CS245343B1

CS245343B1 - Sposob přípravy p-difenol oxidázy

Info

Publication number: CS245343B1
Application number: CS851880A
Authority: CS
Inventors: Rudolf Apalovic; Jiri Zemek
Original assignee: Rudolf Apalovic; Jiri Zemek
Priority date: 1985-03-18
Filing date: 1985-03-18
Publication date: 1986-09-18
Also published as: CS188085A1

Description

(54) Sposob přípravy p-difenol oxidázy í 2

Vynález sa týká sposobu přípravy enzýmu p-difenol oxidázy.

Vynález rieši sposob přípravy p-difenol oxidázy kultiváciou drevokaznej huby Fomes fomentarus. Uvedeného účelu sa dosiahne tým, že izolovaný kmeň Fomes fomentarus sa kultivuje submerzne na pode s D-glukózou, kazeínom minerálnymi látkami, tiamínom, xylidínom alebo o-toluidínom v teplotnom rozmedzí 20 až 40 °C.

Vynález má využitie v medicíně, klinickej biochémii a toxikologii a v analytickej chemii pri identifikácii škodlivin v prostředí.

Vynález sa týká spůsobu přípravy p-difenol oxidázy (p-difenol oxigen oxidoreduktáza EC 1.10,3.2).

Pri príprave p-difenol oxidázy sa vychádza obyčajne z mikroskopických húb, napr. z Aureobasidium pullulans (Růsch R., Liese W., Berndt H.: Arch. Mikrobiol. 67, 28 /1969/) alebo Schizophyllum commune (Leonard P. j., Phillips L. E.: J. Bacteriol. 7, /1973/). Pri izolácii a purifikácii uvedeného enzýmu sa obyčajne frakcionujú bielkovlny získané z fermentačnej půdy zrážaním síranom amónnym, organickými rozpúšťadlami alebo za použitia afinitných technik. Nevýhodou uvedených postupov je ich zdíhavosť, náročnost na použité materiály, predovšetkým v případe pripravy afinantov.

Uvedené nedostatky rieši postup podlá vynálezu, využívajúci k príprave p-difenol oxidázy drevokazné huby druhu Fomes, ktorý patří medzi Basidiomycetes. Podstata vynálezu spočívá v tom, že drevokazná huba Fomes fomentaru (Linne ex Fries) Kickx sa kultivuje submerzne na pode zloženej z 10 až 30 hmot. dielov D-glukózy, 1 až 3 dielov kazeínu, 0,5 až 12 dielov KH2PO4, 0,1 až 0,3 diela NaHžPCU. 12 H2O, 0,1 až 1 diel MgSOá, 0,001 až 0,003 diela CuSO4, 0,0005 až 0,002 diela ZnSO4, 0,0005 až 0,002 diela MnSOá, 0,005 až 0,015 diela FeSO4, 0,005 až 0,015 diela CaCl2, 0,00002 až 0,00008 diela tlamínu, 0,1 až 0,001 diela xylidínu alebo o-toluidínu v 1 000 dieloch vody, pričom kultivácia prebieha pri 20 až 40 °C po dobu 250 až 750 hodin za súčasného prevzdušňovania vháňaním vzduchu rýchlosťou 0,05 až 0,2 objemového diela za minútu a v následnej izolácii uvofnenej p-difenol oxidázy ako jedinej extracelulárnej bielkoviny vysolením zrážaním organickými rozpúšťadlami, alebo inými známými postupmi.

Výhodou navrhovaného postupu je jednoduchost pripravy p-difenol oxidázy ako aj skutočnosť, že na kultivačnej póde o horeuvedenom zložení huba Fomes fomentarus uvolňuje ako jedinú enzýmaticky aktívnu bielkovinu předmětný enzým do extracelulárneho prostredia.

Příklad 1

Drevokazná huba Fomes fomentarus (Linne ex Fries) Kickx kmeň 191 uložený v Zbierke kultúr drevokazných húb Štátneho drevárskeho výskumného ústavu v Bratislavě sa kultivovala v desiatich Erlenmayerových bankách (objem 2 1), obsahujúcich 400 ml kultivačnej půdy zloženej z 10 g D-glukózy, 1 g kazeínu, 0,5 g KH2PO4, 0,1 g NaH2PO4.

. 12 H2O, 0,1 g MgSOá, 1 mg CuSO4, 5 mg ZnSO4, 0,5 mg MnSO4, 5 mg FeSO4, 5 mg CaCl2, 0,02 mg tiamínu a 0,001 g o-toluidínu v 1 000 ml vody po dobu 750 hodin pri teplote 20 °C na kultivačnom zariadení o frekvencii 20 kmitov za minútu a amplitúde 25 cm.

Po oddělení mycélia centrifugáciou pri

500 g po dobu 15 minút sa získaný supernatant zrážal síranom amónnym do nasýtenia roztoku. Získaná zrazenina, odpovedajúca 4 1 kultivačnej půdy obsahovala 1,2 g bielkoviny p-difenol oxidázy o aktivitě 24 ,ukat. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa použil kmeň Fomes fomentarus 22 rovnakej zbierky, ako je uvedené v příklade 1, ktoré sa kultivoval submerzne vo fermentore o objeme 20 1, na kultivačnej póde o zložení 30 g D-glukózy, 3 g kazeínu, g KH2PO4, 0,3 g Na2HPO4.12 H2O, 1 gram MgSO4, 3 mg CuSOá, 2 mg ZnSOá, 2 mg MnSO4, 15 mg FeSO4, 15 mg CaCl2, 0,08 mg tiamínu a 0,1 g xylidínu v 1 litri půdy pri 40 °C, po dobu 250 hodin za prevzdušňovania rýchlosťou 0,05 1 vzduchu za minútu na 1 liter kultivačnej půdy.

Po odstránení biomasy sa získaný supernatant v množstve 20 1 zrážal 96 % etanolom v objemovom pomere 1: 5. Získaná zrazenina obsahovala 6,5 g bielkoviny, obsahujúcej výlučné p-difenol oxidázu o aktivitě 200 ^kat.

Příklad 3

Postupuje sa ako v příklade 2 s tým rozdielom, že sa kultivačná půda prevzdušňuje sterílným vzduchom o rýchlosti 0,2 1 na 1 liter kultivačnej půdy za minútu. Po spracovaní, tak ako je uvedené v příklade 2 sa získalo 6,4 g bielkoviny, obsahujúcej výlučné p-dlfenol oxidázu o aktivitě 216 ^kat.

Vynález může nájsť široké uplatnenie v medicíně, klinickej biochémii a toxikológii a v analytlckej chémii pri identifikácii škodlivin v životnom prostředí.

Claims

PREDMET

Spósob přípravy p-difenol oxidázy vyznačený tým, že drevokazná huba Fomes fomentarus (Linne ex Fries) Kickx sa kultivuje submerzne na pode zloženej z 10 až 30 hmot. dielov D-glukózy, 1 až 3 dielov kazeínu, 0,5 až 2 dielov KH2PO4, 0,1 až 0,3 diela NaHPCU.

. 12 H2O, 0,1 až 1 diel MgSCU, 0,001 až 0,003 diela CuSOá, 0,0005 až 0,002 diela ZnSOd, 0,0005 až 0,002 diela MnSCU, 0,005 až 0,015 diela FeSCH, 0,005 až 0,015 diela CaCl2, 0,00002 až 0,00008 diela tiamínu a 0,001 až

VYNÁLEZU

0,1 diela xylidínu alebo o-toluidínu v 1 000 dieloch vody, pričom kultivácia prebieha pri 20 až 40 °C po dobu 250 až 750 hodin za súčasného prevzdušňovania vháňaním vzduchu rýchlosťou 0,05 až 0,2 objemového diela za minútu a v následnej izolácii uvolnenej p-difenol oxidázy, ako jedinej extracelulárnej bielkoviny vysolením, zrážaním organickými rozpúšťadlami alebo inými běžnými postupmi.