CS243864B1

CS243864B1 - Enzyme electrode

Info

Publication number: CS243864B1
Application number: CS849525A
Authority: CS
Inventors: Lumir Macholan; Jaroslav Filipek
Original assignee: Lumir Macholan; Jaroslav Filipek
Priority date: 1984-12-10
Filing date: 1984-12-10
Publication date: 1986-07-17
Also published as: CS952584A1

Abstract

Řešení se týká enzymové elektrody, která sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk, uchycených v pružném držáku, mezi nimiž je biokatalytická vrstva. Elektroda je určena k enzymatickokonduktometrickému stanoveni biologicky důležitých látek.The solution concerns an enzyme electrode, which consists of two parallel metal meshes, mounted in a flexible holder, with a biocatalytic layer between them. The electrode is intended for enzymatic conductometric determination of biologically important substances.

Description

(54) Enzymová elektroda(54) Enzyme electrode

Řešení se týká enzymové elektrody, která sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk, uchycených v pružném držáku, mezi nimiž je biokatalytická vrstva.The invention relates to an enzyme electrode, which consists of two parallel metal meshes, held in a flexible holder, with a biocatalytic layer between them.

Elektroda je určena k enzymatickokonduktometrickému stanoveni biologicky důležitých látek.The electrode is designed for enzymatic-conductometric determination of biologically important substances.

Obr. 1.Giant. 1.

Vynález se týká enzymové elektrody. Enzymové elektrody jsou specifická analytická čidla pro rychlé stanoveni biologicky důležitých látek v tělesných tekutinách, v potravinách, krmivech a odpadech většinou bez potřeby jejich separace. Dají se použít i v kalných, barevných a fluoreskujících prostředích bez nároků na chemikálie, kromě pufru a příslušného standardu. Obvykle se zhotovují mechanickým připevněním biokatalytické vrstvy s imobilisovaným enzymem, suspenzí buněk, tkáňovým řezem na konvenční elektrochemický senzor.The invention relates to an enzyme electrode. Enzyme electrodes are specific analytical sensors for the rapid determination of biologically important substances in body fluids, food, feed and waste, mostly without the need for separation. They can also be used in turbid, color and fluorescent environments without the need for chemicals, except for buffer and the appropriate standard. They are usually made by mechanically attaching the biocatalytic layer with the immobilized enzyme, the cell suspension, and the tissue section to a conventional electrochemical sensor.

Z literatury i komerční produkce jsou známy dva druhy enzymových elektrod, které se liší typem základního indikačního senzoru:There are two types of enzyme electrodes known from literature and commercial production, which differ in the type of basic indicator sensor:

- potenciometrické, reagující na přídavek analytu změnou potencionálu, jako iontově selektivní elektroda apotentiometric, reactive to the addition of an analyte by a potential change, such as an ion selective electrode, and

- polarografické, tj. amperometrické, které při vloženém konstantním napětí mezi měrnou a referentní elektrodou dávají po přídavku analytu proudový signál.- polarographic, ie amperometric, giving a current signal when a constant voltage is applied between the measuring electrode and the reference electrode.

Je známé stanovení biologicky důležitých látek, využívající změnu vodivosti v závislosti na enzymatické reakci, například u analyzátoru močoviny v krvi, který pracuje na konduktometrickém principu s rozpustnou ureasou, která po analýze odtéká do odpadu, což je značně neekonomické.It is known to determine biologically important substances using a change in conductivity depending on an enzymatic reaction, for example in a blood urea analyzer which operates on a conductometric principle with soluble urease, which flows to waste after analysis, which is considerably uneconomical.

Tuto nevýhodu odstraňuje enzymetická elektroda podle vynálezu, který sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk, uchycených v pružném držáku, mezi nimiž je biokatalytická vrstva. Síťky jsou s výhodou vyrobeny z platiny nebo zlaceného fosforového bronzu s počtem 2 až 3.10 ok na cm . Biokatalytická vrstva obsahuje fyzikálně nebo chemicky imobilizovaný enzym, buněčné organely, mikrobiální buňky nebo tkáňový řez. Síla biokatalytické vrstvy je obvykle 0,2 až 0,5 mm. Biokatalytická vrstva může být tvořena zapolymerovaným enzymem v polyakrylamidovém gelu nebo enzymem zesítěným s albuminem nebo želatinou pomocí glutardialdehydu.This disadvantage is overcome by the enzyme electrode according to the invention, which consists of two parallel metal meshes, held in a flexible holder, with a biocatalytic layer between them. The nets are preferably made of platinum or gilded phosphor bronze with a number of 2 to 3.10 meshes per cm. The biocatalytic layer comprises a physically or chemically immobilized enzyme, cell organelles, microbial cells or tissue section. The thickness of the biocatalytic layer is usually 0.2 to 0.5 mm. The biocatalytic layer may consist of a polymerized polyacrylamide gel enzyme or an enzyme crosslinked with albumin or gelatin by glutardialdehyde.

Enzymová elektroda je schematicky v řezu znázorněna na obr. 1 a v nárysu na obr. 2. Sestává ze dvou paralelně umístěných kovových sítěk 2> mezi nimiž je umístěna biokatalytická vrstva g. Bezprostřední dotyk sítěk 2 s biokatalytickou vrstvou g zajištuje pružný držák 2. Sítky 1 jsou připojeny na neznázoměný konduktometr přes jednoduchý neznázoměný kompenzační člen, který umožňuje eliminovat výchozí vodivost pracovního pufru o nízké iontové síle.The enzyme electrode is schematically shown in section in FIG. 1 and in a front view in FIG. 2. It consists of two parallel metal meshes 2 between which a biocatalytic layer g is placed. 1 are connected to a conductor (not shown) via a simple compensator (not shown), which makes it possible to eliminate the initial conductivity of the low ionic strength working buffer.

Signál se vyvádí na neznázoměný zapisovač při citlivosti 20 mV a s rychlostí posuvu 0,1 mm/s.The signal is output to a recorder (not shown) at a sensitivity of 20 mV and a feed rate of 0.1 mm / s.

Funkce zařízení je dokumentována na stanoveni močoviny v moči (příklad 1). Močovina difundující přes elektrodové sítky do vrstvy,Amobilizovaného enzymu ureasy se zde štěpí na amonné a uhličitanové ionty : močovina + 2 H₂Ó 2 NH^ + CO₃ . Tím se mění i vodivost v meZielektrodovém prostoru. Elektrodová odezva má tvar.vlny a oba parametry zaznamenané křivky, tj. celková změna vodivosti i počáteční změna vodivosti jsou lineární funkci koncentrace močoviny v reakčním médiu. Pokud analyzovaný vzorek sáni již obsahuje ionty, je třeba jeho vodivost odečíst; za tím účelem se analýza opakuje s membránou obsáhující místo enzymu stejné množství inaktivní bílkoviny. Je už jen technickou záležitostí změřit oba signály současně, eventuálně přímo jejich diferenci.The function of the device is documented for the determination of urea in urine (Example 1). Urea diffusing through the electrode sieves into the layer, the Amobilized enzyme of urease, is cleaved here into ammonium and carbonate ions: urea + 2 H ₂ O 2 NH 4 + CO ₃ . This also changes the conductivity in the inter-electrode space. The electrode response is waveform and both parameters of the recorded curve, i.e. the total conductivity change and the initial conductivity change, are a linear function of the urea concentration in the reaction medium. If the analyzed suction sample already contains ions, its conductivity should be read; for this purpose, the analysis is repeated with a membrane containing the same amount of inactive protein instead of the enzyme. It is only a technical matter to measure both signals simultaneously, or directly their difference.

Předností biosenzoru je ekonomika analýz, nebot se mnohonásobně využije zakotveného enzymu, který může být i velmi nákladný.The advantage of the biosensor is the economics of the analyzes, as the embedded enzyme, which can be very expensive, can be used many times.

Druhým příkladem je jednoduché měření aktivity enzymu arginasy, která štěp! svůj substrát arginin na močovinu a ornithin:The second example is a simple measurement of arginase enzyme activity that cleaves! your substrate arginine on urea and ornithine:

arginasaarginasa

L-arginin + HjO -i-> močovina + ornithinL-arginine + H 10 O-> urea + ornithine

V tomto případě po nastartování reakce enzymem plynule vzrůstá vodivost. Vyhodnocuje se počáteční maximální změna vodivosti, která je úměrná aktivitě enzymu.In this case, the conductivity increases steadily when the enzyme is started. The initial maximum change in conductivity is proportional to the enzyme activity.

Další možnosti využití nového biosenzoru jsou nasnadě, např. stanovení různých amidů, esterů, alkoholů, aldehydů, kys. štavelové, argininu apod. při zvolení vhodného složení biokatalytické vrstvy.Other possibilities of using the new biosensor are obvious, eg determination of various amides, esters, alcohols, aldehydes, oxalic acid, arginine and the like when choosing the appropriate composition of the biocatalytic layer.

Enzymatická elektroda a její použití je blíže osvětleno v následujících příkladech.The enzyme electrode and its use are illustrated in more detail in the following examples.

Příklad 1Example 1

Stanovení močovinyDetermination of urea

Elektroda sestává z platinových sítěk s počtem ok 2 500 na cm ,' mezi nimiž je biokatalytická vrstva tvořena membránou, která byla připravena podle Guilbaulta a Montalva (Anal.The electrode consists of platinum meshes with a mesh count of 2,500 per cm, between which a biocatalytic layer is formed by a membrane prepared according to Guilbault and Montalva (Anal.

Chem. 41, 1 897, 1969) zapolymerováním 10 mg ureasy (Sigma III) do 60 ul polyakrylamidového 2 gelu mezi dvěma sklíčky na ploše 1,4 cm . Membrány o síle 0,25 mm jsou uchovávány v pracovním pufru. Do skleněné reakční nádobky s vodním pláštěm, magnetickým míchadlem a 6,5 ml 30 mM veronalového pufru pH 6,2, se vloží enzymová elektroda s imobilizovanou ureasou. Po vytemperování na 30 °C a vykompenzování výchozí vodivosti se přidá např. 20yUl lOx ředěné moči a zaznamená se změna vodivosti až do dosažení ustálené odezvy za 3 až 4 min. Poté se provede celé měření znovu při výměně enzymové vrstvy za vrstvu neaktivní /ureasa nahrazena stejným množstvím hovězího serumalbuminu/. Rozdíl obou měření odpovídá obsahu močoviny. Standardizace se provede s roztokem 1 g močoviny/1. Kalibrační křivka je lineární v rozmezí 3.8.10^-^ až -4Chem. 41, 1897 (1969)) by polymerizing 10 mg of urease (Sigma III) into 60 µl of a polyacrylamide 2 gel between two slides over an area of 1.4 cm. The 0.25 mm thick membranes are stored in working buffer. An immobilized urease enzyme electrode was placed in a glass reaction vessel with a water jacket, a magnetic stirrer, and 6.5 mL of 30 mM veronal buffer pH 6.2. After warming to 30 ° C and compensating for the initial conductivity, for example, 20 µL of 10X diluted urine is added and the change in conductivity is recorded until a steady-state response is achieved in 3 to 4 min. The whole measurement is then performed again when the enzyme layer is replaced by an inactive layer (urease replaced with an equal amount of bovine serum albumin). The difference between the two measurements corresponds to the urea content. Standardization is performed with a solution of 1 g urea / l. The calibration curve is linear between 3.8.10 ^- ^ and -4

6.1.10 M a reprodukovatelnost je okolo 6 %.6.1.10 M and the reproducibility is about 6%.

Příklad 2Example 2

Stanovení aktivity arginasyDetermination of arginase activity

Analýza se provádí se stejnou enzymovou elektrodou v 6,5 ml 20 mM maleátového pufru pH 9,5 obsahujícího 10 mM síran manganatý s 25 mM hydrochlorid argininu. Po přidání vzorku arginasy elektrodový systém signalizuje vznikající močovinu jako-'plynulý vzrůst vodivosti.The analysis was performed with the same enzyme electrode in 6.5 mL of 20 mM maleate buffer pH 9.5 containing 10 mM manganese sulfate with 25 mM arginine hydrochloride. Upon addition of the arginase sample, the electrode system signals the urea formed as a continuous increase in conductivity.

Ze záznamu se odečte počáteční rychlost, která se převede na enzymovou aktivitu v katalech po kalibraci standardem močoviny.The initial rate is read from the record and converted to the enzyme activity in the catalase after calibration with the urea standard.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Enzyme electrode, characterized in that it consists of two parallel metal meshes (1) mounted in a flexible holder (2) between which there is a biocatalytic layer (3).

Enzyme electrode according to claim 1, characterized in that the screens are made of platinum or

3 2 gilded phosphor bronze with a number of 2 to 3.10 meshes per cm.

3. The enzyme electrode according to claim 1, wherein the biocatalytic layer comprises a physically or chemically immobilized enzyme, cell organelles, microbial cells or tissue section.

4. The enzyme electrode according to claim 1, wherein the biocatalytic layer is 0.2 to 0.5 mm thick.

5. The enzyme electrode of claim 1, wherein the biocatalytic layer is a polymerized enzyme in a polyacrylamide gel.

6. The enzyme electrode according to claim 1, wherein the biocatalytic layer is composed of an enzyme cross-linked with albumin or gelatin by glutardialdehyde.