CS236992B1 - Způsob purifikace povrchového antigenu hepatitidy B - Google Patents

Abstract

Vynález se týká výroby standartního imunizačního antigenu hepatitidy B (HBaAg), určeného k přípravě imunoreagencii pro průkaz HBs- antigenu a anti- HBs protilátek citlivými metodami 3.generace, popřípadě k jiným účelům, jako je příprava různých typů vakcin k sérové žloutence, monoklonálních protilátek k determinantám HBaAg aj. Technologie izolace a purifikace HRsAg je koncipována od zpracování výchozí suroviny /plazmy, séra) přes přípravu hrubě petrifikovaného koncentrátu až k přípravě a provedení finální purifikace. Postup zabezpečuje vysokou výtěžnost a zachovává antigenicitu HBsAg. Velká joéče je věnována zajištění bezpečnosti práce s virulentním materiálem. V následných purifikačních krocích jsou . selektivně odstraňovány infekční viriony v. a purifikační postup je možno provádět v uzavřených systémech.

Description

Vynález se týká přípravy standardního purifikátu povrchového antigenu hepatitidy B /HBsAg/, určeného k imunizaci a přípravě imunoreagencií pro průkaz HBs- antigenu a a^ti- HBs protilátek citlivými metodami třetí generace, popřípadě k jiným účelům, jako je příprava různých typů vakcin k hepatitidě B, monoklonálních protilátek a biochemickým a imunochemickým studiím.

Pro výrobu standardního imunizačního materiálů HBsAg se používá jako výchozí surovina lidské sérum nebo konvertovaná plazma nosičů HBsAg vybraných převážně ze záchytů transfuzní služby, nebo kultivační medium produkčních linií tkáňových kultur.

Biochemická hodnota výchozích materiálů pro purifikaci HBsAg je určována titrem HBsAg v protisměrné imunoelektroforéze, který je minimálně 1 :4 a vyššíjnebo stanovením koncentrace HBsAg v radiální imunodifuzi, která musí být minimálně 0,05 mg HBsAg v 1ml.

Purifikáty HBsAg nejvyšší parciální čistoty a přitom nejméně denaturované, pokud se týká antigenních vlastností, jsou získávány různými precipitačními, centrifugačními, příp. chromátografickými metodami. Vzhledem ke komplexnímu složení výchozí suroviny, lze dosáhnout žádanou kvalitu purifikátu HBsAg pouze kombinovanou technologií uvedených metod, třebaže se nám nabízí využití jednoduchého principu afinitní chromátografie. Využití afinitní chromatografie v provozních podmínkách by bylo příliš náročné a neekonomické.

V námi navrženém purifikačním postupu je brán zřetel na proměnlivé

238 882 složeni výchozí suroviny, především plazmy nebo séra získaných od nosičů HBsAg. Počítáme s proměnlivým zastoupením imunokomplexů a heterogenním profilem vysokomolekulárních a lipidických složek plazmy nebo séra· Uvedené komponenty mohou svými fyzikálně -chemickými vlastnostmi významně interferovat s chováním HBsAg a ovlivňovat tak účinnost purifikačního postupu·

Technologie, izolace a purifikace HBsAg je koncipována od zpracování výchozí suroviny přes přípravu hrubě purifikovaného koncentrátu získaného pomocí polyethylenglykolů až k provedení finální purifikace pomocí hustotní a rychlostní frakcionace. Navrženým postupem lze dosáhnout morfologicky homogenního ,. imunochemicky čistého, imunogeriního a vysoce koncentrovaného purifikátu HBsAg·

Postup zabezpečuje 15 a 25% výtěžnost, plně zachovává antigenicitu HBsAg,. protože denaturační desintegracé částic je omezena na minimum. Velkou péči jsme též věnovali zajištění bezpečnosti práce s tímto, virulentním materiálem, kde poteciálně infekční virióny jsou selektivně odstraňovány během purifikace jako složky balsstních frakcí. Postupně dojde k jejich úplnému odstranění, a to při nezměněné výtěžnosti žádaného produktu, kterým je neinfekční HBsAg.

Pracovní postup se skládá z následujících etap:

-defibrinogenace HBsAg pozitivní plazmy rekalcifikací za přítomnosti trombinu s následným oddělením vytvořeného fibrinu centrifugací.

Při použití séra defibrinogenace samozřejmě odpadá.

- opracování supernatantu pólyethylenglykolem 6000, který je přidán

- 3 23β 982 do konečné koncentrace 4 až 7 objemových procent, s výhodou 5,5 objemových procent, za pH 6,8 až 7,4, s výhodou pH= 7,0. V tomto kroku je z výchozí suroviny odstraněna větší část vysokomolékulárních složek,, včetně infekčních virionů a imunokomplexů. Uvedené nežádoucí složky jsou součástí precipitátu, který je odstraněn centrifugaci# Dále zpracováváme supernatant, který dosytíme přidáním polyethylenglykolu na finální koncentraci 6 až 15 objemových procent, s výhodou 7,9 objemových procent, a pH upravíme na hodnotu 3,5 až 6,5, s výhodou pH=4,5· Po centrifugaci této směsi je HBsAg přítomen v sedimentu a dochází tak k jeho koncentrování. Hlavní součástí supernatantu jsou nízkomolekulární bílkoviny, především albumin.

delipidace a hustotní frakcionace v prostředí chloridu česného o hustotě 1,2 až 1,35 g/crn^ je nejéfektivnější etapou purifikačního postupu a je v ní dosaženo nejvyšší purifikační účinnosti. Vysoká efektiř^vosti hustotní frakcionace je dosaženo aplikací roztoku H3sAg, kterým podvrstvujeme gradient chloridu česného. Působením gravitačního pole centrifugy tak dochází k oddělení HBsAg od rezidua balastních bílkovin flotací. HBsAg putuje v oblasti vysoké hustoty proti směru působení odstředivá síly a balastní bílkoviny, které «mají podstatně vyšší hustotu putují směrem opačným. Pro přípravu gradientu chloridu česného můžeme použít kryogenní způsob, který je též součástí předkládaného vynálezu.

rychlostní frakcionace v sacharozovém médiu je posledním purifikačním stupněm, ve kterém dosahujeme konečného odstranění balastních složek na základě rozdílných sedimentačních konstant.

Vysoká výtěžnost navrhovaného purifikačního postupu a dosažená

- 4 238 992 čistota produktu, to je povrchového antigenu hepatitidy B /HBsAg/ je během purifikace zabezpečována průběžnou analýzou frakcí jak na obsah HBsAg, tak sérových bílkovin metodou jednoduché radiální imunodifuze. Frakce, které nevyhovují čistotou a obsahují HBsAg, jsou použity pro refrekcioneci.

VyužitíR výrobního postupu podle vynálezu je vyřešen základní problém výroby purifikovaného, imunogenního antigenu HBsAg, nezbytného pro přípravu avidních a specifických protilátek ·

Získaná antiséra jsou svou aviditou vhodná pro využití v enzymoimunoenalýze nebo radioimunoanalýze. Jsou vhodná pro konjugaci s křenovou peroxidázou i pro značení radioaktivním jodem ze účelem detekce HBsAg, event. protilátek anti-HBsAg metodami třetí generace.

Purifikovaný HBsAg se může stát rovněž východiskem při případném vývoji různých typů vakcin proti hepatitidě B nebo jiným účelům, například k přípravě mondklonálních protilátek nebo imunochemickým a biochemickým analýzám.

Příklad provedení

Purifikační postup je rozdělen na pět stupňů o deseti pracovních ^rocích. Materiály od jednotlivých dárců - s výhodou až do kroku

3.2 včetně - jsou zpracovávány separátně, aby nedocházelo k rušivým interakcím bílkovinného materiálu získaného od různých dárců. Od kroku 3.3. je výhodné semipurifikáty z jednotlivých výchozích plazem či sér zpracovávat společně.

- 5 OJ

Výchozí surovina

238 992

K purifikaei HBsAg z lidské plazmy nebo séra nosičů HBsAg, musí být titr HBsAg v protisměrné imunoelektroforéze minimálně 1:4, případně v radioimunostanovení alespoň 0,05 mgťvlml.

Defibrinogenace HBsAg -pozitivní plazmy

1.1. Ke 100 ml plazmy jsou přidány 4ml jednomolárního chloridů vápeR natého a 1ml roztoku srážedla Topostazinu / 70 N.I.H./ml/ -trombinu. Po 30 minutách inkubace při 37°C'je směs uchovávána 16 hodin při +4°C. Po následující centrifugaci / Janetzki K 60, 5.000 ot/min., 60 minut, +4°C/ je lále zpracováván pouze supernatant.

Diferenciální precipitace polyethylenglykolem 6000 /PEG 6000/

2.1. Ke 100 ml supernatantu 1.1. je za stálého míchání přidáno 37,93ml 20% nich objemových procent roztoku pólyethylenglykolu 6000 v destilované vodě, takže vznikne v séru koncentrace 5,5 objemových procent póly ethylenglykolu 6000, pH směsi je neutrální.

Směs je míchána 60 minut při laboratorní teplotě a potom ponechána přes noc v klidu při +4°C.

Po následující centrifugaci za stejných podmínek jako u kroku 1.1. je dále zpracováván supernatant označený *PEG A”.

.2. Ke 1OOml supernatantu 2.1. PEG A” je za míchání pozvolna přidáno 20 ml roztoku póly ethylenglykolu 6000 v destilované vodě, o koncentraci 20 objemových procent. Dojde tak k dosycení na koncentraci

- 6 238 99^

7,9 objemových procent polyethylenglykolu 6000. Po dokonalém promíchání obou složek je přidáním 4 N kyseliny octové sníženo pH na hodnotu 4,5 / průměrná spotřeba kyseliny octové je 1 ,4'ml na 100 ml objemu výchozí plazmy/. Směs je dále ještě míchána 60 minut pří laboratorní teplotě a potom ponechána v klidu 16 hodin při +4°C.

Po následující centrifugaci za stejných podmínek jako u kroku

1.1. je dále zpracováván pouze sediment, který je resuspendován v pufru 0,01 M trihydroximetylámínomětan/TRIS/, 0,15 M chlorid sodný, 0,001 M kyseliny etylendiaminote^áoctové, pH 7,2 /pufr TENa/ do 1/50 výchozího objemu suroviny a dialyzovón při pokojové teplotě proti destilované vodě / 2 krát vyměněný objem destilované vody je shodný s objemem výchozí plazmy nebo séra/.

Po následující centrifugaci /Janetzki K 27,7000 ot/min, 90 minut, +4°C/ je zpracováván supernatant, který je možno spojit s vodným proplachem sedimentu / k dosažení vyšší výtěžnosti/.

Získaný supernatant je do dalšího zpracování uložen při -20°C a je oznaěen PEG B.

Delipidace a frakcionace v hustotním gradientu chloridu česného /CsCl/ .1 . Κ 260 ml supermatsntu 2.2. PEG B je přidáno 110 g pevného chloridu česného/ vznikne 288 ml roztoku/. Po rozpuštění je materiál rozplněn 8 krát po 36 ml do centrifugačních zkumevek úhlového rotoru Befcman typ:42.1. a k doplnění objemu centrifugy je převrstven vodou/ 3ml/.

- 7 238 992

Po následující centrifugaci /25 000 ot/min,+10°C, 60 minut/ je z každá kyvety odebrán pouze čirý , delipidóvaný supernatant, který je použit pro následující přípravu gradientu chloridu ces. náho.

3.2. Delipidóvaný supernatant z bodu 3.1. je rozplněn po 28ml do osmi zatavovacích kyvet vertikálního rotoru Beckman typ:VTi 50 a protilehlé dvojice jsou pečlivě vyváženy.

Následuje kryogenní příprava gradientu chloridu česného in šitu”: centrifugační kyvety s rozplněným roztokem jsou uloženy ve vertikální poloze na 24 hodin při -20°C. Před centrifugaci jsou kyvety přeneseny na 16 hodin dó +1O°C, kdy volným rozmražením vznikne gradient chloridu česného.

Vytvořený gradient je převrstvením doplněn do konečného objemu kyvety /39ml/ roztokem chloridu eésného v pufru TENa/ složení stejné jako v kroku 2.2./ o 24 H^eKu^iifckprocentech chloridu česného. Po zatavení kyvet je materiál připraven pro hustotní frakcionaci při 35 000 ot/min,+1 0°C, 8 hodin ve vertikálním rotoru Beckman typ: VTi 50.

Po skončení centrifugace je od vrcholu centrifugační zkumavky odebráni roztok až do hustoty 1,25 g/cnA, obsahující HBsAg,označen ”CsCl A.

Materiál o vyšší hustotě obsahuje většinu nežádoucích sérových • bílkovin a není dále zpracováván.

3.3. Do centrifugačních kyvet rotoru Beckman typ: SW 40 je připraveno po 1 © ml lineárního gradientu chloridu česného v pufru TENa /složení shodné jako u kroku 2.2*/, 8 až 32 procentcHondu cssného.

238 982

- 3 Takto připravený gradient je podvrstven 3 ml aktdvní frakce

CsCl A” z kroku 3.2., zahuštěné na jednu pětinu získaného objemu a předem doupravené přidáním pevného chloridu česného na hustotu ,32 g/cm\

Vzorky jsou centrifugovány v rotoru SW 40 při 35 000 ot/min, +5°C, po dobu 20 hodin.

Alternativně lze použít při větších objemech s výhodou vertikální rotor VTi 50. Do centrifugačníeh kyvet o deklarovaném objemu 39ml je připraveno po 30 ml lineárního gradientu chloridu česného / /3 až 32 váhových procent/. Gradient je podvrstven 9ml aktivní frakce CsCl A, předem doupravené jako v předchozím případě na hustotu 1,32 g/cm . Takto je možno frakcionovat při 35 000 ot/min 8 hodin, +10°C, najednou 72 ml aktivní frakce CsCl A.

Po skončení centrifugace je materiál frakcionován odběrem shora na 50 frakcí. Jednotlivé frakce jsou analyzovány na přítomnost HBsAg a sérových bílkovin metodou radiální imunodifuze.

Aktivní frakce s minimálním obsahem sérových bílkovin jsou spojeny a dialyzovány proti TENa pufru /složení shodné jako v kroku 2.2./ a koncentrovány na 1/20 objemu spojených frakcí. Získaný koncentrát je označen CsCl B a je uchováván při -20°C.

Rychlostní frakcionace v sacharózovém gradientu

4.1. Aktivní koncentrát CsCl B je nanesen v objemech 0,2 ml na vrchol stabilizovaného /18 až 24 hodin při +4°C/ lineárního sacharozového gr₉dientu /9 až 21 objemových procent sacharozy v TENa pufru/stejného složení jako v kroku 2.2.//, připraveného v polyallomerových

- 9 236 992 nebo nitrocelulozových zkumavkách rotoru Beckman. typ: SW 40.

Po následující centrifugaci v rotoru SW 40.při 40 000 ot/min, θ 2 9 * +50, w t 300 x 10 , je materiál frakcionován bud odběrem shora jako v předchozím případě, nebo ode dna a analyzován stejným způ« sobem jako v kroku 3.3.

Aktivní frakce neobsahující sérové bílkoviny jsou spojeny a dialy zovány proti pufru: 0,01 M fosfát, 0,15 M chlorid sodný, pH 7,2 /PBS/.

Adjustace a analýza purifikátu HBsAg r

5.1. Konečný purifikát po dialýze proti PBS pufru/složení stejné jako v kroku 4.1./ je analyzován spektrofotometričky a adjustován na obsah bílkovin: 1mg/1ml/ 37,3/, rozplněn po alikvótech

1mg a uchováván při -20°C.

5.2. Kvalita purifikátu je ověřena spektrofotometricky stanovením £

poměru aminokyselin tryptofán/tyrosin, stanovením koncentrace bílkovin metodou Lowry·, koncentrace HBsAg metodou radioimunodifuze a specifické koncentrace HBsAg v produktu.

♦

Vysoký obsah detekovaného tryptofanu, vysoký extinkční koeficient a vysoká specifická koncentrace jsou ukazateli vysoké kvality purifikátu.

Claims (5)

1. PŘED Μ ŠT VYNÁLEZU 238 392

   I . Způsob purifikace povrchového antigenu hepatitidy 3 / HBsAg/j vyznačující se tím, že na povrchový antigen hepatitidy B z lidΛ ského séra,konvertované plazmy nebo kultivačního média, produkčních linií tkáňových kultur se působí polyethylénglykolem o výsledná koncentraci 4 až 7; objemových procent, při pH 6,8 až 7,4 a po odstředění se působí polyethylenglykolem o výsledné koncentraci 6 až 15 objemových procent, při pH 3,5 až 7,0 a po odstreHění se sediment zpracovává dvakrát hustotní frakcionací v médiu · chloridu česného o hustotě 1,2 až 1,35 g/cm a po odstředění se sediment zpracovává rychlostní frakcionací v médiu sacharózy.
2. 2. Způsob purifikace podle bodu 1, vyznačující se tím, že při prvním působení polyethylenglykolu je jeho výsledná koncentrace

   5,5 objemových procent při pH 7,2.
3. 3. Způsob purifikace podle bodu 1, vyznačující se tím, žé při * druhém působení polyethylenglykolu je jeho výsledná koncentrace v

   7,9 objemových procent při pH 4,5.

   %
4. 4. Způsob purifikace podle bodu 1jvyznačující se tím, že při hustotní frakcionací je frakcionovaný materiál podvrstvený tak, aby frakcionace se dosáhla flotací.
5. 5. Způsob purifikace podle bodu 1, vyznačující se tím, že gradient hustotního média chloridu česného se připravuje zmrazením média na teplotu nižší než -10°C a následným rozmražením při teplotě *

   -5 až +50°C, s výhodou při +10°C.