CS245153B1 - Kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenum - Google Patents

Description

245153 2

Vynález sa týká nového priemyselného mikroorganizmu produkujúceho kyselinu 7-/D-5-amino--5-karboxy-n-valeramido/-3-acetoxymetyl-3-cefem-4-karboxylovú, obecného vzorca I, tzv.cefalosporín C /CFS-C/

HOOC-CH-ICHjh-CO-NH I ' nh2 ( ch2ococh3 /1/

COOH

Cefalosporín C sa používá ako východzia surovina pri príprave polosyntetických cefalos-porínovích antibiotik. Produkčný kmeft bol získaný v screeningovom programe, zameranom naizoláciu kmeňov nezávislých na DL-metioníne. Východzím kmeftom bola kultúra Cephalosporium acremonium WIS OP 163, maximálna produkciacefalosporinu C dosahovaná na pódach s tiosíranom sodným ako zdrojom síry bola 200-400 /ig/ml.Cefalosporínové antibiotiká odvodené od kyseliny 7-aminocefalosporánovej sú vyráběné prevážnepomocou kmeňa Cephalosporium acremonium /po reklasifikácii Gamsom W. v roku 1971 Acremoniumchrysogenum/.

Rod Cephalosporium je v systematike zaradený do čelade Moniliceae do triedy Fungi imper-fecti /Deuteromycetes/. U rodu Cephalosporium sú spory vytvárané len terminálne na nevětve-ných konídiofóroch, skoro pravidelné posadených na hlavnom mycéliu. Cephalosporium tvoříseptované hýfy, septy delia protoplazmu na menšie úseky.

Konídionosiče sú jednotlivé, silné bazofilné. Známa je reprodukcia nepohlavnou mitózoua buněčnou elongáciou. Nepohlavné spory sú jednobuněčné konédie s jedným jadrom, vytváranéna hýfach.Buňky mycélia aj konídie obsahujú po jednom haploidnom jadre. Tieto vlastnostisi ponechávájú aj pri submerzných kultiváciách.

Cephalosporium ako eukariotický organizmus má membránou ohraničené jádro s chromozomálnouštruktúrou a cytoplazmou s poměrně komplexmou membránovou štruktúrou /mitochondrie, endo-plazmatické retikulum/. Významná je najma mimobunečná akumulácia antibiotika spósobená ex-kréciou cez koncentračný gradient. V submerznej kultúre sú přítomné štyri typy buníek: septované hýfy, konídie, klíčiacekonídie a artrospóry.

Morfológia je rozdielna v závislosti od použitého zdroja síry. Pri fermentácii s použi-tím DL-metionínu je převaha artrospór, s existenciou ktorých je spojená maximálna tvorbaantibiotika. Pri použití anorganických zdrojov síry sú v submerznej kultúre v prevahe vlák-nité formy; hrtíbka vlákna je menšia ako pri použití DL-metionínu.

Popisovaný kmeft bol získaný nasledujúcim spósobomi Póvodný kmeft Caphalosporium acremonium WIS OP-163 bol spracovaný chemickým mutagénomN-nitrozometylbiuretom. Najlepší izolát pracovně označený 8c VULM produkoval v submerznejkultivácii 1 800 až 2 000 .ug/ml cefalospor inu C.

Izolát 8c VULM bol v ďalšej fáze vystavený posobeníu 0V žiarenia. Získané izolátyboli hodnotené rýchlou screeningovou metodou na valčekoch z agarizovanej živnej pódys róznymi zdrojmi síry. Valčeky s vyrastenými kolonami na povrchu boli testované na agarovejplatní, s testovacím mikroorganizmom Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Specifickým pre cefa-lospor ín C.

Izolát s nSjvSčším priemerom inhibičnej zóny na agarizovanej pode s tiosíranom sodným bolďalej testovaný v baničkovej fermentácii a v laboratórnych fermentoroch. Izolát mal pracovnéoznačenie 188 VULM, aktivita cefalosporinu C vo filtrátoch fermentačnej pódy bola stanovená 245153 v 168. kultivačnej hodině spektrofotometrickou metodou /Claridge C. A., Vaughan R. W.:

Antimicrob. Agents Chemother., 1969, 131/ a metodou HPLC /vypracovaná VÚLM/. Genealogická schéma kmeňa je označená ako schéma č. 1. Xzolát 188 VULM je uložený v Cs. sbírce mikro- organizmu UJEP v Brně pod číslom CCM F-729.

Posóbenie chemického mutagénu.

Kmeft OP 163 WIS bol deponovaný vo formě lyofilyzovanej konzervy alebo krátkodobé našikmom agare /sporulačná póda označená NB-II; zloženie uvedené v dalšom texte. Zo šikméhoagaru bola připravená vodná suspenzia o koncentrácii 10$ až 10® konídií/ml. Suspenzia bola ' přefiltrovaná cez vrstvu vaty. Mutagén N-nitrozometylbiuret bol přidaný v koncentrácii0,4 i k suspenzi! konídií.

Mutangén bol v kontakte s kultúrou počas jednej hodiny na trepacom stroji /4Hz/ pri tep-lotě 27 °C. Po uplynutí expozície bolí zo zmesi mutangén-kultúra připravené riedenia 10"?^ až10 konídií/ml. Nariedenými suspenziami boli očkované Petriho misky s agarovou pódou NB-II.Ako kontrola slúžila suspenzia spor bez pridania mutangénu.

Operácie s mutangénom prebiehali bez přístupu denného světla. Spoluprácia na Petrihomiskách trvala pri teplote 27 °C 11 dní. Jednotlivé kolonie boli přenesené na šikmý agarNB-II a odskúšané na produkčnú aktivitu na baničkách. Pósobenie fyzikálneho mutangénu: Z kultúry na šikmom agare bola připravená suspenzia konídií zmytím povrchu 10 ml steril-ně j vody. Suspenzia bola přefiltrovaná cez vatový filter; zo základnéj suspenzie boli prip- -12 -13 ravené pracovně riedenia 10 až 10 konídií/ml, ktorými boli naočkované Petriho misky/póda NB-II/. Zdrojom žiarenia bola germicídna OV-lampa /Philips TUV 30W, vlnová dlžka253,7 nm sa podiela na celkovej spektrálnej energii 93,5 %/.

Povrch agaru s nanesenými konídiami bol exponovaný počas 1 minuty zo vzdialenosti 30 cm.Po ožiarení boli Petriho misky umiestnené v termostate, kde kultúra sporulovala 11 dní priteplote 27 °C. Z vyrastených kolonií boli ihlovou technikou přenesené spory na povrch aga-rových valčekov-bločkov.

Po 5 dftoch bol povrch bločkov pokrytý kultúrou. Bločky boli umiestnené na skleněnéplatné s agarovou pódou s obsahom 25 % kultúry Alcaligenes faecalis ATCC 8750. Inkubáciabločkov trvala 18 hodin pri teplote 37 °C. Hodnotenie izolátov bolo založené na meraníinhibičných zón v okolí bločkov. Najlepší izolát bol z póvodnej kolonie na Petriho miskevyočkovaný na šikmý agar NB-II a odskúšaný v laboratórnej aj štvrťprevádzkovej fermentácii.

Agarová póda NB-II hmot./obj. Basto-beef extrakt 0,3 Bacto-pepton 0,5 glukóza 1,0 FeSO4.7H2O 0,005 MgSO4-7H2O 0,005 DL-metionín 0,005 L-cystein 0,005 agar Difco 2,5 pH pódy před sterilizáciou -6,8.

245153 4 Příprava vegetativneho inokula:

Používali sa 500 ml banky plněné 60 ml inokulačnej pódy o zložení: sacharóza 1,5 % hmot./obj. kukuřičný výluh 0,5 octan amonný 0,5 sojový olej 0,2 pH před. sterilizáciou sa upravuje na 7,0.

Na očkovanie sa používá kultúra zo šikmého agaru alebo z jačmenných zrn, tzv. jačmennékonzervy. Příprava vegetativneho inokula trvá 72 hodin pri teplote 27 °C na trepaoom stroji/4 Hz/. Vegetatívnym inokulom sa očkujú produkčně pódy rozplnené v 500 ml bankách po 40 mlo zložení: kukuřičný škrobarašídová múkasacharózaglukózaCaCO3

Na2S2°3-5H2° borax kašalotový olej 5,0 % hmot./obj7,00,51,250,50,90,052,8

Na očkovanie sa používá 8 % obj./obj. vegetativneho inokula. Kultivácia má podmienkytotožné s přípravou vegetativneho inokula, dlžka kultivácie 168 hodin. Porovnanie produkčnejaktivity kmeňa Cephalosporium acremonium WIS OP-163 s izolátmi 8c VULM a 188 VULM je v ta-bulke 1. Porovnané sú výsledky dosiahnuté v baničkovej fermentácii:

Tabulka 1 číslo experimentu kmeň prod. aktivita/yg/ml/ CFS-C 1 WIS OP-163 350 8c VULM 1 860 2 8c VULM 1 930 188 VULM 4 000 3 188 VULM 4 000 9 VULM 1 680

Kmen používaný vo fermentácii s použitím DL-metionínu ako zdroja síry. V laboratórnych skleněných tančíkoch /Výv. dielne ČSAV/, objem 2 litre, pracovný objem1 liter, bola pri podmienkach: vzdušnenie 0,75 objemu vzduchu/objem pódy, miešanie 10 Hz,teplota do 24 kultivačnej hodiny 28 °C, potom do konca fermentácie 23 °C, dosiahnutá pro-dukčně aktivita 5 200 ug/ml za 168 hodin kultivácie.

Morfológia kmeňa:

Morfológiu kmeňa Acremonium chysogenum CCM F-729 je možné popísať nasledujúcim spósobom:Pri monokolÓniovom rozseve tvoří krémové v střede béžovo sfarbené kolonie o priemere 5 až7 mm. Povrch kolonie je sline vrásčitý, okraje radiálně zbrázděné, střed kolonií je vyvýšený

Claims (1)

1. 5 245153 cca 3 nim, tvoří nepravidelný kráter. Septované hýfy majd hrůbku 1,5 až 2,0 um. Mycélium jesvětlo sfarbené. Konídie sd tvaru pretiahnutej elipsy, zachovavajd si hrůbku póvodnej hýfy,ich dlžka je 5 až 6 jam /často sú obalené hlienom/ Kmeň je uchovávaný vo formě konzervyna zmesi hlina-piesok ako lyofilizovaná konzerva, ako šikmý agar na pode NB-II a ako konzervana sypkom substráte, ktorým je lúpaný jačmeň. Kmeň je stabilizovaný pri pasážovaní šikmýagar-vegetatívne inokulum-sypký substrát-vegetatívne inokulum, ako aj pri pasážovaní šikmýagar-sypký substrát-sypký substrát-vegetatívne inokulum. Všetky materiály sd deponované pri5 °C, šikmé agary a jačmenné konzervy po dobu 4 mesiacov. Genealogická schéma kmeňa Acremonium chrysogenum CCM F-729 Cephalosporium acremonium WIS OP-163 N-nitrozometylbiuret . Izolát 8 c VULM OV světlo 7 Izolát 188 VULM'/»CCM F-729/ Schéma č. 1 PREDMET VYNALEZU Kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenum /Thirum et Sukap/W. Gams CCM F-729 produku-jdci kyselinu 7-/D-5-amino-5-karboxy-n-valeramido/-3-acetoxymetyl-3-cefem-4-karboxylovdtzv. cefalosporín C vzorca 1. NH, ch2ococh3

   /1/