/1 hydroxidu sodného a 0,06 mol/1 kyseliny 2-/N-morfolino/ ethansulfonové a koncový elektrolyt sestávající z 0,02 mol/1 kyseliny 6-aminokapronové adjustované kyselinou chlorovodíkovou na pH 5,2. 0,5 ml roztoku imunoglobulinu bylo smíseno s 5 ml vedoucího elektrolytu a k výslednému roztoku bylo přidáno 100 mg afinitního sorbentu připraveného z 15 mg prasečího transferinu a 85 mg jemně granulovaného polyethylenglykoltereftalátu polymerací pomocí glutaraldehydu. Po 20 minutách průběhu adsorpce protilátek za míchání byla tekutina odstraněna a afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl promyt 20 ml vedoucího elektrolytu. Promytý afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl umístěn na rozhraní mezi vedoucí elektrolyt a koncový elektrolyt.Immunoblobulin obtained from murine ascites fluid containing the IgG1 anti-porcine transferrin _f antibody was dissolved in 0.15 molar / l sodium chloride to a concentration of 0.28% by weight. Separately, a lead electrolyte consisting of 0.02 mol / l sodium hydroxide and 0.06 mol / l 2- / N-morpholino / ethanesulfonic acid was prepared and a terminal electrolyte consisting of 0.02 mol / l 6-aminocaproic acid adjusted with hydrochloric acid to pH 5.2. 0.5 ml of the immunoglobulin solution was mixed with 5 ml of lead electrolyte and 100 mg of affinity sorbent prepared from 15 mg of porcine transferrin and 85 mg of finely granulated polyethylene glycol terephthalate by polymerization with glutaraldehyde was added to the resulting solution. After 20 minutes of adsorption of the antibodies while stirring, the liquid was removed and the affinity sorbent with the adsorbed antibody was washed with 20 ml of lead electrolyte. The washed affinity sorbent with the adsorbed antibody was placed at the interface between the lead electrolyte and the terminal electrolyte.

Na tento systém bylo zavedeno stejnosměrné elektrické pole, anoda do koncového elektrolytu, katoda do vedoucího elektrolytu. Desorpee probíhala při intenzitě pole 8flj^80 V/cm 60 minut při teploté vrstvy sorbentu 2O4Í25°G. Z prostoru mezi vrstvou sorbentu a katodou bylo získáno 25JU1 2% roztoku, protilátky o pH 5,0. Po zředění na 0,5 ml a úpravě pH na 7,0 zůstal roztok protilátky čirý. Vazebná aktivita protilátky zůstala zachována, jak bylo ověřeno imunoprecipitačním testem.A DC electric field, an anode to the terminal electrolyte, and a cathode to the lead electrolyte were introduced into this system. The desorption proceeded at a field strength of 8 µL 80 80 V / cm for 60 minutes at a sorbent layer temperature of 204 ° C. From the space between the sorbent layer and the cathode, 25 µL of a 2% antibody, pH 5.0 was obtained. After diluting to 0.5 ml and adjusting the pH to 7.0, the antibody solution remained clear. Antibody binding activity was retained as verified by immunoprecipitation assay.

Příklad 3Example 3

Imunoglobulin získaný z myší ascitické tekutinyjobsahující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti lidskému transferinu^byl rozpuštěn v 0,12 mol/1 chloridu sodném na koncentraci 1,0 hmotnostní %. Odděleně byl připraven vedoucí elektrolytImmunoglobulin obtained from murine ascites fluid containing a monoclonal antibody of subclass IgG1 against human transferrin was dissolved in 0.12 mol / l sodium chloride to a concentration of 1.0% by weight. Separately, a lead electrolyte was prepared

-5224 345 o pR 5,2 sestávající z 0,01 mol/1 hydroxidu draselného adjustovaného kyselinou octovou na žádané pR a koncový elektrolytsestávající z 0,01 mol/1 ^-alaninu adjustováného kyselinou octovou na pH 5,1. lOO^il roztoku imunoglobulinu bylo smíseno s 5 ml vedoucího elektrolytu a k výslednému roztoku bylo přidáno 100 mg «finitního sorbentu připraveného z 15 mg lidského transferinu a 85 mg jemně granulovaného polyethylenglykoltereftalátu polymerací pomocí glutaraldehydu. Po 15 min. průběhu adsorpce protilátek za míchání byla tekutina odstraněna a afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl promyt 15 ml vedoucího elektrolytu. Promytý afinitní sorbent s adsorbovanou protilátkou byl umístěn na rozhraní mezi vedoucí elektrolyt a koncový elektrolyt. Na tento systém bylo zavedeno stejnesměrné elektrické pole, anoda do koncového elektrolytu, katoda do vedoucího elektrolytu. Desorpce probíhala po dobu 40 minut při intensitě, pole ód 5 do 50 V/cm při teplotě vrstvy sorbentu 18|ř20^oC. Z prostoru mezi vrstvou sorbentu a katodou bylo získáno 25./11 1,2% roztoku protilátky o pH 5,0. Po zředění na 0,5 ml a úpravě pH ha 7,0 zůstal roztok protilátky zcela čirý. Vazebná aktivita protilátky zůstala zachována, jak bylo ověřeno imunoprecipitačním testem.-5224 345 o pR 5.2 consisting of 0.01 mol / l acetic acid adjusted potassium hydroxide to the desired pR and a terminal electrolyte consisting of 0.01 mol / l acetic acid adjusted to pH 5.1. 100 µl of the immunoglobulin solution was mixed with 5 ml of lead electrolyte, and 100 mg of finite sorbent prepared from 15 mg of human transferrin and 85 mg of finely granulated polyethylene glycol terephthalate by polymerization with glutaraldehyde was added to the resulting solution. After 15 min. during the adsorption of the antibodies with stirring, the liquid was removed and the affinity sorbent with the adsorbed antibody was washed with 15 ml of the lead electrolyte. The washed affinity sorbent with the adsorbed antibody was placed at the interface between the lead electrolyte and the terminal electrolyte. A DC electric field, an anode to the terminal electrolyte, and a cathode to the lead electrolyte were introduced into this system. The desorption was carried out for 40 minutes at an intensity, field 5 to 50 V / cm at a sorbent layer temperature of 18 ° C to 20 ^° C. 0. After diluting to 0.5 ml and adjusting the pH to 7.0, the antibody solution remained completely clear. Antibody binding activity was retained as verified by immunoprecipitation assay.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

224 34S

1. A method for the isolation of monoclonal antibodies by electrodesorption in a direct electric field, characterized in that against the substances adsorbed on the immobilized antigen they are desorbed in an isotachophoretic electrolyte system comprising a lead electrolyte containing a lead ion in an amount of 0.001 to 0.05 molA. than the effective mobility of the antibody, and the counterion of the ionic group whose _pKa is in the range from 4.5 to 9.5, and the final electrolyte which comprises an end ion in an amount of 0.001 to 0.1 piers, the effective mobility is lower than the effective mobility. desorbed antibodies, and any counterion.

Method according to claim 1, characterized in that the adsorbed anti-substances are desorbed from the antigen immobilized on electrolyte impermeable solid particles of the carrier, preferably on particles of polymers based on diols and dicarboxylic acids, for example polyethylene glycol terephthalate.