CS239044B1 - Izolace a purifikace apolipoproteinu A-I a apolipoproteinu B - Google Patents

Abstract

Účelem vynálezu je zlepšení postupu izolace a purifikace plasmatických bílkovin, apolipoproteinu A-I a apolipoproteinu B. Uvedeného účelu je dosaženo navrhovanou technologií, která využívá fyzikálně-che= mických a imunocbemických metod v pořadí: ultraoentrifugační flotace, chromatografie. Tento postup umožňuje souběžnou izolaci obou apolipoproteinů jako antigenů ve vysoké čistotě, při minimálních požadavcích na ultracenrifugační flotaci.

Description

Vynález ee týká Izolace a purifikace apolipoproteinu A-i (Apo A-I) a apolipoproteinu Β (Apo B) jako antigenů.

Výchozí surovinou pro přípravu obou apolipoproteinů je krevní eórum nebo plasma normolipidemických jedinců.

Lze použít také smíšené plasmy od více dárců, kteří však musí splňovat uvedenou podmínku. Je možné použit i plasmu získanou plasmaferesou.

Pro zpracování výchozí suroviny je v odborné literatuře k dispozici celá řada metod (Burstein, M. et al.. □ . Lipid. Res., 11, 1970, s. 583-592, Havel, R.3. et al., 3. Clin. Invest., 34, 1955, s. 1345-1353, Weisgraber, K.H. et al., □ , ^ipid, Res·, 21, 1980, s. 316-325, Cohn, E.3. et al. □ , Am. Chem. Soc·, 68, 1946, e. 459—463).

První fáze zpracováni spočívá v izolaci jednotlivých frakci krevních lipoproteinů, K tomuto účelu se používá téměř výhradně dvou postupů. První z nich je založen na selektivní precipitaci lipoproteinů polyanionty (Burstein,

M. et el., □.Lipid. Res·, 11, 1970, s. 583-592). Metodou dle Bursteina lze izolovat z čerstvé plasmy precipitaci roztokem wolframanu sodného (40 g/1) a chloridem manganatým v koncentraci 2,0 mol/l směs lipoproteinů a velmi nízké hustotě a nízké hustotě (VLDL a LDL) a lipoproteiny o vysoké hustotě (HOL). Druhý z nich spočívá v postupné ultracentrifugačni flotaci podle Havela a spol. (Havel, R.3. et al., □· Clin. Invest., 34, 1955, s. 1345-1353). Pomoci flotace s postupně se zvyšujíc! specifickou hmotnosti jsou

- 2 239 044 z výchozího materiálu, krevní plasmy nebo séra. Izolovány

VLDL, LDL a HOL. Jen zcela výjimečně bylo použito k přípra vě některé z uvedených' llpoprotelnových frakcí jiné metody.

Druhá fáze je zaměřena na izolaci jednotlivých apolipoproteinů z delipldovaných frakci lipoproteinů - jejich proteinové komponenty. K tomuto účelu se nej častěji používá gelová filtrace ne dextranových gelech (Sephadex) nebo ieoelektrická fokueace (Alaupovlc, P. et al., Biochim, Blophye· Acta, 260, 1971, 8. 689-707, Curry, M.D. et al., Clin, Chem., 22, 1976, e. 315-322, Curry* M.D. et al.,

Clin, Chem., 24, 1978, e. 280-286, Forhez, P. et al., □ . Biochem. Biophye., 6, 1982, e. 283-296).

Při izolaci jednotlivých frakci pleemetických nebo sé rových lipoproteinů je dávána přednost ultracentrlfugační flotaci před metodami precipitačnimi. Pomocí ni lze připra vit frakce lipoproteinů, jejichž fyeikálně-chemické vlastnosti jsou aIterovány méně než vlastnosti lipoproteinů dělených precipitaci. Ultracentrlfugační flotace je věak metodou vysoce náročnou na kvalitní technická vybavení.

Z dosavadních zkušeností vyplývá, že nejvhodnějšim postupem Izolace ς purifikace apolipoproteinů je kombinace ultracentrlfugační flotace, delipidace a chromatografie. Této koncepce bylo využito taká k vypracování navrženého výrobního postupu izolace Apo A-I a Apo B, avšak tak, aby byly co nejvíce sníženy požadavky na technická vybaveni při zachováni potřebné čistoty obou apolipoproteinů jako antlgenů.

Podstatou vynálezu Je návrh reprodukovatelné výrobní

239 044 technologie Izolace apolipoproteinů A-I a B ae zvláštní· zřetelem na dosažení potřebná čistoty konečného produktu při použití co nej jednoduššího pracovního postupu·

1· Příprava plasmy jako výchozí suroviny spočívá v přidáni sodná soli kyseliny ethyléndiamlntetraocéové a přefiltrováni přes aebeatoceluloaovou vrstvu (Seitz).

2. K prvnímu ultracentrifugačnlmu děleni ee specifická hmotnost plasmy upraví pomoci bromidu sodného na 1.030- 1,050 kg/1. Ultracentrifugačni flotaca probíhá při 750 Hz a teplotě 5 až 10^°C po dobu 18 až 22 hodin· Po skončeni ae oddělí supernatant. mezivrstva a infranatant. Mezivrstva sa odstraní.

Ke druhému ultracentrifugačnlmu děleni ee upraví specifická hmotnost infranatantu pomocí bromidu draselného <~<j,230 na 1,050) kg/1· Ultracentrifugačni flotaca probíhá při 750 Hz a teplotě 5 až lof°C po dobu 18 až 22 hodin· Oddělí se supernatant, mezivrstva a infranatant.

- Supernatant slouží k přípravě Apo B,

- Infranatant slouží k přípravě Apo A-I.

3. Příprava apolipoproteinu A-I.

Specifická hmotnost infranatantu získaného druhou ultracentrlfugační flotaci se upraví bromidem draselným na 1.23 kg/1· Následující ultracentrifugačni dělení probíhá při 750 Hz a teplotě sj°C až ÍO^C po dobu 40 až 45 hodin. Po úpravě specifické hmotnosti ee ultracentrifugačni dělení opakuje za stejných podmínek·

Supernatant se dialysuje proti destilované vodě β přídavkem sodné soli EOTA v koncentraci 0.02 mol/l po dobu

239 044 dvakrát 4 hodiny. Dialysovaný materiál ee lyofllisuje.

Delipidace lyofilisovaného materiálu se provádí ve skleněné centrifugačni kyvetě. K materiálu ee přidá směs chloroformu (2 díly) a etanolu (1 díl) a kyveta se umleti na dobu 30 minut do směsi suchého ledu (CO^ tuhý) s etanolem. Občas se obsah kyvety zamíchá. Pak se kyveta z chladicí směsi vyjme a obsah ee odstředí při 42 Hz. Rozpouštědlo se odleje a extrakce ee opakuje za stejných podmínek. Potom se k materiálu přidá éter, směs se dobře promíchá a odstředí při 42 Hz, Také tato extrakce éterem se ještě jednou opakuje,

Delipidovaný materiál se opatrně vysuší proudem dusíku a rozpustí v roztoku 2 M-kysaliny octová. Rozpouštění lze zlepšit přidáním močoviny. Získaný roztok se přefiltruje přes skleněnou vatu a nanese na kolonu Sephadexu G-100 (90 x 2,5 cm), která je ekvilibrovaná stejným roztokem, Vymýváním roztokem kyseliny octová ( 2 mol/1) ee získají frakce obsahující Apo A-I, Apo A-IX a dalši proteiny. Frakce, které obsahují Apo A-I se spoji, zahusti na membráně Amicon a rechromatografuji za stejných podmínek. Získaná frakce ee dialyzuje proti vodě obsahující sodnou sůl EDTA v koncentraci 0,02 mol/1, při teplotě 4^C a po dobu 24 hodin,

4, Příprava apollpoprotelnu B

Specifická hmotnost supernatantu, který byl získán druhou ultracentrifugačni flotacl ae upraví bromidem draselným na 1,050 kg/1. Následující ultracentrifugačni dělení probíhá při 750 Hz a teplotě β až 10^°C po dobu 15

239 044 až 20 hodin. Získaný eupernatant ee dialyauje dvakrát 4 hodiny proti destilované vodě obsahující sodnou eůl EDTA ( 0,02 mol/1).Dialysováný metriál ee lyofilieuje·

Delipidace lyfilieovanóho materiálu ee provádí stejně jako při izolaci apollpoproteinu A-I.

Příklad provedeni

Postup izolace a purifikace apollpoproteinů A-I a B a příprava materiálu k. izolaci je rozdělen do 3 stupňů o 9 pracovních krocích.

Postup od zpracováni výchozí suroviny pó krok 1.2. dovoluje současnou přípravu obou antigenů. Také některé další kroky při izolaci antigenů (2.2. a 3.2.) Jsou pro oba antigeny společné, což zjednodušuje celý pracovní postup.

0.0. Výchoz! súrovina

K izolaci apollpoproteinů A-I a B použijeme odleželé lidské plasmy od zdravých dárců. Výhodné je vycházet z 500 ml plaamy. K plasmě přidáme sodnou sůl EDTA v množství 0,37 g/1 a azid sodný do výsledné koncentrace 1 g/1. Potom plasmu přefiltrujeme přes asbeetocelulosovou vrstvu (Seitz, K5).

1.0. Izolace plasmatických lipoproteinů

1.1. Ultracentrifugačni flotace plasmatických lipoproteinů

Specifickou hmotnost výchozí suroviny upravíme pomoci pevného bromidu draselného (KBr) na 1,030 kg/1. Ultracentrifugačni flotaci provádíme na ultracentrifuze C H RII S T Omega II (rotor 9710) při 750 Hz a

- 6 239 044 a teplotě 5 až loj?C po dobu 18 až 22 hodin. Po skončeni oddělíme supernatant a mezlvretvu od infranatantu Supernatant a mezlvretvu odstraníme·

1.2. Rozdělení plaematických lipoproteinů podle jejich specifické hmotnosti

Specifickou hmotnost infranatantu získaného v kroku 1«2« upravíme pomoci pevného bromidu draselného na 1,050 kg/1· Ultracantrifugačni flotaci provádíme na ultracentrifuze Chriet Omega II (rotor 9730) při 750 HZ a teplotě 5 až lo|°C po dobu 18 až 22 hodin· Oddělíme supernant, mezlvretvu a infranatant, Supernatant slouží jako zdroj apollpoproteinu B, infranatant jako zdroj apollpoproteinu A-I a mezivretva ea odstraní.

2.0. Izolace a purifikace apollpoproteinu A-I

2.1. Ultracentrifugační flotace

Specifickou hmotnost infranatantu získaného v kroku 1.2. upravíme pomoci pevného bromidu draselného na 1,230 kg/1. Ultracentrifugační flotaci provádíme opět na ultracantrifuza Chriet Omega II (rotor 9730) při 750 Hz a teplotě β až ÍC^C po dobu 40 až 45 hodin. U získaného euparnatantu změříme specifickou hmotnost, podle potřeby Ji upravíme pomocí pevného bromidu draselného na 1,230 kg/1 a ultracentrifugační flotaci opa kujeme za stejných podmínek.

2.2. Dialýea a lyofilisace

Supernatant získaný v kroku 2.1. dialyeujame proti etonáeobku destilované vody e přídavkem sodné > 239 044 eoli EDTA v koncentraci 0,02 mol/1 při teplotě 4 až 8^C po dobu 4 hodin. Potom dialysační roztok vyměníme a dialýsu za stejných podmínek opakujeme. Získaný materiál lyofilieujeme.

2.3. Oellpidace

Delipidaei lyofilieovaného materiálu z kroku

2,2. provádíme ve skleněné centrifugačni kyvetě o objemu 100 ml. K materiálu přidáme eměs 2 dílů chlorofor mu a 1 dílu etanolu v množství 50 ml. Kyvetu umístíme na dobu 30 minut do směsi pevného C0₂ a etanolem. Pravidelně kyvetou mícháme. Pak odstředíme při 42 Hz při laboratorní teplotě po dobu 10 minut, Rozpouětědlo odlijeme a extrakci za stejných podmínek opakujeme. K takto získanému materiálu přidáme 30 ml éteru. Směs dobře promícháme potom odstředíme při 42 Hz a laboratorní teplotě po dobu 10 minut, éter odlijeme a extrak ci opakujeme za stejných podmínek. Získaný materiál do8ušlme slabým proudem dualku.

2.4. Chromatografie

Materiál získaný v předchozím kroku (2.3.) podroblma|dělenl na sloupci Sephadexu G-100 o rozměrech

2,5 x 90 cm v prostředí 2 M-kyeeliny octově. Před nanesením na sloupec rozpustíme materiál v 8 ml kyseliny octové stejné koncentrace. Probíhá-li rozpouštěni obtížně, přidáme malé množství močoviny, čistoty p.a.

Po rozpuštěni a před nanesením na sloupec roztok přefiltrujeme přes eklěněnou vatu. Sloupec vymýváme 2 Mrottokem kyseliny octové. Frakce jímáme po 15 minutách

- 8 239 044 při průtoku 20 ml/h. Jednotlivé frakce proměříme na spektrofotometru při vlnové délce 280 nm na obeah bílkoviny. Frakce odpovídající jednotlivým vrcholům spojíme a po zahuštění na membráně Amlcon podrobíme rechromatograf11 za stejných podmínek. Výsledný materiál dlalysujeme proti stonáeobku objemu destilované vody s přídavkem sodné soli EDTA (0.02 mol/1), v chiadu po dobu 24 hodin. Potom stanovíme v získaném materiálu imunochemicky obeah apolipoprotelnu A-I. Potom materiál lyofilieujeme·

3.0. Izolace a purifikace apolipoprotelnu B

3.1. UltracentrifugaČni flotace

Specifickou hmotlnoet eupernatantu získaného v kroku 1.2. znovu změříme , podle potřeby upravíme pomocí pevného bromidu draselného na 1,050 kg/1 a opakujeme ultracentrlfugečni flotaci za podmínek uvedených ve stejném kroku (1.2,).

3.2. Oialýsa a lyofilisace

Supernatant získaný ultracentrlfugečni flotaci v předchozím kroku (3.1.) dlalysujeme proti etonáeobku objemu destilované vody s přidavekem sodené soli EDTA v koncentraci 0,02 mol/1 při teplotě po dobu 4 hodin. Pak dialýsu opakujeme za stejných podmínek.

V získaném materiálu stanovíme obsah Apo B imunochs_ micky a potom materiál lyofilieujeme.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   239 044

   Způsob izolace a purifikace apolipoproteinu A-I a apolipoproteinu 3, vyznačující se tím, že se z lidské plasmv,ke které se přidá bromid nebo chlorid alkalického kovu pro dosažení specifické hmotnosti 1,006 kg/1, izolují antigeny podrobením plasmy ultracentrifugační flotaci, postup se opakuje se stoupající koncentrací soli, a to tak, že v případě izolace apolipoproteinu 3 se použije rozmezí specifických hmotností 1,030 - 1,050 kg/1 a v případě izolace apolipoproteinu A-I se použije rozmezí specifických hmotností 1,050 - 1,230 kg/1 a příslušné frakce se podrobí dělení na sloupcové chromatografii s použitím dextranových gelů.