CS250361B1

CS250361B1 - Microorganism strain Corynebacterium glutamicum CCM 3867

Info

Publication number: CS250361B1
Application number: CS458185A
Authority: CS
Inventors: Jiri Plachy; Stanislav Ulbert; Karel Culik; Michal Bucko; Alexander Hano; Miroslav Barta; Emil Miklas
Original assignee: Jiri Plachy; Stanislav Ulbert; Karel Culik; Michal Bucko; Alexander Hano; Miroslav Barta; Emil Miklas
Priority date: 1985-06-21
Filing date: 1985-06-21
Publication date: 1987-04-16

Abstract

Řešení se týká kmene mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3867, dependentní na homoserin a resistentní k S-(2- -aminoethylj-L-cysteinu a chlorlysinu, produkující lysin.The solution relates to a strain of the microorganism Corynebacterium glutamicum CCM 3867, dependent on homoserine and resistant to S-(2- -aminoethyl)-L-cysteine and chlorlysine, producing lysine.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu druhu Corynebácterium glutamicum, dependentního ha homoserin a resistentního k analogům lysinu, který v médiu s vhodným zdrojem uhlíku a dusíku hromadil za aerobních podmínek a při neutrálním pH vysoká množství lysinu.The invention relates to a strain of the microorganism Corynebacterium glutamicum, dependent on homoserine and resistant to lysine analogues, which accumulated high amounts of lysine under aerobic conditions and at neutral pH in a medium with a suitable source of carbon and nitrogen.

Vhodnými producenty lysinu jsou mutanty koryneformních bakterií, především mutanty rodů Brevibacterium a Corynebacterium. Z těchto mutant se osvědčily mutanty regulační a mutanty současně regulační a auxotrofní, selektované jako mutanty resistentní k analogům aminokyselin a zároveň dependentní na aminokyseliny. Významná množství lysinu hromadily v prostředí některé mutanty Brevibacterium flavum resistentní k analogu lysinu, tj. k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu (Sáno, K.-Shiio, I.: JJ. Gen. Appl. Microbiol. 16, 373. 1970 j. Mutanty Corynebacterium glutamicum, vyznačující se kromě resistence k S-( 2-aminoethyl )-L-cysteinu také dependencí na takové aminokyseliny jako je serin, prolin, leucin a alanin, hromadily v médiu 30 až 40 g/1 lysinu (západoněmecký patent 2 321 461, 1973). Mutanta Brevibacterium lactofermentum současně resistentní k S-(2-aminoethyl )-L-cysteinu a k -amino-hydroxyvalerové kyselině hromadila v médiu 32 g/1 lysinu (Tosaka, O. Takinami, K. Hirose, Y.: Agr. Biol. Chem. 42, 745, 1978 j.Suitable producers of lysine are mutants of coryneform bacteria, especially mutants of the genera Brevibacterium and Corynebacterium. Of these mutants, regulatory mutants and mutants simultaneously regulatory and auxotrophic, selected as mutants resistant to amino acid analogues and at the same time dependent on amino acids, have proven to be effective. Significant amounts of lysine were accumulated in the medium by some Brevibacterium flavum mutants resistant to the lysine analogue, i.e. to S-(2-aminoethyl)-L-cysteine (Sáno, K.-Shiio, I.: JJ. Gen. Appl. Microbiol. 16, 373. 1970 j. Corynebacterium glutamicum mutants, characterized in addition to resistance to S-(2-aminoethyl)-L-cysteine also by dependence on amino acids such as serine, proline, leucine and alanine, accumulated 30 to 40 g/l lysine in the medium (West German patent 2 321 461, 1973). The Brevibacterium lactofermentum mutant simultaneously resistant to S-(2-aminoethyl)-L-cysteine and -amino-hydroxyvaleric acid accumulated 32 g/l lysine in the medium (Tosaka, O. Takinami, K. Hirose, Y.: Agr. Biol. Chem. 42, 745, 1978 j.

Produkcí lysinu převyšuje dosud známé umíněné kmeny kmen Corynebácterium glutamicum, uložený v Československé sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyně v Brně, třída Obránců míru 10, pod označením CCM 3867, který je předmětem vynálezu.The production of lysine exceeds the previously known stubborn strains of the strain Corynebacterium glutamicum, stored in the Czechoslovak Collection of Microorganisms of the J. E. Purkyně University in Brno, class Obránců míru 10, under the designation CCM 3867, which is the subject of the invention.

Autoři vynálezu se rovněž zabývali způsobem šlechtění mikroorganismu Corynebacterium glutamicum, kterým se nový kmen získává. Podstata šlechtění spočívá v tom, že se na kulturu výchozího kmene mikroorganismu působí roztokem 0,05 M ethylmethansulfonátu po dobu 18 hodin, načež se izolují získané mutanty, vyrostlé po kultivaci v tekutém kompletním médiu, na minimálním tuhém médiu doplněném 0,001 mg/ /ml L-homoserinu a 1 mg/ml chlorlysinu. Chlorlysln, tj. 2,6-diamino-4-chlorhexankarbonová kyselina, je analog lysinu, který má vodíkový atom v poloze 4 nahrazen atomem chloru. S výhodou se používá 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2).The authors of the invention also dealt with a method of breeding the microorganism Corynebacterium glutamicum, by which a new strain is obtained. The essence of breeding consists in treating the culture of the initial strain of the microorganism with a solution of 0.05 M ethyl methanesulfonate for 18 hours, after which the obtained mutants are isolated, grown after cultivation in a liquid complete medium, on a minimal solid medium supplemented with 0.001 mg/ /ml L-homoserine and 1 mg/ml chlorlysine. Chlorlysin, i.e. 2,6-diamino-4-chlorohexanecarboxylic acid, is an analogue of lysine, in which the hydrogen atom in position 4 is replaced by a chlorine atom. Preferably, a 0.05 M solution of ethyl methanesulfonate in phosphate buffer (pH 7.2) is used.

Hlavní výhodou nového kmene podle vynálezu je zvýšení produkce lysinu, podmíněné dependencí na homoserin a resistencí k dvěma analogům lysinu, tj. k S-( 2-aminoethyl )-L-cysteinu a k chlorlysinu. Při kultivaci nového kmene v produkčním médiu se sacharózou a melasou nebo jen s melasou jako zdroji uhlíku, s kyselým hydrolyzátem arašídové mouky, kukuřičným výluhem a síranem amonným jako zdroji dusíku a s minerálními solemi v baňkách inkubovaných na rotační třepačce při 28 °C a pH udržovaném vodným roztokem čpavku na hodnotě 7,0 lze dosáhnout po 4-denní kultivaci produkce L-lysinu 52 g/1 (v médiu se sacharózou a melasou] a 45 g/1 (v médiu s melasou).The main advantage of the new strain according to the invention is the increase in lysine production, conditioned by the dependence on homoserine and resistance to two lysine analogues, i.e. to S-(2-aminoethyl)-L-cysteine and to chlorlysine. When cultivating the new strain in a production medium with sucrose and molasses or only molasses as carbon sources, with acid hydrolysate of peanut flour, corn steep liquor and ammonium sulphate as nitrogen sources and with mineral salts in flasks incubated on a rotary shaker at 28 °C and pH maintained at 7.0 with an aqueous ammonia solution, L-lysine production of 52 g/l (in medium with sucrose and molasses) and 45 g/l (in medium with molasses) can be achieved after 4 days of cultivation.

Nový kmen Corynebácterium glutamicum CCM 3867 je charakterizován následujícími morfologicko-kultivačními a fyziologickými vlastnostmi:The new strain Corynebacterium glutamicum CCM 3867 is characterized by the following morphological, cultural and physiological properties:

Grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující kokky až krátké tyčinky, vyskytující se jednotlivě, v párech i v nepravidelných shlucích.Gram-positive, non-motile, non-spore forming cocci to short rods, occurring singly, in pairs and in irregular clusters.

Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, hladké, lesklé, krémově bílé kolonie, s rovnými okraji.On meat peptone agar, it forms round, smooth, shiny, creamy white colonies with straight edges.

Na masopeptonovém šikém agaru vytváří intenzívní bílý nárůst po celém povrchu agaru, k pigmentaci nedochází.On massopeptone slant agar, it forms an intense white growth over the entire surface of the agar, pigmentation does not occur.

Při růstu v bujónu dochází k tvorbě zákalu a sedimentu, blanka se netvoří.When growing in broth, turbidity and sediment are formed, but no blanch is formed.

Na krevním agaru tvoří kulaté, hladké, šedé kolonie, s rovnými okraji, nehemolysující.On blood agar, they form round, smooth, gray colonies with straight edges, non-hemolyzing.

Fyziologické vlastnosti:Physiological properties:

Optimální teplota: 28 až 30 °C.Optimal temperature: 28 to 30 °C.

Optimální pH: 7,0 až 7,2.Optimal pH: 7.0 to 7.2.

Aerobní organismus.Aerobic organism.

Želatinu neztekucuje.It does not liquefy gelatin.

Lakmusové mléko odbarvuje, ale nesráží. Glukózu, fruktózu a sacharózu zkvašuje. Škrob hydrolyzuje slabě.It decolorizes litmus milk, but does not precipitate. It ferments glucose, fructose and sucrose. It hydrolyzes starch weakly.

Celulózu nerozkládá.It does not break down cellulose.

Dusičnany netvoří.It does not form nitrates.

Sirovodík netvoří.Hydrogen sulfide does not form.

Indol netvoří.It does not form indole.

Test na katalázu: pozitivní.Catalase test: positive.

Test na methylenovou modř: negativní. Voges-Proskauerův test: negativní.Methylene blue test: negative. Voges-Proskauer test: negative.

K růstu vyžaduje z vitaminů biotin a z aminokyselin homoserin.For growth, it requires the vitamins biotin and the amino acids homoserine.

Při způsobu šlechtění podle vynálezu se postupuje tak, že se výchozí kmen Corynebacterium glutamicum CCM 3287, resistentní k S-( 2-aminoethyl J-L-cysteinu a dependentní na homoserin, nechá submersně růst 24 hodin v kompletním médiu a buněčná suspenze se po promytí fosfátovým pufrem s hodnotou pH 7,2 vystaví působení mutagénu, v tomto případě 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Po této operaci se promytou suspenzí očkuje baňka s kompletním médiem, která se inkubuje 24 hodin. Promytou suspenzí vhodně naředěnou se očkují plotny s minimálním médiem doplněným homoserinem a chlorlysinem. Mutanty resistentní k chlorlysinu se vyočkují na šikmé masopeptonové agary. Isoláty vyrostlé na agarech se po otestování stupně resistence k S-( 2-aminoethyl)-L-cysteinu a k chlorlysinu a dependence na homoserin produkčně hodnotí v médiích se sacharózou a melasou nebo jen s melasou jako zdrojem uhlíku.In the breeding method according to the invention, the starting strain Corynebacterium glutamicum CCM 3287, resistant to S-( 2-aminoethyl J-L-cysteine and dependent on homoserine, is allowed to grow submerged for 24 hours in complete medium and the cell suspension is exposed to a mutagen, in this case a 0.05 M solution of ethyl methanesulfonate in phosphate buffer (pH 7.2), after washing with phosphate buffer (pH 7.2). After this operation, a flask with complete medium is inoculated with the washed suspension and incubated for 24 hours. Plates with minimal medium supplemented with homoserine and chlorlysine are inoculated with the washed suspension, suitably diluted. Mutants resistant to chlorlysine are inoculated onto massopeptone agar slants. Isolates grown on agars are tested for their degree of resistance to S-( 2-aminoethyl)-L-cysteine and to chlorlysine and dependence on homoserine production is evaluated in media with sucrose and molasses or with molasses alone as a carbon source.

Podrobnosti vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení:The details of the invention result from the following exemplary embodiments:

PřikladlExample

Mikroorganismem Corynebacterium glutamicum CCM 3287 se očkuje 60 ml kompletního média v 500 ml varné baňce. Složení kompletního média je následující:Inoculate 60 ml of complete medium in a 500 ml boiling flask with the microorganism Corynebacterium glutamicum CCM 3287. The composition of the complete medium is as follows:

glukóza 0,5 % hydrolyzát kaseinu 1,0 kvasničný extrakt 0,5glucose 0.5% casein hydrolyzate 1.0 yeast extract 0.5

KH2PO4 0,3KH2PO4 0.3

K2HPO4 0,1 roztok solí 1 ml/1 000 ml média (Roztok solí je roztok 0,5 g FeSO4.7H2O a 0,5 g MnSOá. 4ΗϊΟ ve 100 ml vody).K2HPO4 0.1 salt solution 1 ml/1000 ml medium (The salt solution is a solution of 0.5 g FeSO4.7H2O and 0.5 g MnSOá. 4ΗϊΟ in 100 ml water).

Zaočkovaná baňka se inkubuje na rotační třepačce (frekvence otáček — 3,7, výstředník — 25 mm) 24 h při 28°C. Buněčná suspenze se potom 2X promyje fosfátovým pufrem (pH 7,2) a po promytí se vystaví 18 hodinovému působení 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Po aplikaci mutagénu se suspenze 2X promyje sterilní destilovanou vodou a 5% (obj.) suspenze se očkuje 500 ml varná baňka se 60 ml kompletního média, která se inkubuje 24 h při 2i8 °C na rotační třepačce. Buněčná suspenze se 2X promyje sterilní destilovanou vodou a vhodně naředěnou suspenzí se očkují plotny s minimálním médiem doplněným 0,001 mg/ml a 1 mg/The inoculated flask is incubated on a rotary shaker (speed — 3.7, eccentric — 25 mm) for 24 h at 28°C. The cell suspension is then washed 2X with phosphate buffer (pH 7.2) and after washing is exposed to 18 h of 0.05 M ethyl methanesulfonate solution in phosphate buffer (pH 7.2). After application of the mutagen, the suspension is washed 2X with sterile distilled water and 5% (v/v) of the suspension is inoculated into a 500 ml boiling flask with 60 ml of complete medium, which is incubated for 24 h at 2i8 °C on a rotary shaker. The cell suspension is washed 2X with sterile distilled water and the appropriately diluted suspension is inoculated onto plates with minimal medium supplemented with 0.001 mg/ml and 1 mg/

/ml chlorlysinu. /ml chlorlysine. Složení minimálního mé- Composition of the minimum me- melasa molasses 25,0 % 25.0% dia je následující: dia is as follows: hydrolyzát arašídové mouky peanut flour hydrolysate 18,0% (obj.) 18.0% (vol.) kukuřičný výluh corn syrup 1,5 1.5 glukóza glucose 0,1 % 0.1% (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 1,5 1.5 citran sodný sodium citrate 0,04 0.04 KH2PO4 KH2PO4 0,2 0.2 KH2PO4 KH2PO4 0,7 0.7 MgSO4.7HzO MgSO4.7H2O 0,03 0.03 K2HPO4 K2HPO4 0,2 0.2 CaCOs CaCO 2,0 2.0 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 0,1 0.1 FeSOá.7HaO FeSOá.7HaO 0,002 0.002 MgSOá,. 7H2O MgSOá,. 7H2O 0,01 0.01 MnSCH.4H2O MnSCH.4H2O 0,002 0.002 roztok biotinu biotin solution 2 mg/1 000 ml 2mg/1000ml biotin (technický) biotin (technical) 0,00005 0.00005 roztok solí salt solution 1 ml/1 000 ml 1ml/1000ml pH pH 7,0 7.0 agar agar 2,5 % 2.5% Během 4denní kultivace se During the 4-day cultivation, pH upravuje pH adjusts (Roztok solí je roztok 0,5 g FeSCh. 7HžO a (The salt solution is a solution of 0.5 g FeSCh. 7HžO a ve 24 hodinových intervalech in 24 hour intervals vodným roz- by the water distributor

0,5 g MnSO4.4H'2O ve 100 ml vody).0.5 g of MnSO4.4H'2O in 100 ml of water).

Mutanty resistentní k chlorlysinu se vyočkují na šikmé masopeptonové agary a isoláty vyrostlé na agarech se jednak testují na dependenci na homoserin a resistenci k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a chlorlysinu, jednak se zjišťuje jejich schopnost produkovat lysin v produkčních médiích se sacharózou a melasou nebo jen s melasou jako zdrojem uhlíku.Chlorlysine-resistant mutants are inoculated onto massopeptone agar slants and isolates grown on the agars are tested for their dependence on homoserine and resistance to S-(2-aminoethyl)-L-cysteine and chlorlysine, as well as their ability to produce lysine in production media with sucrose and molasses or with molasses alone as a carbon source.

Příklad 2Example 2

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum CCM 3867, 24 h starou, se očkuje 60 mililitrů inokulačního média CSL-B-S v 500 mililitrech varných baňkách. Složení inokulačního média je následující:A 24-hour-old culture of Corynebacterium glutamicum strain CCM 3867 is inoculated into 60 milliliters of CSL-B-S inoculum medium in 500 milliliter boiling flasks. The composition of the inoculum medium is as follows:

sacharóza 2,5 % kukuřičný výluh (65 % sušiny] 3,0 pH 7,0sucrose 2.5% corn syrup (65% solids] 3.0 pH 7.0

Zaočkované baňky se inkubují na rotační třepačce (frekvence otáček — 3,7, výstředník — 25 mm (2(4 h při 28°. 10 % (obj.) inokula se očkují 500 ml varné baňky s 20 mililitrech produkčního média BSM nebo BM-1 následujícího složení:The inoculated flasks are incubated on a rotary shaker (speed frequency — 3.7, eccentric — 25 mm (2(4 h at 28°). 10% (vol.) of the inoculum is inoculated into a 500 ml boiling flask with 20 ml of BSM or BM-1 production medium of the following composition:

Médium BSM:BSM medium:

sacharóza 15,0 % melasa 3,0 hydrolyzát arašídové mouky 22,0% (obj.) kukuřičný výluh 1,5 (NHi)₂SO4 1,5sucrose 15.0% molasses 3.0 peanut flour hydrolysate 22.0% (vol.) corn steep liquor 1.5 (NHi) ₂ SO4 1.5

KH2PO4 0,2KH2PO4 0.2

MgSO4.7HžO 0,03MgSO4.7H2O 0.03

CaCOs 2,0CaCO 2.0

FeSOá. 7H2O 0,002FeSO4. 7H2O 0.002

MnS04.4H2O 0,002 biotin (technický) 0,00005 pH 7,0MnS04.4H2O 0.002 biotin (technical) 0.00005 pH 7.0

Médium BM-1:BM-1 medium:

tokem čpavku na hodnotu 7,0 — 7,2. Na konci kultivace se stanoví obsah lysinu a cukru v kultivační tekutině. Lysin se stanovuje manometricky s použitím dekarboxylasy lysinu a cukr jako glukóza s použitím analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (Beckman, U.S.A.).by ammonia flow to a value of 7.0 — 7.2. At the end of the cultivation, the lysine and sugar content in the culture fluid is determined. Lysine is determined manometrically using lysine decarboxylase and sugar as glucose using a glucose analyzer Glucose Analyzer 2 (Beckman, U.S.A.).

Produkce lysinu po 4 dnech kultivace v médiu BSM činila 52 g/1 a v médiu BM-1Lysine production after 4 days of cultivation in BSM medium was 52 g/l and in BM-1 medium

Claims

A strain of Corynebacterium glutamicum CCM 3867 dependent on homoserine and resistant to S- (2-aminoethyl) -L-cysteine and chlorlysine, producing lysine.