CS230888B1 - Sposob produkcie 3-mananázy pomocou mikroskopických húb rodu Lemonniera - Google Patents

Abstract

Spůsob produkcie /3-1,4-manán manánohydrolázy pomocou mikroskopických húb rodu Lemonniera. Vynález sa týká oboru mikfóbiológie, chémie a biochémie sacharidov a ochrany životného prostredia. Účelom vynálezu Je získanie /3-1,4-manánu manánohydrolázy (^-mananázy FC 3.2.1,78) schopnej hydrolyticky štěpit ,0-1,4-manán a /1-mananázové zložky hemicelulóz. Uvedeného účinku sa dosiahne pomocou mikroskopických húb zo skupiny vodných plesní rodu Lemonniera, a to Lemonniera aquatica, Lemonniera centrosphaera, Lemonniera cornuta a Lemonniera terrestris kultivovaných na vhodných živných půdách. ι/3-mananázu možno získat o poměrně vysokej špecifickej aktivitě (okolo 10 nkat/mg proteinu) a schopnosti štěpit nielen čistý 0-1,4-manán ale aj 0-manánový podiel hemicelulóz. Vynález má využitie v technickej mikrobiologii, biochemii sacharidov a všade tam, kde ide o jednoduchá metódu spracovania dřevného odpadu.

Description

Vynález sa týká sposobu produkcie enzýmu /3-1,4-mari.án manánohydroíázy (/S-mananáza, EC 3.2.1.78) pomocou mikroskopických húh rodu Lemonniera kultivovaných na vhodných živných podach.

Produkcia enzýmu já-mananázy je zatial' popisovaná zriedkavo, aj keď je známe, že niektoré mikroorganizmy majú schopnost tento enzým produkovat. Tak například β-mananázová zložka je obsiahnutá aj v komplexnom hemicelulázovom enzýmovom systéme, produkovanom mikroskopickými hubami rodu Rhizopus (produkt firmy Sigma), Aspergillus niger [Yamazaki, N, Sinner M, Dietrichs Η. H.: Holzforschung (1976 30, 101) baktériami Xanthomonas campestris (Dekker, R. F. H, Canda, G. P.: Arch. Microbiol. (1979 122, 297), resp. slizovkou Physarum polycephalum (Fr. patent 2385 730)].

Schopnost produkovat tento enzým je však podstatné rozšírenejšia než by zodpovedalo malému počtu publikácií obmedzujúcich sa na niekofko mikroorganizmov. Pomocou gélovej. metody (A.O. č. 186 059) testovania mikroorganizmov na polysácharid hydrolázy posobiace endomechanizmom v priebehu kultivácie zistili sme výraznú produkciu ,/2-mananázovej aktivity u vodných hyfomycet rodu Lemooniera.

Rod Lemonniera patří do čelade Moniliaceae rodu Moniliales, triedy Deuteromycetes. Zástupcovia tohto rodu patria. medzi vodné hyfomycetý.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že kulti-

váciou nasledovných štyroch Lemonniera, a to:	kmeňov	rodu
Lemonniera aquatica	CCMF -	- 124
Lemonniera centrosphaera	CCMF -	- 149
Lemonniera cornuta	CCMF -	- 325
Lemonniera terrestris	CCMF -	- 125

jednotlivo alebo ich zmesi na živnej půdě obsahujúcej čistý ,/3-1,4-manán, alebo jeho nerozpustný derivát připravený v reakcii sieťovania s 2-chlórmetyloxiránom alebo hemicelulózovú zmes polysacharidov obsahujúcich /3-1,4-manán pri teplote 15 až 25 °C a pH 5,0 až 6,0, s výhodou pH 5,5 po dobu 96 až 144 hodin produkuje enzým jS-mananázu, ktorý sa získá v surovom stave odpařením rastovej pody, připadne v zuštachtenom stave zrážaním síranom amonným alebo organickými rozpúšťadlami, s výhodou etanolu a acetonu.

K ďalšej purifikácii surového enzýmu β-mananázy po dialýze možno použiť afinitnú metodu za použitia sletovaného manánu (ex Phytelephas macrocarpe) ako afinitného ligandu.

Výhodou nového postupu je predovšetkým to, že příprava β-mananázy je velmi jednoduchá a ako súčasť kultivačnej pody možno použiť aj neprečistené nativně substráty typu galaktománov l'ahko dostupné ako rožne druhy polnohospodárskeho a dřevného odpadu. Ďalšou výhodou je poměrně vysoký výťažok jS-mananázovej aktivity, a to aj pri nižších fermentačných teplotách (20 °C). Nakotko uvedené kmene rodu Lemonniera produkují popři ,β-níananázovej aktivitě aj ďalšie hemicelulázové a celulolytické enzými, ako aj enzými schopné oxidatívne degradovat lignin, možno použiť tieto kmene aj ku komplexnej utilizácii drevnej hmoty ovšem v podmienkách optimálnych pre ich rozmnožovanie.

Příklad 1

Lemonniera aquatica CCMF-124, Lemonniera centrosphaera CCMF-149, Lemonniera cornuta CCMF-325, Lemonniera terrestris CCMF-125 sa pomnožia na rastovej pode obsahujúcej 1,6 gélu (připraveného sletováním /3-1,4-manánu rastlinnej slonoviny (Phytelaphas macrocarpe A. O. č. 186 059] ponořeného do polovice výšky do Yeast Nitrogen Base rastovej pody (0,6 g/100 ml]] o pH 5,5 a kultivuje sa na povrchu po dobu 3 dní pri teplote 20 °C, kedy dochádza k stekuteniu gélu. Nahromaděná biomasa druhov Lemonniera sa použije ako zmesné inokulum pody obsahujúcej 20 g kukuřičného výluhu, 5 g /3-1,4-manánu (pH 6,0] na 1 liter vody a kultivácia prebieha ďalšie 3 dni pri teplote 20 °C. Potom sa biomasa Lemonniera odfiltruje a surový enzým /3-mananáza sa získá odpařením kultivačnej půdy na vákouvej odparke (celková aktivita /?-mananázy 52 nkat, o špecifickej aktivitě 8,6 nkat/mg proteinu). Příklad 2 . Ako inokulum sa použije kmen Lemonniera aquatica CGMF-124. Na množenie sa použije podá obsahujúca 1,6 g gélu sletovaného /?-l,4*manánu (A. O. č. 186 059] ponořeného do polovice výšky do' Yaest Nitrogen Base rastovej pody (0,6 g/100 ml) o pH 5 a kultivuje sa po dobu 2 dní pri teplote 15 °C, kedy dochádza k stekuteniu gélu. Nahromaděná biomasa Lemonniera aquatica sa použije ako inokulum pédy obsahujúcej kukuřičný extrakt (20 g] a 5 g galaktomanánu z guaru (Cyamoqsis tetragonoloba L., Fam. Leguminosae] na 1 liter vody (pH 5,5) a kultivácie prebieha ďalšie 2 dni pri teplote 20 °C. Potom sa biomasa Lemonniera aquastica odfiltruje a enzým /3-mananáza sa získá v čiastočne zuštachtenom stave zrážaním so síranom amonným (stupeň saturácie 0,65). Celková aktivita /3-mananázy 65 nkat o špecifickej aktivitě 9,2 nkat/mg proteinu. Příklad 3

Tak ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že namiesto Lemonniera aquatica sa použije kmeň Lemonniera terrestris CCMF-125. Kultivácia prebieha po dobu 3 dní na rastovej pode s kukuřičným výluhom a β-manánom (pH 5,5, teplota 20 °C). Celková

S aktivita /J-mananázy bola 58 nkat o špecifickej aktivitě 10,2 nkat na 1 mg proteinu.

Vynález má použitie v základnom mikrobiologickom a biochemickom výskume a pri produkcii /2-mananázy ako jedného z důležitých enzýmov pri sacharifikácii polysacharidov roznych dřevných odpadov. Vynález možno použit aj pri úpravě vod obsahujúcich ako odpad extrahovatelnej zložky drevnej hmoty.

Claims (1)

1. PREDMET vynalezu

   Spůsob produkcie /S-mananázy pomocou mikroskopických húb rodu Lemonniera, vyznačený tým, že kultivujú následovně kmene rodu Lemonniera:

   Lemonniera aquatica Lemonniera centrosphaera Lemonniera cornuta Lemonniera terrestris

   CCMF — 124 CCMF — 149 CCMF — 325 CCMF — 125 jednotlivo, alebo ich zmesi na živnej pode obsahujúcej /2-1,4-manán alebo syntetický derivát /3-1,4-manánu pri teplote 15 až 25 °C a pH 5,0 až 6,0 po dobu 120 až 144 hodin a enzým ,/3-mananáza sa získá v surovom stave odpařením rastovej půdy, připadne v zušlachtilom stave zrážaním síranom amonným alebo organickými rozpúšťadlami, s výhodou etalonem alebo acetónom.