CS243173B1 - Způsob výroby partikulárního 0 -1,3-D-glukanu - Google Patents

Abstract

Jedná se o způsob výroby partikulárního beta-1,3-D-glukanu. Mikroorganismy, a to askomycety, basidiomycety, řasy a protozoa, obsahující glukan, s výhodou kvasinky Saccharomyces cerevisiae, se desintegrují, buněčné stěny se oddělí, promyjí vodou, potom 0,4 až 8% roztokem hydroxidu alkalického kovu, s výhodou NaOH a KOH a dále s vodou s přídavkem 0,01 až 0,1 * smáčedel, potom se buněčné stěny vaří v roztoku alkalického kovu, po ochlazení se sediment promývá vodou, přivede na dobu 1 až 4 h k varu a po získání požadované čistoty promytim vodou se produkt suší. Výhodou tohoto postupu je, že je jednoduchý a poskytuje výtěžky stejné nebo vyšší než u dosud popsaných postupů.

Description

Vynález se týká způsobu výroby partikulárního beta-1,3-D-glukanu (dále jen glukan), z mikroorganismů.

Glukany nabývají stále větší důležitosti v klinické i biochemické praxi, snižují hladinu cholesterolu, stimulují fagocytárnl aktivitu a retikuloendotheliálnl systém vůbec, indikují regresi tumorů a zvyšují nespecifickou imunitu vůči infekcím. Další použití je možné v biochemické praxi, a to jako substrát pro stanovení endo- a exo-beta-1,3-D-glukanázové aktivity.

Dobrým zdrojem pro získáváni glukanu jsou askosporogenní kvasinky čeledi Saccharomycetaceae, z nichž nejnižší kontaminující obsah chitinu vykazují rody Scizosaccharomyces a Kloeckera (0 4) a Endomycopsis (1,4 4), dále Saccharomyces, Kluyveromyces, Píchla, Hansenula, Debaryomyces, Saccharomycopsis a další. Z ostatních čeledí a podčeledí jsou pro přípravu glukanu použitelné rody Saccharomycoides, Hanseniaspora a Wickerhamia (S. Barnicki-Garcia, Ann. Rev. Microbiol. 22, 1 504, 1968).

Kromě strukturálních beta-1,3-D-glukanú se vyskytuje tento glukan pod různými názvy:

Jako exocelulárnl polysacharid pululan, rezervní polysacharid paramylon, chrysolaminarin, laminarin atd.

Příprava glukanu ze Saccharomyces cerevisie (J.D.Manners, A.J.Mason, J.C.Petterson,

J. Gen. Microbiol., 80, 411, 1974) vychází z přípravy glukanu z celých nedesintegrovaných buněk. Lisované droždí se míchá s 3 až 6 % NaOH při 18 °C 24 h a po centrifugaci se sediment suspenduje v 3% hydroxidu sodném NaOH a míchá 3 h při 50 až 75 °C. Po zředění vodou a centrifugaci se sediment suspenduje v 3% NaOH a ponechá 18 h při 18 až 20 °C a promyje vodou.

Potom se sediment rozmíchá ve vodě, zahřeje na 80 °C, filtruje přes G₁ sintr a upraví kyselinou octovou na pH 4,5.

Po centrifugaci se sediment opět suspenduje v 3% NaOH a míchá 2 h při 80 °C, potom se směs centrifuguje, k peletu se přidá voda a pH se upraví na 4,5 a centrifuguje. Potom se sediment míchá 1 h v 0,5 M kyselině octové při 70 až 80 °C, odstředí a želatinosní materiál se 1 h míchá s vodou při 70 až 80 °C. Následuje další extrakce s 0,6 M octovou kyselinou 1 h pří 70 až 80 °C a po odstředění se míchá s vodou 1 h při 75 až 80 °C.

Po opětovné centrifugaci se pelet suspenduje v 0,02M octanu sodného a zahřívá v autoklávu 1 h při 132 °C. Po dispergaci ve vodě se suspenze centrifuguje. Promývání a centrifugace se opakuje celkem 6krát. Produkt je světležlutý prášek obsahující 0,4 4 popela a 0,6 % dusíku, dále 1,6 4 gentiobiosy, 0,53 4 gentiotriosy, 0,56 4 gentiotetraosy. K uvedenému postupu byla popsána řada modifikací (J.S.D.Bacon, V.C.Farmer, D.Jones, I.F.Taylor, Biochem.J., 114, 557, 1969), kde se místo kyseliny octové používá aoetátový pufr nebo směs etanolu a éteru s 14 chlorovodíkem. Jiná modifikace vypracování stejnými autory se týká borohydridu sodného, kdy po prvém účinku acetátového pufru a po trojnásobné extrakci s vodou se k 34 NaOH přidá borohydrid sodný. Výtěžek glukanu u popsaných postupů činí 1,9 4.

A.Misaki, J.Johnson, S.Kirkwood, J.V.Scaletti, F. Smith (Carbohyd. Res. 6, 150, 1968) použili k izolaci glukanu celých buněk, které nejprve čtyřnásobně extrahovali v alkalickém prostředí, potom upravili pH, 3krát promyli vodou, etanolem a éterem. Po usušeni produktu jej dále čistili extrakci octovou kyselinou, přičemž tato extrakce prováděná vždy 3 h při 90 °C se opakovala 7krát. Po centrifugaci se sediment promyl 3krát vodou, 2krát etanolem, 3krát éterem. Výtěžek činil 0,84 4 vzhledem k počáteční hmotnosti kvasinek.

Podstata způsobu přípravy glukanu podle vynálezu spočívá v tom, že mikroorganismy obsahující glukan, s výhodou Saccharomyces cerevisiae, se desintegrují, buněčné stěny se oddělí, promyjí vodou, potom 0,4 až 8% roztokem hydroxidu alkalického kovu, s výhodou NaOH a KOH a dále vodou s přídavkem 0,1 % smáčedel, potom se buněčné stěny vaří 30 min až 4 h ve 44 roztoku NaOH nebo KOH a po ochlazení se sediment promývá vodou, přivede na dobu 1 až 4 h k varu a po získání požadované čistoty promytím vodou se produkt čistí a následně suší nebo lyofili3 zuje. Jako detergent (smáčedlo) se používá Tween 20, Tween 80, Triton X-100, s výhodou n-dodecylsulfát sodný. Pod názvy prvých tří smáčedel se jedná o polyoxyethylen (20) sorbitan monolaurát, polyoxyethylen (20) sorbitan monooleát a oktylfenol-polyoxyethylenglykoléter. Použitá koncentrace je v rozsahu 0,01 až 0,1 %. Takto připravený produkt s výtěžkem kolem 2 %, vztaženo na výchozí hmotnost lisovaného droždí, má tyto vlastnosti:

1. Acetylovaný produkt rozpustný v chloroformu (300 mg v 5 ml) má alfa _D - 62,3°.

-I 2 3-1

2. Molární hmotnost 310 kg . mol , koeficient vnitřní viskozity η = 3,36.10 . cm .g

3. . Infračervená spektra: 888, 1 000, 1 030, 1 070, 1 110-1 120, 1 155, 1 200, 1 250, 1 300,

370, 1 405-1 420, 1 460, 1 550, 1 620, 1 640, 1 655, 2 875, 3 445-3 450 cm ^_1.

4. Obsah celkového dusíku stanovený podle Kjehldala čísi 0,2 až 0,5 %.

5. Obsah aminokyselin (v/ig na gram glukanu) činí Lys (25), His (7,5), Gly (3,1), Ser (1,5), Ala (1,5), Leu (1,4), Glx (1,2), Asx (1,0), Ile (1,0), Val (1,0), Thr (0,6) a nulový obsah Arg, Met, Pro, Tyr a CysSO-j.

6. NMR při 62,8 MHz v dimethylsulfoxidu při 100 °C jsou ( v ppm):

103,0 (cl), 86,2 (C3), 76,4 (C5), 72,9 (C2), 68,6 <C4) a 61,0 <C6).

Spektrum se měří v dimethylsulfoxidu při pD = 13,7. Větvením se mění.

7. Rentgenová analýza (v nm): 0,608 (s); 0,397 (s); 0,327 (w) ; 0,293 (s); 0,256 (m). Glukan v alkáliích nerozpustný je z 5 % rozpustný ve vřících zředěných anorganických kyselinách.

Po vysrážení tvoří tzv. hydroglukan, jehož difrakce jsou identické s paramylonem (v nm):

1,36 (vs); 0,785 (mv); 0,678 (w); 0,535 (vw); 0,445 (m.dif.); 0,392 (m) ; 0,362 (mw) ;

0,345 (w) , 0,300 (vw); 0,290 (w); 0,270 (vW) a 0,265 (vw).

8. Podle metylační analýzy je možná přítomnost beta-1,6 vazeb (do 15 %) jako postranní větvení mezi jednotlivými trojčlennými helixy beta-1,3-D-glukanu.

9. Obsah popela pod 2 %.

Proti uvedeným způsobům přípravy glukanu, které jsou dosti komplikované, protože zahrnují řadu izolačních postupů a stupňů, pro izolaci se používají minimálně 2 různé sloučeniny, je postup podle vynálezu značně jednodušší a pro izolaci se používají jen hydroxidy alkalických kovů. Tento zjednodušený způsob přípravy poskytuje stejně, nebo vyšší výtěžky glukanu ve srovnání s dříve popsanými způsoby.

Příklad 1

200 kg pekařského droždí Saccharomyces cereviciae se desintegruje jako 8% suspenze na zařízení Dyno-Mill KD5. Toto zařízení reprezentuje mechanickou dezintegraci pomocí skleněných mikrokuliček. Po dezintegraci se produkt promyje vodou a promíchá. Po 15 min se buněčné stěny odstředují, až se získá mírně opalescentní supernatant. Sediment se potom suspenduje ve 100 1 1% KOH, při 20 °C míchá lha odstředí. Získaný sediment se promyje vodou, odstředí a suspenduje ve 100 1 2% KOH, míchá 30 min a opět odstředí. Potom se sediment suspenduje do 100 1 vody, odstředí a pelet rozmíchá ve 100 1 1M hydroxidu draselného a za míchání přivede k varu a vaří 1 h. Po samovolném ochlazení na teplotu 20 až 25 °C se směs odstředí, sediment 3krát promyje ÍM KOH a promývá vodou až hodnota pH dosáhne 7.

Potom se přidá dodecylsulfát sodný o koncentraci 0,01 % a po 1 h odstředí. Sediment se suspenduje ve 100 1 destilované vody, 1 h povařf a po odstředění se promyje, až je supernatant naprosto čirý. Získaný glukan se lyofilizuje. Výtěžek je 1,5 až 2, 2 % počítáno na hmotnost lisovaného droždí. Takto získaný glukan má molární hmotnost 310 kg . mol^-1 a obsah celkového dusíku je v rozmezí 0,20 až 0,50 %.

Příklad 2

500 g odstředěných kvasinek (mokrá hmotnost) Saccharomyces cerevlslae, mutantního kmene s fragilní buněčnou stěnou se vibračním míchadlem rozmíchá v destilované vodě a odstředí. Získaný pelet se suspenduje v destilované vodě a desintegruje v desintegrátoru Manton-Gaulin Toto zařízení reprezentuje desintegraci střižnými silami bez přídavku desintegrujících tělísek. Po desintegraci se postupuje zpŮBobem uvedeným v příkladu 1.

Příklad 3 g Euglena gracilis (mokrá hmotnost) se promyje vodou a potom etanolem. Potom se na buňky působí 1% trypsinem ve fosřorečnanovém pufru o pH 7,6 při 40 °C 12 h. Po promytí 8M močovinou se provede deproteinizace a po promytí, centrifugaci a vysušení se získá bílý produkt s výtěžkem 25 % vztaženo na hmotnost suchých depigmentovaných buněk.

Příklad 4

100 g mořských řas řádu Laminarinales se smísí s 500 ml 1% chlorovodíkové kyseliny, kterou se extrahují vakuolárni polysacharidy laminarinového typu. Precipitát nerozpustného sacharidu se získá srážením etanolem. Po centrifugaci a promytí vodou se polysacharid vysuší lyófilizací.

V biochemické praxi lze použít předmětu vynálezu jako substrát pro stanovení beta-1,3-glukanázové aktivity. Substrát lze použít ve formě rozpustné i nerozpustné, práškové i tabletové, rozpustná forma ale vychází ze substituovaného glukanu, a to karboxymethylovaného, hydroxyethyloveného a podobně. Dále se tento substrát může barvit remazolovou modří, čímž se připraví chromolytický substrát.

V klinické praxi kromě stimulace fagocytární aktivity a retikuloendotheliálního systému vůbec indukují regresi tumorů a zvyšují nespecifickou imunitu vůči infekcím. Vynikající výsledky byly zaznamenány v léčení chronické osteomyelitidy. Glukan je asi aktivní složkou zymosanu, protože aktivuji alternativní dráhu komplementu, z tohoto pohledu mohou preparáty glukanu nahradit zymosan. Glukan také snižuje hladinu krevního cholesterolu.

Claims (4)

1. předmEt VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy partikulárního glukanu, vyznačující se tím, že mikroorganismy obsahující beta-l,3-D-glukan, a to askomycety, basidiomycety, řady a protozoa, s výhodou kvasinky Saccharomyces cerevisiae, se desintegrují, buněčné stěny oddělí, promyjí vodou, potom 0,4 až 8% roztokem ^alkalického hydroxidu sodného NaOH nebo draselného KOH a dále vodou s přídavky smáčedel s výhodou n-dodecylsulfátu sodného, v koncentraci 0,01 až 0,1 %, potom se buněčné stěny vaří 30 min až 4 h v roztoku alkalického hydroxidu sodného NaOH nebo draselného KOH a po ochlazení se sediment promývá vodou, přivede na dobu 1 až 4 h k varu a po promytí vodou se produkt suší.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že desintegrace mikroorganismu se provede mechanicky nebo působením enzymů nebo působením chemických činidel.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se buněčné stěny vaří ve 4% hydroxidu sodném nebo draselném.
4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že sušení produktu se provádí lyófilizací.