CS229893B1 - Analogy oxytocinu a vasopresinu s inhibičními účinky a způsob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Vynález se týká analogů oxytocinu a vasopresinu chemického vzorce I kde Pen značí zbytek penicilaminu, X značí atom vodíku nebo acetylovou skupinu, Y značí atom vodíku nebo metylovou skupinu, A značí zbytek iaoleucinu nebo fenyl- alaninu a B značí zbytek leuclnu nebo lysinu, e způsobu jejich výroby. Tyto anelogy se vyznačují tím, že mejí inhibiční (antagonistické) účinky vůči některým biologickým aktivitám neurohypo- fysérnich hormonů. Podstata způsobu výroby analogů oxytocinu a vasopresinu spočívá v tom, že se lineární peptidy vzorce II, kde Pen, X, Y, A β B mají stejný význam jako ve vzorci I, obsahující dvě sulfhydry- lová skupiny, oxidují za vzniku disulfido- vá vazby známým postupem.

Description

Předmětem vynálezu jsou analogy oxytocinu a vesopresinu a modifikovanými aminokyselinami v poloze 1 a eventuální 2 a způsob jejich výroby.

Jedná se o analogy, která mají inhibiSní účinek vůči některým biologickým aktivitám neurohypofyaérníeh hormonů.

Analogy oxytocinu, mající inhlbičnl účinek vůči biologickým aktivitám neurohypofysárních hormonů,mají značný význam jak při důkazu přítomnosti těchto hormonů v různých tělních tekutinách, tak i z hlediska potenciálního lékařského použití, tzn. při patologická nadprodukci těchto hormonů.

Dosud byly známy hlavně dva strukturní rysy, jejichž přítomnost v molekule oxytocinu vyvolává inhibičnl účinky: záměna hydroxylová skupiny tyrosinu v poloze 2 za skupinu metoxylovou (Beránková Z., Rychlík I., Joět K., Rudinger J., Šorm F.: Collection Czechoalov. Chám. Commun. 26. 2 673 /196)/), přičemž inhlbičnl účinek se dá prohloubit současnou acetylací alfe-amlnoskuplny cysteinu v poloze 1 (Joět K., Šorm F.: Collection Czechoalov. Chám. Commun. 36. 297 /1971/). Zavadaní 2 metylových skupin (Schulz H., du Vigneaud V.: J. Med. Chem. 2, 647 /1966/) či dvou etylů (Vevrek R. J., Ferger M. F., Allen 0. A., Hloh D. H., Blomquiat A. T., du Vigneaud V.: J. Med. Chám. 12, ¹²⁴ /1972/) nebo polymetylenováho řetězce (Nestor J. J., Ferger M. F., du Vigneaud V.: J. Med. Chem. J8, 284 /1975/), do beta polohy - beta-merkaptopropionové kyseliny do polohy 1 v kombinaci a alkylacl tyrosinu (Sawyer W. H., Grzonka Z., Manning M.: Mol. Cell. Endocrinol. 22. 117 /1981/) vytváří s těchto látek delěi typ účinných inhibitorů.

Zjistili jsme nyní, že i vzájemná kombinace strukturních obměn, jako je elkylace tyrosinu a zavedení dvou metylových skupin do beta polohy cysteinu v poloze 1 peptiekáho řetězce a případnou acetylací primární skupiny cysteinu dává vznik látkám a výraznými inhibičními účinky na působení oxytocinu či vesopresinu.

Podstatou vynálezu jsou nová analogy oxytocinu a vesopresinu obecného vzorce I . X-Pen-Tyr(Y)AA-Gln-Asn-Žy s-Pro-B-Gly-NHg (I) kde všechny aminokyseliny jaou L-řady. Pan značí zbytek penieilaminu (beta,beta-dimetylcysteinu), X značí atom vodíku nebo aéetylovou skupinu, Y značí atom vodíku nebo metylovou skupinu, A značí zbytek isoleudnu nebo fenylelaninu, B značí zbytek leueinu nebo lysinu, dále Tyr značí tyroeln, Gin značí glycin, Asn Aaparagln, Cya značí cystein, Pro prolín,

Gly glycin.

Podstatou' způsobu výroby nových analogů oxytocinu a vesopresinu vzorce I podle vynálezu je, že se lineární peptld vzorce II

Η H

I I

X-Pen-Tyr(YJ-A-Gln-Aan-Cys-Pro-B-Gly-NHg (II), kde Pan, X, Y, A a B mají stejný význam jako ve vzorci I, oxiduje za vzniku diaulfidová vazby známým způsobem.

Některé biologická účinky analogů oxytocinu a vesopresinu jaou uvedeny v tabulce I. Inhlbičnl účinky látek v testu ln vivo jsou vyjádřená v hodnotách pAg, což je záporný logaritmus molérní koncentrace Inhibitoru, která sníží odpověá 2X jednotek agonlsty tak, aby byla rovna odpovědi 1X jednotek v nepřítomnosti inhibitoru (Schild H. 0.: Brit. J. Fharmacol. 2, 189 /1974/; Dyckea D. F., Nestor J. J., Ferger M. F., du Vigneaud V.: J. Med. Chem. 17. 260 /1974/). V testu in vitro (děloha ln vitro) odpovídá hodnota pAg zápornému logaritmu inhlbičnl konstanty podle vztahu pA₂ = -log kde B je koncentrace Inhibitoru (Μ), Α^θ je koncentrace agonisty vedoucí k 50%ímeximélníau účinku a A₅₀B je koncentrace agonisty vedoucí k 50% maximálnímu účinku za přítomnosti inhibitoru B (Eggena P., Schwertz I. L., Valter R.: J. Gen. Physiol. 52. 465 /1968/).

T a b u 1 k a 1

X	Analog I Y A	B	Inhiblční aktivita (pA2)při stanovení účinku uterotonického presorlckého galaktogoglckého in vitro in vivo
CH-jCO	H	Ile	Leu	4,4	-	neúčinný	0,04®
H	ch3	Ile	Leu	8,0	6,9	7,2	6,8
CH3CO	ch3	Ue	Leu	5,4		6,4	0,45®
H	H	Phe	Lys	6,6	6,3	6,9	-
CH-jCO	H	Phe	Lys	5,5	6,3	neúčinný	neúčinný
H	ch3	Phe	Lys	8,1	6,9	7,4	6,8
ch3co	ch3	Phe	Lys			6,7	neúčinný

⁸ vlastní aktivita, m. j./mg

Způsob výroby analogů oxytoeinu se déle objasňuje v příkladech provedení.

Metody použitá v příkladech provedení:

Analýzy aminokyselin byly prováděny na automatickém přístroji (Vývojové dílny Československé akademie věd, typ 6020). Vzorky peptldů byly hydrolyzovény 6M-HC1 ve vakuu 150 Pa při 105 °C po dobu 20 hodin. Chromatografie v tenké vrstvě byla prováděna na slllkagelových deskách (Silufol, Kevalier) v systémech: 2-butanol - 98% kyselina mravenčí - voda (75:13,5:11,5; Sl), 2-butanol - 25% vodný amoniak - voda (85:7,5:7,5, S2), 1-butanol - kyselina octová - voda (4:1:1, S3) a 1-butanol - pyridin - kyselina octová - voda (15:10:3:6, S4) a metanol-chloroform-kyselina octové - voda (10:15:3:2, S6). Analytická elektroforéza byla prováděna na papíru Vhatman 3MM ve vlhké komůrce při potenciálovém spádu 20V/cm po dobu 1 hod v 1M kyselině octové (pH 2,4) a v pyridin-acetátovém pufru (pH 5,7). Látky byly detekovány ninhydrinem nebo chloreční metodou. Pro protiproudná roztřepávání byl použit eeloskleněný přístroj s možností posunů horní i spodní fáze.

Preiiaretivní beznosičová elektroforéza byla prováděna na dříve popsaném přístroji (Prusík Z., Sedlákové E., Barth T.: Hoppe-Seyler s Z. Physiol. Chem. 353. 1 .837 /1972/). Pro vysokovýkonnou kapalinovou chromatografli byl použit přístroj sestavený z komerčních částí a kolony plněné Separonem SI-C-18 (Laboratorní přístroje, Praha).

Příklad 1

Amid o-nltrobenzensulfenyl-O-terc.butyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-propyl-leucyl-glyeinu

K roztoku amidu isoleucyl-glutaminyl-eapareglnyl-S-benzyleysteinyl-propyl-leueyl-glycinu (1,27 g; Jošt K., Rudinger J., Šorm F.: Collection Czechoslov. Chem· Commun. 26. 2 496 /196,/) v dlmetylformemidu (25 ml) byl přidán N-hydroxysukcinimideater o-nitrobenzensulfenyl-O-terč.butyltyrosinu (0,56 g).

Po dvou dnech míchání byl přidán další podíl aktivního esteru (0,05 g) a v mícháni bylo pokračováno dalších 24 hodin. Dimetylformamid byl odpařen, odparek byl roztírán s petroláterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 0,1 M-H^SO., vodou, 0,25 M-NeHCOj a vodou. Bylo získáno 1,2 g (65 *) produktu o t. t. 225 až 229 °C, 0° (c 0,2, dimetylformemid). Rj, 0,51 (Sl), 0,36 (S2), 0,65 (S3), 0,74 (S4). Aminokyselinová analýza: Tyr 0,94,

Ile 0,94, Olu 1,03, Aap 1,06, Cys (Bzl) 0,95, Pro 0,95, Leu 1,08 Oly 1,04.

Pro C₅₇H₈₀N,₂0,₃S₂ . H₂O (1223):

vypočteno: 55,96 * C, 6,76 % H, 13,74 * N;

nalezeno: 55,97 % C, 6,57 % H, 13,70 % N.

Amid benzyloxykarbonyl-S-benzylpenicýlaminyl-tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-aaparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinu

K roztoku výše připraveného oktepeptidu (1,1 g) v dimetylformamidu (15 ml) byl přidán 2,05 M-HC1 v éteru (1 ml). Po 7 minutách stání byl hydrochlorid vysrážen éterem. E®¹^

Ej¹® 0,33; Ry 0,25 (Sl), 0,17 (S2), 0,24 (S3), 0,64 (S4). Hydrochlorid byl rozpuštěn v dimetylf ormamidu (10 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem ne hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH-papirek) a k roztoku byl přidán p-nltrofenylester benzyloxykarbonyl-S-benzylpenicilaminu (0,4 g) v dlmetylformemidu (3 ml). Po 2 dnech míchání byl přidán další podíl aktivního esteru (0,04 g) a v míchání bylo pokračováno další 3 dny.

Dimetylformemid byl odpařen a odparek byl roztírán s petroláterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 1 H-HC1, vodou, 0,25 M-NaHCO^ a vodou. Získané látka (0,77 g) byla rozpuštěna v kyselině trifluoroctové (77 ml). Po 1 hodině stáni při laboratorní teplotě byl k reakční směsi přidán toluen (77 ml) a roztok byl odpařen do sucha. Odparek byl roztírán s éterem, odfiltrován a vysušen v exikétoru nad PgO^ a KOH. Bylo získáno 0,7 g (57 *) produk tu. 0,5 g této látky bylo dále ve dvou částech po 0,25 g čištěno gelovou filtraci. Produkt byl izolován odpařením dlmetylformemidu a roztíráním odparku s éterem. Bylo získáno 0,27 g (54 *) produktu o t. t. 228 až 231 °C, [d]_D -42,1° (c 0,2, dimetylformemid). Rj. 0,54 (Sl), 0,33 (S2), 0,66 (S3), 0,77 (S4). Aminokyselinová analýza: Pen(Bzl) 0,96, Tyr 0,93, Xle 0,95, Olu 0,99, Aap 1,02, Cys(Bzl) 0,89, Pro 1,04, Leu 1,02, Oly 0,97.

Pro Cg₇H₉₀N,₂O,₄S₂ . Η_£Ο (1370):

vypočteno: 58,75 % C, 6,77 t> H, 12,27 % N;

nalezeno: 58,70*0, 6,53 % H, 12,33 * N.

Amid acetyl-S-benzylpenicileminyl-tyrosyl-lsoleucyl-gluteminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl -prolyl-leucyl-glycinu

K roztoku výše připraveného nonepeptidu (245 mg) v kyselině octové (2 ml) byl přidán 35* HBr v kyselině octové (2 ml). Po 15 minutách stání při laboratorní teplotě byl hydrobromid vysréžen éterem. E®¹^ 0,51; Rj, 0,42 (Sl), 0,09 (S2), 0,43 (S3), 0,62 (S4). Hydro-, bromid byl rozpuštěn v dlmetylformemidu (2,5 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidán 5-chlor-8-hydroxychinolinylester kyseliny octové (106 mg). Po 2 dnech míchání byl přidán další podíl aktivního éteru (20 mg) a v míchání bylo pokračováno ještě 24 hodin. Dimetylformamid byl odpařen, odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 1 M-HC1, vodou, 0,25 M-NaHCO^ a vodou. Bylo získáno ,85 mg (70 %) produktu, který byl déle čištěn gelovou filtrací. Bylo získáno 151 mg (82 %, celkový výtěžek 57 %) produktu o t. t. 226 až 231 °C, [a]_D -39,7° (c 0,1, dimetylformamid). R_p 0,49 (SI), 0,24 (S2), 0,58 (S3), 0,73 (S4).

Pro C₆₁Hg₆N,₂O₁₃S₂ . 0,5H₂O (1269):

vypočteno: 57,76 %C, 6,91 ϊ H, 13,25 % N; nelezeno: 57,73 % C, 6,89 % H, 13,57 % H.

N°-Acetyl [l-penieilamin] oxytoein

Chráněný nonepeptid popsaný výše (138 mg) byl rozpuštěn ve vroucím kapalném amoniaku (150 ml) a redukován sodíkem do modrého zbarvení reakční směsi stálého po 10 sekund. Roztok byl odbarven chloridem amonným a amoniak byl odlyofilizovén. Odparek byl rozpuštěn v 0,01 M-HC1 (100 ml), zředěn vodou na celkový objem 300 ml a pH roztoku bylo upraveno 0,01 M-NeOH na 7,0. Oxidace byla provedena 3,3 . 10^-2 M-K₃[Fe(CN)g], který byl přidáván do žlutavého zbarvení reakční směsi stálého po 1 hodinu. Během oxidace bylo pH reakční směsi udržováno v rozmezí 6,9 až 7,0.

Reakční směs byla okyselena 1 M-HC1 ne pH 4,1 a nanesena na kolonu plněnou slabě bazickým anexem v chloridovém cyklu (50 ml). Kolona byla promyta vodou (50 ml) a spojené eluáty byly odsoleny na koloně plněné Seperonem SI-C-18. Po promytí kolony vodou byl produkt vymyt 90% metanolem. Eluát byl okyselen kyselinou octovou na pH 4,5 a metanol byl odpařen. Po lyofilizaci bylo získáno 72 mg produktu. 35 mg tohoto produktu bylo čištěno vysokotlakou kapalinovou chromátografií (metenol-voda /4:6/). Bylo získáno 11 mg produktu. [a]jj -47,0 °C (c 0,18, 3 M kyselina octové). R_p 0,64 (S4), 0,76 (S6). Aminokyselinové anelýze: PeníOýDt +Cys(O₃H) (2,00), Tyr 0,97 ( 0,66), Ile 1,00 0,00), Glu 0,97 (1,00), Asp 0,97 (1,00),

Pro 1,03 (0,77), Leu 1,06 (1,00), Oly 1,00 (1,00). (V závorkách jsou uvédeny hodnoty pro vzorek oxidovaný kyselinou permravenčí).

Pro Ο₄₇Ηγ₂Ν,₂Ο₎₃3₂ . 2CH₂C00H. 6H₂O (1305):

vypočteno: 46,92 % C, 7,10 % H, 12,87 % N;

nelezeno: 46,87 % C, 6,72 % H, 12,81 % H.

Příkled 2

Amid terč. butyloxykerbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-eapereginyl-S-benzylcysteinyl -prolyl-leucyl-glycinu

Výše popsený heptapeptid (2,1 g) byl rozpuštěn v dimetylformamidu (50 ml) a k roztoku byl přidán 2,4,5-trichlorfenylester terc.butyloxykarbonyl-O-metyltyroeinu (1,1 g). Po dvou dnech mícháni byl přidán delší podíl aktivního esteru (0,2 g) e v míchání bylo pokračováno do druhého dne. Simetyldiformamid byl odpařen, odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 5% kyselinou citrónovou, vodou, 0,25 M-NeHCO₃ a vodou. Bylo získáno 1,9 g {67 St) produktu o t. t. 225 až 228 °C, -35,2° (e 0,2 dimetylformamid).

R_p 0,50 (SIb 0,32 (32), 0,59 (S3), 0,72 (S4). Aminokyselinová analýze: Tyr(0Me + Tyr 0,93, Ile 0,96, Glu 0,99, Asp 1,01, Cys(Bzl) 1,03, Pro 1,02, Leu 1,04, Gly 1,00.

v

Pro C₅₃H₇₉N,,O,₃S . 0,5H₂O (1119):

vypočteno: 56,87 % C, 7,20 % H, 13,76 % N;

nelezeno: 56,62 % C, 7,10 % H, 13,73%»·

Amid benzyloxykerbony1-S-benzylpenicilaminyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asperaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glyeinu

K roztoku výěe připraveného oktepeptidu (1,5 g) v kyselině octové (15 ml) byl přidán 35% HBr v kyselině octové (15 ml). Po 5 minutách při laboratorní teplotě byl hydrpbromid vysrážen éterem. 0,57, E^ 0,27; R_p 0,23 (S1), 0,20 (S2), 0,34 (S3), 0,59 (S4). Hydrobromid byl rozpuštěn v dimetylformamidu (15 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidán p-nitrofenylester benzyl óxykarbonyl-S-benzylpenicilaminu (0,7 g) v dimetylformamidu (4 ml). Po 4 dnech míchání byl dimetylformamid odpařen, odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 1 M-HC1, vodou, 0,25 ll-NaHCO^ a vodou. Bylo získáno 1,0 g (54 %) produktu, který byl dále ve čtyřech částech po 0,25 g či Stěn Bélovou filtrací.

Bylo získáno 0,59 g (59 %, celkový výtěžek 32 %) produktu o t. t. 233 až 239 °C, [«]_D -40,2 (c 0,2, dimetylformamid). R_p 0,54 (S1), 0,33 (S2), 0,66 (S3), 0,76 (S4). Aminokyselinová anelýza: Pen(Bzl) 0,87, Tyr(OMe) + Tyr 0,87, Ile 0,94, Glu 0,99, Aap 1,04,

Cys(Bzl) 0,88, Pro 1<p04, Leu 1,04, Gly 0,99.
C68H92N12° 14S2 ' H2°	(1384):
vypočteno:	59,03 % C,	6,85 % h,	, 12,15 % N;
nalezeno:	59,05 % C,	6,79 % H,	, 12,26 % li.

[l-Penicilamin, 2-O-metyltyrosiň] oxytocin

Chráněný nonapeptld popsaný výše (238 mg) byl rozpuštěn ve vroucím kapalném amoniaku (250 ml) a redukován sodíkem do modrého zbarvení reakční směei stálého po 30 sekund. Roztok byl odbarven chloridem amonným, amoniak byl odlyofilizován a odparek byl rozpuštěn v 0,01 M-HC1 (100 ml). Roztok byl zředěn vodou na celkový objem 500 ml, pH roztoku bylo upraveno 0,1 M-NaOH na hodnotu 7,0. Oxidace byla provedena 3,3 . 10~² lMC₃[Pe(CH)g], který byl přidáván do žlutého zbarvení reakční směei stálého po 1 hodinu. Během oxidace bylo pH reekční směsi udržováno v rozmezí 6,9 až 7,0. Roztok byl okyselen 1 1Í-HC1 na pH 4,5 e nanesen na kolonu plněnou slabě bázickým anexem v chloridovém cyklu. Kolona byla promyta vodou (50 ml) a eluáty byly lyofilizovány. Látka byla čiětěne kontinuální beznosičovou elektroforězou. Bylo získáno 23,1 mg produktu. [α]·ρ 0° (o 0,14, 3-M kyselina octová). E^4 EÍ?¹® o,23. Ry 0,62 (S4), 0,56 (S6). Aminokyselinová analýza:Pen(0^í) + CysťO-jH) 2,09, Tyř(OMe) + Tyr 0,95 (0,82), Xle 0,96 (0,93), Glu 1,02 (1,02), Asp 1,00 (1,02), Pro 0,98 (1,02), Leu 1,02 (1,00), Gly 1,00 (1,00).(V závorkách jsou uvedeny hodnoty pro vzorek oxidovaný kyselinou permravenčí,)

Pro ^c45H₇₂N₎₂O₁₂S₂ . 0,5CH₃COOH . 2,5H₂0 (1124):

vypočteno: 50,21 % C, 7,08 % H, 14,95 * Kj nalezeno: 50,30 % C, 6,72 % H, 14,94 % N.

Příklad 3

Amid acatyl-S-benzylpenicilaminyl-O-metyltyrosyl-lsoleucyl-glntaminyl-asparaginyl-S-benzyleystelnyl-prolyl-leueyl-glycinu

K roztoku nonapeptidu (190 mg) v kyselině octově (2 ml) byl přidén 35% HBr v kyselině octové (2 ml). Po 10 minutách stání při laboratorní teplotě byl hydrobromid vysréžen éterem. Εθ¹* 0,50; Rj, 0,47 (S1), 0,28 (S2), 0,44 (S3), 0,63 (S4). Hydrobromid byl rozpuštěn v dimetylformamidu (5 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem ne hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) e k roztoku byl přidén 5-chlor-8-hydroxychlnolinylester kyseliny octové (39 mg). Po dvou dnech míchání byl přidén dalěí podíl aktivního esteru a v míchání bylo pokračováno další dva dny. Dimetylformamid byl odpařen, odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 1 M-HC1, vodou, 0,25 H-NeHCO^ a vodou. Bylo získáno 140 mg (79 %) produktu, který byl dále čiětěn gelovou filtrací. Bylo získáno 97 mg produktu o t. t. 234 až 238 °C, [_a]_D -47,2° (o 0,1, dimetylformamid). Rj. 0,49 (S1), 0,27 (S2), 0,55 (S3), 0,73.(S4).

Pro ^c62^H88^H12^S2 ’ ^2H2° (¹^¹⁰) vypočteno: 56,86 % C, 7,08 % H, 12,83 % N;

nelezeno: 56,61 % C, 6,84 % H, 12,76 % N.

N “ -Acetyl[l -penicilamin, 2-O-metýltyrosin] oxytocin

Chráněný nonapeptid výše popsaný (87 mg) byl rozpuštěn ve vroucím kapalném amoniaku (100 ml) a redukován sodíkem do modrého zbarvení reakční směsi stálého po 10 sekund. Roztok byl odbarven chloridem amonným a amoniak byl odlyofilizován. Odparek byl rozpuětěn v 0,01 U HC1 (100 ml). Roztok byl zředěn na celkový objem 400 ml. Oxidace byla provedena

3,3.10^-2lí-Kj[Fe(CN)g], který byl přidáván do žlutého zbarvení reakční směsi stálého po dobu 1 hodiny.

Roztok byl okyselen 1 li-HCl ne pH 4,5 a nanesen ne kolonu plněnou slabě bázickým enexem v chloridovém cyklu (50 ml). Kolona byla propláchnuta vodou (50 ml) a eluáty byly lyofilizovény. Látka byla déle čištěné protiproudým roztřepáváním v systému eek.butanol-0,05% vodná kyselina octové (1:1). Po 100 posunech horní a 100 posunech ápodiií fáze byla látka z trubic 44 až 56 izolována a déle čištěna gelovou filtrací. Bylo získáno 7,1 mg produktu o -67,0° (c 0,10, 3 M kyselina octové); Rp 0,64 (S4), 0,83 (S6). Aminokyselinové analýza: Pen(OjH) + + Cys(O^J) (2,05), Tyr(ííe) + Tyr 0,98 ( 0,35), Ile 0,98 (1,00), Clu 1,05 (1,03), Asp 1,00 (1,10), Pro 0,96 (0,95), Leu 1,00 (1,00), Gly 1,00 (1,00). (V závorkách jsou uvedeny hodnoty pro vzorek oxidovaný kyselinou permravenči.)

Pro C₄₈H₇₄N,₂O,₃S₂ . 6H₂0 (1199):

vypočteno: 48,07 « C, 7,23 % H, 14,01 % N;

nelezeno: 48,09 %C, 7,34 % H, 1«,23 % N.

Příklad 4

Amid o-nitrobenzensulfenylasperaginyl-S-benzyleysteinyl-prolyl-N^-p-toluensulfonyllysyl-glycinu

Amid S-benzylcysteinyl-prolyl-H^£-p-toluensulfonyllysyl-glycinu (14,0 g) byl rozpuětěn v dimetylformamidu (70 ml) a pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek). K roztoku byl přidán 2,4,5-trichlorfenylester o-nitrobenzensulfenylasparaginu (11,0 g) e směs byla míchána při laboratorní teplotě.

Po 24 hodinách byl přidán další podíl aktivního esteru (1,0 g) a v míchání bylo pokračováno dalších 24 hod. Dioetylformamid byl odpařen a odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 0,1 M-HgSO^, vodou, 0,25 M-NaHCO^ a vodou. Bylo získáno 15,1 g (76%) produktu o t. t. 175 až 179 ®C, [«]]) -62,1° (c 0,2, diaetylformamld).

Rp 0,55 (Sl), 0,39 (S2), 0,60 (S3), 0,69 (S4. Aminokyselinové analýza: Asp 0,97,

Cys(Bzl) 0,98, Pro 1,03, Oly 1,01.

*r° θ₄0^Η51^Ν9^Ο1Ο^δ3 vypočteno: 52,65 %C, 5,62 % H, 13,79 % N;

nelezeno: 52,23 %C, 5,54 % H, 13,70 % N.

Amid o-nitrobenzensulfenylgluteminyl-aspareginyl-S-benzyl-cysteinyl-prolyl-N ^E-p-toluensulfonyllysyl-glycinu

K roztoku výše připravené létky (14,0 g) v dlmetylformamidu (50 ml) byl přidán 2,26 M-HC1 v éteru (14,2 ml). Po 7 minutách stání byl hydrochlorid sražen éterem e přesréžen éterem z roztoku v dlmetylformamidu. Bylo získáno 12,3 g hydrochloridu.

0,76, E^¹® 0,42. Rp 0,23 (S1), 0,21 (S2), 0,21 (S3), 0,64 (S4). Hydrochlorid byl rozpuštěn v dlmetylformamidu (50 ml), pH roztoku bylo N-etylpiperidinem upraveno ne hodnotu 7,5 ež 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidán 2,4,5-trichlorfenylester o-nitrobenzensulfenylgluteminu (7,9 g). Po 24 hodinách mícháni byl přidán další podíl aktivního esteru (0,8 g). Po dalších 24 hod byl dlmetylformamld odpařen, odparek byl roztírán s petroléterem e éterem, odfiltrován a promyt vodou, 0,1 M-HgSO^, vodou, 0,25 M-NaHCO^ a vodou.

Bylo získáno 10,5 g (65 %) produktu o t. t. 187 až 192 °C, [_a]_D -43,0° (c 0,2, dimetylformamid). Rp 0,38 (S1), 0,24 (S2), 0,49 (S3), 0,69 (S4). Aminokyselinová analýza: Glu 1,08, Asp 1,07, Cys(Bzl) 0,72, Pro 1,01, Gly 1,06.

Pro C^H^NpO^S-j . HgO (1060):

vypočteno: 50,98 % C, 5,80 » H, 14,53 % N;

nelezeno: 50,79 % C, 5,74 » H, 14,61 % N.

Amid o-nitrobenzensulfenylfenylalsnyl-glutaminyl-aspereginyl-S-benzylcystelnyl-prolyl-N^f:-p-toluensulfonyllysyl-glycinu

K roztoku výěe připravené létky (10 g) v dimetylformemidu (50 ml) byl přidán 2,26 M-HC1 v éteru (8,9 ml). Po 7 minutách stání byl hydrochlorid sražen éterem a několikrát rozetřen s éterem. Bylo získáno 7,9 g hydrochloridu. Eg^ 0,70, E^·® 0,40. Rp 0,09 (Sl), 0,10 (S2), 0,09 (S3), 0,55 (S4). Hydrochlorid byl rozpuštěn v dimetylformemidu (40 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidán 2,4,5-trichlorfenylester o-nitrobenzensulfenylfenylelaninu (4,6 g). Po 24 hodinách míchání byl přidán další podíl aktivního esteru (1,0 g) a v míchání bylo pokračováno delších 24 hod.

Dimetylformamid byl odpařen a odparek byl roztírán s éterem a petroléterem, odfiltrován a promyt vodou, 0,1 M-HgSO^ vodou, 0,25 Μ-ΝβΗΟΟ^,β vodou. Bylo získáno 8,5 g (74 %) produktu o t. t. 206 ež 209 °C, [aJ_D -24,0° (c 0,2, dimetylformamid).

Rp 0,53 (Sl), 0,29 (S2), 0,58 (S3), 0,72 (S4). Aminokyselinové anslýza: Phe 1,05, Glu 1,05, Asp 1,03, Cys(Bzl) 0,83, Pro 1,03, Gly 1,01.

Pro ^C54^H68^N12°1 3^S3

5H₂O (1198):

vypočteno: 54,12 % C, nalezeno: 54,02 % C,

5,80 % H, 14,02 % N; 5,64 % H, 14,32 % N.

Amid o-nitrobenzensulfenyl-O-terc.butyltyrosyl-fenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N¹-p-toluensulfonyllysyl-glycinu

K roztoku výše popsaného hept8peptidu (2,4 g) v dlmetylformamidu (100 ml) byl přidén 2,05 M-HC1 v éteru (5,1 ml). Po 7 minutách stání byl hydrochlorid vysréžen éterem. 0,63,

0,37. Rp 0,18 (S1), 0,18 (S2), 0,17 (S3), 0,63 (S4). Hydrochlorid byl rozpuštěn v dimetylformamidu (50 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) e k roztoku byl přidén N-hydroxysukcinimidester o-nitrobenzensulfenyl-O-terc.butyltyrosinu (1,1 g). Po 24 hodinách míchání byl přidén další podíl aktivního esteru (0,2 g) a v míchání bylo pokračováno do druhého dne.

Dimetylformamid byl odpařen, odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 0,1 M HgSO., vodou, 0,25 M-NaHCO^ a vodou. Bylo získáno 2,5 g (88 %) produktu o t. t. 193 až 197 °C [<J_D -21,1° (c 0,2, dimetylformamid). Hp 0,58 (S1), 0,34 (S2),

0,63 (S3), 0,77 (S4). Aminokyselinová anslýzs: Tyr 0,97, Phe 1,02, Glu 1,05, Asp 0,97,

Cys(Bzl) 0,85, Pro 1,06, Gly 1,01.

Pro ^c67^85^13®15®3 · ^H2° <’⁴²7>^: vypočteno: 56,41 % C, 6,18 % H, 12,76 % N;

nalezeno: 56,24 % C, 6,03 % H, 12,94 « N.

Amid benzyloxykarbonyl-S-benzylpenicilinaminyl-tyrosyl-fenylalenyl-glutaminyl-esparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N ^ε-p-toluensulf onyllysyl-glycinu

Z oktepeptidu (1,5 g) byl připraven hydrochlorid postupem, který byl popsán výše (použito 1,1 ml 2,05 M-HC1 v éteru). Hydrochlorid byl rozpuštěn v dlmetylformamidu (10 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidén p-nltrofenylester benzyloxykarbonyl-S-benzylpenicilamiůu (0,5 g) v dlmetylformémidu (4 ml). Po dvou dneeh míchání byl přidén další podíl aktivního esteru (0,05 g) v dlmetylformamidu (1 ml) a v mícháni bylo pokračováno další dva dny. Bimetylformamid byl odpařen a odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou,

M-HC1, vodou, 0,25 M-NaHCO^ a vodou. Získaný produkt (1,2 g) byl rozpuštěn v trifluoroctové kyselině (120 ml) a ponechán stát 1 hodinu při laboratorní teplotě.

K roztoku byl přidán toluen (120 ml) a směs byla odpařena ve vakuu. Po rozetřeni odparku s éterem bylo získáno 1,1 g (66 %) produktu:1,0 g tohoto produktu bylo déle ve čtyřech částech po 0,25 g čištěno gelovou filtraci. Bylo získáno 438 mg (58 %) produktu o t. t. 136 až 141 °C, fa]_D -31,2° (c 0,1 dimetylformamid). Rp 0,56 (S1), 0,30 (S2), 0,68 (S3), 0,71 (S4). Aminokyselinová analýze: Pen(Bzl) 0,88, Tyr 0,87, Phe 1,05, Glu 1,01, Asp 0,99, Cys (Bzl) 0,88 Pro 0,99, Gly 1,01.

Pro C₇₇H₉₅N₁₃O,₆Sj . H₂O (1573):

vypočteno: 58,80*0, 6,22 % H, 11,58 % N;

nelezeno: 58,83 * C, 6,10 % H, 11,76 % N.

[i -Pěni cilamln, 8-ly sin] ve s opře sin

Chráněný peptid (144 mg) byl rozpuštěn ve vroucím kapalném amoniaku (150 ml) a redukován sodíkem do modrého zbarvení reakční směsi stálého po 20 sekund. Reakční směs byla odbarvena chloridem amonným a amoniak byl odlyofilizovén. Lyofillzét byl rozpuštěn v 0,01 M-HC1 (50 ml), roztok byl zředěn vodou ne objem 400 ml a vytřepén éterem. Zbytky byly z roztoku odstraněny ve vakuu. Oxidace byla provedena 3,3· 10“²M-K₃DFe(CN)g] , který byl přidáván do žlutého zbarvení stálého po dobu 1 hodiny; pH reakční směsi bylo udržováno v rozmezí 6,9 až 7,0 pomocí 0,1 M-NeOH.

Po oxidaci byla reakění směs okyselena kyselinou octovou na pH 3,5 a roztek byl chromá tograf ován na koloně plněné karboxylétovým katexem (30 ml, 100 až 200 mesh). Po promytí kolony 0,25% kyselinou octovou byl produkt vytěsněn 50% kyselinou octovou a lyofilizovén. Získaný lyofillzét (71 mg) byl déle člětěn beznosičovou elektroforézou. Bylo získáno 13,5 mg produktu o -12,1° (c 0,14i 3 M kyselina octové). E^¹® 0,63, E^⁸ 0,61. Rj, 0,32 (S4),

0,03 (Só). Aminokyselinové analýza: PaníO^H) + Cys(OjH) (1,94), Tyr 0,97 (0,58), Phe _s1,01 (0,96), Olu 1,05 (1,03), Asp 1,04 (1,03), Pro 0,99 (0,93), Oly 1,03 (1,00). V závorkách jsou uvedeny hodnoty pro vzorek oxidovaný kyselinou permravenčí.

Pro ^C4e^H69^N,3®12®2 ' 3>5CH₃COOH . 6,5 H₂O (1412):

vypočteno: 46,80 % C, 6,85 % H, 12,90 % N.

nelezeno: 46,61 % C, 6,06 % H, 12,82 % N.

Příklad 5

Amid acetyl-S-banzylpenicllaminyl-tyroeyl-fenylalanyl-gluteminyl-aapereginyl-S-benzyleyateinyl-prolyl-N^E-p-toluensulfonyllysýl-glycinu

Výše popsaný chráněný nonapeptid (200 g) byl rozpuštěn v kyselině octové (2 ml) a k roztoku byl přidán 35% HBr v kyselině octové (2 ml). Po 10 minutách stání při laboratorní teplotě byl hydrobromid vysréžen éterem. E®¹^ 0,53, Rp 0,55 (SI), 0,16 (S2), 0,54 (S3), 0,62 (S4). Hydrobromid byl rozpuštěn v dimetylformamidu (5 ml). pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidlnem na hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidán 5-chlor-8-hydroxychlnolylester kyseliny octové (56 mg). Po 2 dnech míchání byl přidán další podíl aktivního esteru a v mlchéní bylo pokračováno další dva dny.

Dimetylformamid byl odpařen, odparek byl roztírán s éterem a petroléterem, odfiltrován a promyt vodou,'1 H-HC1, vodou, 0,25 M-NeHCO^, vodou; bylo získáno 126 mg (76%) produktu o t. t. 136 až 140 °C. Mq -7,9° (c 0,1, dimetylformamid). R_p 0,54 (SI), 0,24 (S2), 0,60 <S3), 0,72 (S4).

Pro C71H9,N,3O,5S3 . 4H20 (1S35):
vypočteno: 55>56 % C, 6,50 % H,	11,86% N;
nalezeno: 55,38 % C, 6,02 % H,	11,83% N.

Nfl-Acetyltl-penicilamin, 8-lysin]vasoprasin

Chráněný nonapeptid (105 mg) byl rozpuštěn ve vroucím kapalném amoniaku (100 ml) a redukován sodíkem do modrého zbarvení reakční smšsi stélého po dobu 10 sekund. Roztok byl odbarven chloridem amonným a amoniak byl odlyofilizovén. Lyofillzét byl rozpuštěn v 0,01 M-HC1 (100 ml), zředěn vodou ne objem 400 ml a vytřepén éterem. Zbytky éteru byly z roztoku odstraněny ve vakuu. Oxidace byle provedena 3,3.10^-2M-K₃[Pe(CN)gl, který byl přldévén do žlutého zbarvení roztoku stálého po dobu 1 hodiny; pH bylo udržováno v rozmezí 6,9 ež 7,0 pomocí 0,1 M-NaOH. Po oxidaci byla reakční směs okyselena kyselinou octovou na pH 3,5 a chromátografována na koloně plněné karboxylétovým katexem (20 ml, 100 až 200 mesh).

Kolona byla promyta 0,25% kyselinou octovou a produkt byl vytěsněn 50% kyselinou octovou. Po lyofilizaci bylo získáno 59 mg produktu, který byl déle čištěn beznosičovou elektro11 forézou. Bylo získáno 14,8 mg produktu o [a]j) -51,0° (c 0,14, 3 M kyselina octové). Eg¹^ ®»51,

0,38. Rj. 0,40 (S4), 0,26 (S6). Aminokyselinové analýza: PenCO^H) + CysCO^H), (1,88),

Tyř 0,94 (0,61), Phe 0,96 (1,02), Glu 1,05 (1,00), Asp 1,12 (1,00),iTro 1,21 (1,00), Lys 0,96 (0,98), Gly 1,02 (0,95). (V závorkách jsou uvedeny hodnoty pro vzorek oxidovaný kyselinou permravenčí.)

Pro . 2CH₃COOH . 4,5 HgO (1328):

vypočteno: 48,86 % C, 6,68 » H, 13,72 % N;

nelezeno: 48,80 % C, 5,94 % H, 13,76 % N.

Amid terč.butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-fsnylelenyl-glutaminyl-sepereginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N^E-p-toluensulfonyllysyl-glycinu

Z heptapeptidu (2,4 g) byl připraven hydrochlorid postupem užitým dříve (bylo použito 5,1 ml 2,05 M-HC1 v éteru). Hydrochlorid byl rozpuštěn v dimetylformemldu (50 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem ne hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) e k roztoku byl přidán 2,4,5-trichlorfenylester terč.butyloxyksrbonyl-O-metyltyrosinu (1,0 g).

Po 24 hodinách míchání byl přidán delší podíl aktivního esteru (0,2 g) a v míchání bylo pokračováno dalších 24 hodin. Dimetylformamid byl odpařen a odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 10% kyselinou citrónovou, vodou,

0,25 M-NaHC0₃ a vodou. Bylo získáno 2,2 g (84 %) produktu o t. t. 196 až 200 °C, -21,6° (c 0,2, dimetylformamid). Rj, 0,55 (SI), 0,25 (S2), 0,46 (S3), 0,66 (S4). Aminokyselinové analýza: Tyr+Tyr(OMe) 0,92, Phe 0,98, Glu 1,00, Asp 1,00, Cys(Bzl) 0,82, Pro 1,05, Gly 1,00.

^C63^He4^N12°15^S2 · ²>⁵ «2° <1359):

vypočteno: 55,70 % C, 6,60 % H, 12,37 % N;

nelezeno: §5,54 % C, 6,22 % H, 12,43 % N.

Amid benzyloxykarbonyl-S-benzylpenicilamihyl-O-metyltyrosyl-fenylalenyl-gluteminyl-asperaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N ^c-p-toluensulfonyllysyl-glycinu

Z výše popsaného oktapeptidu (1,35 g) rozpuštěného v kyselině octové (10 ml) byl připraven hydrobromid běžným způsobem (bylo použito 5 ml 35% HBr v kyselině octové). Hydrobromid byl rozpuštěn v dimetylformemidu (10 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidán p-nitrofenylester benzyloxykarbonyl-S-benzylpenicilaminu (0,51 g) v dimetylformemidu (2 ml).

Po dvou dnech míchání byl přidán delší podíl ektivního esteru (0,25 g) v dimetylformamidu (2 ml) a v míchání bylo pokračováno další 2 dny. Dimetylformamid byl odpařen, odparek byl roztírán s petroléterem a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 1 M-HC1, vodou, 0,25 U-NaHC0₃ e vodou. Bylo získáno 1,2 g produktu (74 %). 0,75 g této látky bylo dále ve třech částech po 0,25 g čištěno gelovou filtrací. Bylo získáno 361 mg (49 %) produktu o t. t. 202 až 205 °C Wd “³⁴>⁶° <^{c 0}>’, dimetylformamid). R_p 0,60 (SI), 0,31 (S2), 0,68 (S3), 0,76 (S4). Aminokyselinové analýze: Pen(Bzl) 1,04, Tyr+Tyr(Me) 0,94, Phe 1,03, Glu 1,00, Asp 0,99, Cys(Bzl)

	0,92; Pro 1	,00, Gly 1	1 ,00.
	PrO ΟγθΗ^γΝ	13°16S3 *	1,5	H2O (1596):
	vypočteno:	58,70 %	c,	6,31 % H,	11,41 » N;
	nelezeno:	58,65 %	c,	6,25 % H,	11,57 % N.

[i-Pěnicilamin, 2-0-metyltyrosin, 8-lysin]vasopreein

Vý6e popsaný nonapeptid (145 mg) byl rozpuštěn ve vroucím kapalném amoniaku (150 ml) a redukován sodíkem do modrého zbarvení stálého po 10 sekund. Roztok byl odbarven chloridem amonným a amoniak byl odlyofillzovén. Lyofilizét byl rozpuštěn v 0,01 M-HCl (100 ml), zředěn vodou ne celkový objem 450 ml a roztok byl vytřepén éterem. Zbytky éteru byly odstraněny odpařením ve vakuu.

Oxidace byla provedena 3,3 . 10”2M-K₃[Fe(CN)g], který byl přidáván do Slutého zbarvení reekční saěsi, stálého po 1 hodinu. Během oxidace bylo pH reakčni směsi udržováno pomocí 0,1 M-NaOH na hodnotě 6,9 až 7,0. Po oxidaci byl roztok okyselen kyselinou octovou na pH 4,0 a chromatografovén na koloně plněné karboxylétovým ketexem (20 ml, 100 až 200 mesh).

Kolona byla promyta 0,25 % kyselinou octovou, produkt byl vytěsněn 50% kyselinou octovou a lyofilizovén. Bylo zlekéno 86 mg lyofllizétu, který byl déle čiětěn beznosičovou elektroforézou. Bylo získáno 10,3 mg produktu β [«Jp 0° (c 0,15, 3 M kyselina octové).

eÍJ¹® 0,63, Egl* 0,60. R_p 0,34 (S4), 0,05 (S6). Aminokyselinové analýza: PeníOýi) + + Cye(O^H) (1,94), Íyr+Tyr(OMe) 0,94(0,82), Phe 1,06 (1,04), Glu 0,96 (1,00), Asp 1,06 (1,00), Pro 1,00 (0,99)> Lys 0,97 (1,04), Oly 1,00 (0,99). (V závorkách jsou uvedeny hodnoty pro vzorek oxldpvený kyselinou permravenčl).

Pro C^H^N^O,^ . 3CH₃COOH . 5 HgO (1369):

vypočteno: 48,27 % C, 6,85 % H, 13,30 % N;

nalezeno: 48,30 % C, 6,27 % H, 13,42 % N.

Příklad 7 .*

Amid ecetyl-S-benzylpenicilerainyl-O-metyltyrosyl-fenylelanyl-gluteminyl-esperaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-N^c-p-toluensulfonyllysyl-glycinu

Výše popsaný chráněný nonapeptid (200 mg) byl rozpuštěn v kyselině octové (2 ml) a k roz toku byl přidán 35% HBr v kyselině octové (2 ml). Po 10 minutách stání při laboratorní teplotě byl hydrobromid vyaréžen éterem. 0,49, Rp 0,07 (S2), 0,63 (S4). Hydrohromid byl rozpuštěn v dimetylformamldu (2 ml), pH roztoku bylo upraveno N-etylpiperidinem na hodnotu 7,5 až 8,0 (navlhčený pH papírek) a k roztoku byl přidén 5-chlor-8-hydroxyehinolinylester kyseliny octové (43 mg).

Po 2 dnech míchání byl přidén další podíl aktivního esteru (15 mg) e v míchéní bylo pokračováno další dva dny. Dimetylfarmamid byl odpařen e odparek byl roztírán s petroléterea a éterem, odfiltrován a promyt vodou, 1 M-HCl, vodou, 0,25 M-NaHCO^ e vodou. Bylo získáno 142 mg (74 %) produktu, který byl déle čištěn gelovou filtrací. Bylo získéno 109 mg produktu o t. t. 190 ež 195 °C, -31,2° (c 0,1, dlmetylformemid). R_p 0,56 (S1), 0,26 (S2),

0,59 (S3), 0,74 (S4).

Pro C₇₂H₉₃N₁₃O,₅S₃ . 2,5 HgO (1522):

vypočteno: 56,83 % C, 6,49 % H, 11,96 % N;

nalezeno: 56,50 % C, 6,30 % H, 11,99 % N.

N^a-Aoetyl[l-penicilemin, 2,0-metyltyrosin, 8-lysin]vasopresin

Chráněný nonapeptid výěe popsaný (92 mg) byl rozpuštěn ve vroucím kapalném amoniaku (150 ml) a redukován sodíkem do modrého zbarvení reekční směsi stálého po dobu 10 sekund. Roztok byl odbarven chloridem amonným e emoniek byl odlyofillzovén. Lyofilizét byl rozpuštěn v 0,01 M-HCl (100 ml), zředěn vodou ne objem 450 ml e vytřepén éterem.

Zbytky éteru byly z roztoku odstraněny odpařením ve vakuu. Oxidace byla provedena 3,3.10~^zM-K₃tFe(CN)₆], který byl přidáván do žlutého zbarvení reakční směsi stálého po dobu 1 hodiny. Během oxidace bylo pH reakční směsi udržováno pomocí 0,1 M.NaOH v rozmezí 6,9 až 7,0. Po oxidaci byl roztok okyselen kyselinou octovou na pH 4,0 a chromatografován na koloně plněné karboxylátovým katexem (25 ml, ,00 až 200 mesh). Kolona byle promyta 0,25% kyselinou octovou;' produkt byl vytěsněn 50% kyselinou octovou a roztok byl lyofilizován. Bylo získáno 60 mg lyofilizótu.

Po jeho vyčistění beznosičovou elektroforézou bylo získáno 2,4 mg produktu o [aJjj -32,8° (c 0,13, 3 M kyselina octové). Εθ¹^ 0,51, 0,35. E_p 0,43 (S4), 0,39 (S6). Aminokyselinové analýza; Pen(O₃H) + CysíO-jH) (1,96), lyr+Tyr(OMe) 0,96 (0,69), Phe 1,04 (0,99),

Glu 1,01 (1,00), Asp 1,03 (1,00), Pro 1,03 (0,97), Lys 0,95 (0,98), Gly 1,03 (1,01).

Pro . 6CH₃COOH . 7H₂O (1628):

vypočteno: 46,51 % C, 6,88 % H, 11,19 % Nj nelezeno: 46,40 % C, 6,43 % H, 11,08 % N.

Claims (2)

1. Analogy oxytocinu a vasopresinu vzorce I

X-^en-Tyr(Y)-A-Gln-Asn-éys-Pro-B-Gly-NH₂ (I) kde věechny aminokyseliny jsou L-řady, Pen značí zbytek penicilaminu, X značí atom vodíku nebo acetylovou skupinu, Y značí atom vodíku nebo metylovou skupinu, A značí zbytek isoleucinu nebo fenylalaninu a B značí zbytek leucinu nebo lysinu.

2. Způsob výroby nových analogů oxytocinu a vasopresinu vzorce X, vyznačený tím, že se lineární peptid vzorce II,

Η H

X-Pen-Tyr(Y)-A-Gln-Asn-éys-Pro-B-Gly-NH₂ (II) kde Pen, X, Y, A a B mají stejný význam, jako ve vzorci I, oxiduje za vzniku disulfidové vazby známým způsobem.