CS237939B1 - Způsob výroby hemoglobinového infúzního roztoku - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby netoxického hemoglobinového infúzního- roztoku přenášejícího kyslík.

Potřeba krve pro lékařské účely stále stoupá a její zdroje jsou omezené. Pro infúzní -protišokovou terapii za mimořádných okolností a při hromadných neštěstích je nutné vyvíjet vhodné roztoky, které by byly schopné krev nahradit. Zejména jde o náhradu ztraceného krevního objemu při těžkém krvácení a současně o přenos kyslíku tkáním a odstraňování oxidu uhličitého. Dosud komerčně vyráběné koloidní náhradní roztoky jsou schopny zajistit pouze náhradu a udržení krevního objemu, ale nejsou schopny přenášet kyslík ani oxid uhličitý.

Protože hemoglobin i mimo krvinky si zachovává v jisté míře schopnost transportu těchto- plynů, orientoval se výzkum posledních let na využití prošlých lidských erytromas pro přípravu hemoglobinového infúzního roztoku.

Jak bylo zjištěno, intravenózně podaný volný hemoglobin dokonale zbavený stromat a jejich fragmentů (S. F. Rabiner asp., J. exp. Med., 126, 1 127 (1967), S. F. Rabiner, Fed. Proč. 34, 1 454 (1975), Τ. I. Přistoupil,

S. Ulryctl AO 154 000) Je i ve velkém množství snášen příjemcem bez toxických prízna237939 ků. Ve srovnání s hemoglobinem uzavřeným v- krvince má tento destromatizovaný hemoglobin větší afinitu ke kyslíku, snáze disociuje na diméry, které se rychle vylučují z krevního- řečiště (poločas T/2 = 1,5 až 2 hod.) a postupně se při skladování nezvratně oxiduje na methemogl-ohin, který není schopen vázat molekulární kyslík.

Tyto negativní vlastnosti hemolyzátu byly v průběhu let postupnými modifikacemi odstraňovány. Navázáním pyridoxal-5-fosfátu na molekulu hemoglobinu snížil Ben-esch a sp. (Binochemistry 11, 3 576 (1972) afinitu hemoglobinu ke kyslíku, a tím podstatně zvýšil přenos kyslíku tkáním. Pyridoxalfosfátem modifikovaný hemoglobin však má rovněž nízký intravaskulární poločas (T/2 = = 5 h.) Aby se hodnota T/2 dále zvýšila, modifikovala řada autorů hemoglohln-pyridoxalfosfát různými dialdehydy (např. glutaraldehydem) za tvorby heterogenní směsi konjugátů a polymerů. U takt-o modifikovaných a polymerovaných hemoglobinů se příznivě prodloužil poločas vylučování z krevního řečiště, avšak za cenu určitéhosnížení -schopnosti přenosu kyslíku.

Jiné varianty hemoglobinových infúzních roztoků se zakládaly na příměsi makromolekulárních látek, které se používají jako náhražka za plasmu, .na-př. želatina, dextran, sérový albumin apoid. Bylo zjištěno, že přítomnost těchto makromolekulámícih roztoků má příznivý vliv na viskozitu, vaskulární retenci, stabilitu výsledných hemoglobinových preparátů i na jejich lepší snášenlivost v organismu příjemce.

Dalším krokem byla tvorba kopolyméru, resp. kondenzátů hemoglobinu s těmito látkami. Někteří autoři (K. Bonhard a sp. Patent 2 449 885, 1979 NSR, A. A. Clhačaturjan a sp. Perenosčiki kisloroda str. 83, 1979 MZ SSSR) polymerovali hemoglobin se sérovým albuminem pomocí různých dialdehydů. Modifikace hemoglobinu a navázání dalších makromolekul se prováděla v několika postupných etapách trvajících až tři týdny, čímž značně stoupá riziko kontaminace, oxidace apod. Výsledné konjugované preparáty měly podle autorů vylučovací poločas 5 až 10 hodin a Pso podobné jako nativní hemoglobin.

Koncentrace hemoglobinu se pohybovala od 6 % do 15 % a průměrná molekulová hmotnost většiny preparátů od 200 000 do 600 000. Tím stoupá riziko nepříznivých reakcí organismu příjemce, riziko blokády ,retikulO' endoteliálního systému apod. Někteří autoři proto preparát ještě dodatečně frakcionovali např. síranem amonným, aby se odstranily složky o vysokých molekulových hmotnostech. To přinášelo další technické komplikace (dialysa síranu), ztráty a rizika.

Autoři tohoto vynálezu vycházeli z uvedených poznatků z literatury i z vlastních zkušeností a vypracovali nový způsob přípravy pozměněného hemoglobinu, který se od dosavadních preparátů odlišuje v těchto bodech:

1. Reakce hemoglobinu s pyridoxal-5-fosfátem v anaerobním prostředí neprobíhá samostatně, ale za přítomnosti sérového albuminu. Tento postup umožňuje použít při následující kondenzační, resp. polymerizační reakci dvakrát nižší koncentraci glutaraldehydu než při pyridoxalaci samotného hemoglobinu (pro polymeraci pyridoxalovaného hemoglobinu je zapotřebí 25 mg až 30 mg glutaraldehydu na l g hemoglobinu, u nás pouze 15 mg glutaraldehydu na 1 g hemoglobinu).

2. Vzniklý produkt pak obsahuje kondenzáty a polymery o nižší průměrné molekulové hmotnosti (45 000 až 200 000), tím odpadá nutnost dodatečné frakcionace a při intravenózní aplikaci lze očekávat menší zatížení organismu příjemce.

3. Celá příprava infůzního roztoku podle tohoto vynálezu probíhá při hodnotě pH blízké neutrální oblasti v 0,1 M tris-(hydroxymethylj-aminometihanu v destilované vodě, upraveném koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,5; na rozdíl od alkalických borátových pufrů o hodnotě pH 9, používaných jinými autory; při teplotě 4 °C celíkem 20 hodin.

4. Reakce s glutaraldehydem je ukončena přidáním roztoku borohydridu, který zredukuje jatk nezreagované aldehydy, tak i methemoglobin a současně zpevní Schiffovy báze za tvorby kovaleintních —CHa— můstků. Není třeba přidávat lysin a podobné látky používané dřívějšími autory.

5. Nežádoucí nízkomolekulární příměsi použité či vzniklé během reakce se odstraňují v závěrečné fázi přípravy gelovou chromatografií, přičemž se preparát současně převádí do 'polyiontového roztoku vhodného pro biologickou aplikaci.

6. Preparát je dlouhodobě skladovatelný buď ve zmraženém stavu, nebo v suchém stavu po lyofilizaci se sacharózou (vynález přihlášen pod číslem 222-83), je dobře a rychle rozpustný bez závažnějších změn původních vlastností.

Podle provedených měření má konečný produkt tyto základní vlastnosti:

Koncentrace hemoglobinu: 60 g až 70 g/1, z toho 85 až 90 °/o oxyhemoglobin, 10 až 11 procent methemoglobiu.

Jde o značně heterogenní směs asi 10 až 20 '% nepozměněných hemoglobinových frakcí, hlavní podíl tvoří pyridoxalované deriváty hemoglobinu a jejich inter- a intramolekulární konjugáty. Tato směs má při standardních preparačních podmínkách repirodukovatelné vlastnosti a složení (podle analýzy izoelektrickou fokusací, chromatofokusací, rychlou kapalinovou chromatografií bílkovin a elektroforézou na polyakrylamidovém gelu).

Molekulová hmotnost subfralkcí se pohybuje mezi 45 000 až 200 000 s jedním maximem při 65 000 a určitou asymetrií distribuční křivky směrem k vyšším molekulárním hmotnostem.

Podíl nehemoglobinových bílkovin cca 10 %. Celková bílkovina (hemoglobin -j- albumin) g až 77 g/1, pH 7,4.

Viskozite rel. (při 20 °C pH 7,4) = 1,5. Onkotický tlak izoonkotický s plasmou.

P 50 (37 °C, pH 7,4) = 15 až 18 mm Hg (2 až 2,4 kPa).

Hillův koeficient n = 2,1.

Polyiontové složení: Krebs-Henseleitův podobný roztok podle potřeby.

Při testu akutní toxicity na myších a krysách je preparát netoxický. Krysy přežívají v dobrém stavu výměnou transfúzi, při níž se vymění až 95 % vlastní krve za roztok hemoglobinu podle vynálezu. To svědčí jednak o dostatečném transportu kyslíku prostřednictvím použitého infůzního roztoku, jednak o dostatečné ventilaci oxidu uhličitého. Orientační pokusy in vitro na izolovaných orgánech krys — srdce, plíce, mozek, játra — rovněž svědčí o tom, že uvedený preparát nepoškozuje tyto orgány a má pří237839 znivý efekt přenosu kyslíku a ventilace oxidu uhličitého.

V tomto směru jsou nejprůikaznější výsledky na izolovaném srdci, kde bylo zjištěno, že kontrakční síla srdce promývamého hemoglohinovým roztokem podle vynálezu při nízkém parciálním tlaku kyslíku 13 až 19 kPa je prakticky stejná jako v solném roztoku 's parciálním tlakem kyslíku 85 kPa.

Předmět vynálezu je doložen v následujícím příkladu, aniž by však byl tímto příkladem omezován.

Příklad

Roztok 100 ml destromatizovaného a deoxygenovanébo hemolyzátu z lidské erytromasy podle čs. AO 154 000 obsahující 10 g hemoglobinu a méně než 0,3 g methemogloblnu se v uzavřené skleněné aparatuře smíchá se 4,4 ml tris-[ hydroxymethy] J-aminomethanu koncentrace 121 g/1 upraveného koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,5, a hodnota pH reakční směsi se upraví vodným roztokem hydroxidu sodného· koncentrace 100 g/1 na hodnotu pPI 7,2 až 7,7, s výhodou na pH 7,5.

Ve směsi hemolyzátu a pufru se rozpustí 100 mg pyridoxal-5-fosfátu a 1 g sušeného· lidského albuminu za chlazení na 4 ^CC a intenzivního míchání na elektromagnetické míchačce. Po rozpuštění se aparatura 35 minut udržuje při podtlaku 0,8 až 1,06 kPa a reakce se nechá probíhat po 4 hodiny pod

S proudem dusíku. Do reakční směsi se potom přidá v průběhu 5 minut roztok glutaraldehydu, deoxygenovaný proudem dusíku po· dobu 30 minut, do konečné koncentrace 15 miligramů glutaraldehydu na 1 g hemoglobinu, s výhodou v roztoku o koncentraci 10 g glutaraldehydu na litr 0,1 M tris-(hydroxymeťhylj-aminomethanu, tj. 12,1 g/1 upraveném koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 7,5.

Reakce s glutaraldehydem se nechá nejprve probíhat 60 minut pod proudem dusíku za intenzivního míchání a chlazení a potom bez míchání ještě 17 až 18 hodin při teplotě 1 až 10 ^O,C, s výhodou při 4 °C, v uzavřené nádobě pod dusíkem. Po uvedené době se aparatura opět evakuuje 30 minut a dalších 60 minut se přivádí dusík. Pak se do reakční siměsi přidá 50 až 300 mg borohydridu sodného, s výhodou 200 mg v 8 ml 0,001 N NaOH — hydroxidu sodného, a ponechá se bez mechanického míchání 18 až 20 hodin v lednici, s výhodou při 4 ^CC.

Hotový preparát se zbaví nežádoucích nízkoraolefculárních příměsí gelovou filtrací na sloupci Sephadexu G 25 a současně se tak převede do ipolyiontového roztoku vhodného pro biologickou aplikaci, např. Krebs-Henseleitův roztok, Ringer-laktát apod.

Hotový preparát se sterilně filtruje, rozplňuje do sterilních NTS lahví a uchovává se ve zmrzlém stavu nebo se lyofilizuje za přítomnosti sacharózy a provede se jeho analytická a biologická kontrola.

Claims (1)

1. Způsob výroby hemoglobinového infúzního roztoku z destromatizovaného hemolyzátu lidské či zvířecí erytromasy, modifikací pyridoxal-5-fosfátem za přítomnosti sérového albuminu nebo bez sérového albuminu a následující polymeraci gluitaraldehydera, vyznačený tím, že v destromatizovanéim hemolyzátu připraveném o scbě známým způsobem o koncentraci hemoglobinu 60 :g až 150 g na litr s irelativní primasi 3 g až 5 g methemogiobinu se rozpustí pyridoxSl-5-fosfát na konečnou koncentraci 0.5 g až 1,5 g na litr a přidává-li se sérový albuVYNALEZU min, tak do konečné koncentrace 50 mg až 500 mg na 1 g hemoglobinu při hodnotě pH 7,2 až 7,7 pod proudem dusíku za míchání a chlazení při 1 až 8 °C po dobu 2 až 6 hodin, .načež se přidá roztok glutaraldehydu do konečné koncentrace 15 mg až 25 mg na 1 g hemoglobinu; reakce se nechá probíhat při teplotě 1 až 10 ^rC po dobu 1 až 20 hodin, dále se přidá 0,5 g až 30 g boroihydridu draselného nebo sodného na litr reakční směsi a po odpadnutí pěny se výsledný preparát dále zpracuje o sobě známým způsobem.