CS252537B1

CS252537B1 - Inaktivovaná vakcína proti neonatálnej koli hnačke teliat

Info

Publication number: CS252537B1
Application number: CS859250A
Authority: CS
Inventors: Ivan Mikula; Juraj Tkacik; Julius Snirc
Original assignee: Ivan Mikula; Juraj Tkacik; Julius Snirc
Priority date: 1985-12-13
Filing date: 1985-12-13
Publication date: 1987-09-17
Also published as: CS925085A1

Abstract

Riešenie sa týká technologickej přípravy inaktivovanej vakcíny proti neonatálnej koli hnačke teliat v rannom postnatálnom období. U ošetřených teliat ihned' po narodení vyvolá stav špecifickej chránenosti s využitím kompetitívnej a lokálnej imunity. Vakcína obsahuje 4 enteropatogénne techno’ogicky za definovaných podmienok stabilně kmene Escherichia coli CCM 3908, CCM 3909, CCM 3910 a CCM 3911, chemicky inaktivované a egalizované v rovnakom objemovom množstve 1 X 1010 až 3 X 1010 v 1 ml vakcíny. Inaktivovaná vakcína je použitelná v imunoprofylaxii koli hlačky teliat, kde signifikantně znižuje morbiditu a mortalitu teliat z titulu tohto infekčného ochorenia.

Description

Riešenie sa týká technologickej přípravy inaktivovanej vakcíny proti neonatálnej koli hnačke teliat v rannom postnatálnom období. U ošetřených teliat ihned' po narodení vyvolá stav špecifickej chránenosti s využitím kompetitívnej a lokálnej imunity. Vakcína obsahuje 4 enteropatogénne techno’ogicky za definovaných podmienok stabilně kmene Escherichia coli CCM 3908, CCM 3909, CCM 3910 a CCM 3911, chemicky inaktivované a egalizované v rovnakom objemovom množstve 1 X 10¹⁰ až 3 X 10¹⁰ v 1 ml vakcíny.

Inaktivovaná vakcína je použitelná v imunoprofylaxii koli hlačky teliat, kde signifikantně znižuje morbiditu a mortalitu teliat z titulu tohto infekčného ochorenia.

252337

Vynález sa týká sposobu výroby inaktivovanej vakcíny proti neonatálnej koli hnačke teliat, ktorá je technologicky připravovaná z kmeňov Escherichia coli K99+, u ktorých počas submerznej kultivácii je optimalizovaná kvantitativná expresia adhezínu testovania na koňských a baraních erytrocytoch, pomocou manózorezistentnej hemag utinácie, ktorú je možné použit pre špeci fickú prevenciu kolienteritíd teliat.

Kmene E. coli izolované z teliat s diagnózou „neonatálna kolienteritída“ produkujú adherenčné antigémy K99⁺, ktoré realizují kolonizáciu tenkého čreva teliat. Expresia kolonizujúcich faktorov je proces regulovaný genetickým materiálom buňky. Mikrobiálně buňky počas rastu in vivo a in vitro vykazujú kvalitatívnu a kvantitatívnu fázová variáciu — ISAACSON a RICHTER: Escherichia coli 987P pilus: Purification and partial characterization, J. Bacteriol. 146, s. 874—889; JONES G. W., ISAACSON R. E.: Proteinaceus bacterial adhesine and their receptors. Brit. Rev. Microbio¹. 10, 1983, s. 229—260.

Pre technologická produkciii efektívnych imunogénov proti uvedenému ochoreniu je zvlášt doležitá kvantitativná fázová variácia produkčných kmeňov E. coli. Tento fenomén in vitro je regulovaný za podmienok submerznej kultivácie, ktoré sú odlišné od podmienok pre kvalitatívnu fázová variáciu. Kvantitativná fázová variácia, ktorá podmieňuje maximálnu produkciu adhezínov, je primárnou podmienkou pre technologická produkciu efektívnych imunogénov použitelných k špecifickej profylaxi! hnačkových ochoreni teliat.

Doterajší stav poznatkov v oblasti bakteriálnej genetiky a etiopatogenity E. coli nevyužíval fenomén kvantitatívnej fázovej variácie v produkcii efektívnych látok použitelných v imunoprofylaxli tohto ochorenia. Využitím tohto fenoménu v predmetnej oblasti zabezpečí synchronizáciu expresie adherenčného antigénu počas ce'ej submerznej produkčnej kultivácie E. coli K99+.

Všeobecným trendom pro produkciu K99 ^!E. coli vakcín je kultivácia produkčných kmeňov v produkčnom médiu, ktorého základnou zložkou je Casamino acids (DIFCOj.

Casamino acids	1,0	g
Dihydrogénfosforečnan
draselný	1,36	g
Hydrogenfosforečnan sodný	10,10	g
Glukóza	1,0	g
Chlorid vápenatý dihydrát	0,0004	O
Síran horečnatý heptahydrát	0,010	g
Chlorid železitý tetrahydrát	0,000135	g
Chlorid horečnatý	0,001	g
Destilovaná voda do 1 000 ml

Autoři experimentálně ověřovali rožne druhy produkčných živných médií, ktoré by zebezpečili maximálnu expresiu adherenčného antigénu. Z hfadiska efektivnosti kvantitatívnej expresie adherenčných antigénov bolo experimentálně dokázané, že autorml vyvinuté nové produkčně médium zaisťuje kvantitativné vyššiu produkciu adhezínu a jeho primárnou zložkou je kyslý kazeínový hydrolyzát.

Autoři vynálezu izolovali a na základe fenotypového prejavu stanovili adherenčné vlastnosti mnohých kmeňov E. coli, ktoré pochádzali z teliat s akútnym výskytom neonatálnej kolienteritídy. Selekciou cielených vlastností izolovaných kmeňov a testováním týchto kmeňov v submerznej kultivácii bo i vybraté štyri kmene, uložené do čs. zbierky mikroorganizmov Univerzita JEP Brno, tl'. Obránců míru 10 pod číslami CCM 3908, CCM 3909, CCM 3910 a CCM 3911. Uvedené kmene za autor mi definovaných kultivačných podmienok vyhovovali požadovaným parametrom, ktoré boli stanovené pre technologická produkciu efektívnej vakcíny.

Pre testovanie kvantitatívnej fázy rastu kultúry čo do produkcie adherečných antigénov bola použitá manózorezistentná hemaglutinácia. Pre charakteristiku kvalitatívnej fázy rastu bola autormi použitá sklíčková aglutinácia BRUSH BORDER test a rast na Simons-citrátovom agare s adonitom.

Pre zaistenie pozitivity v týchto reakciách autoři vyvinuli nový druh produkčného média nasledujúceho zloženia:

Kyslý kazeinový hydrolyzát 3—15

Dihydrogenfosforečnan draselný 1,36

Hydrogenfosforečnan sodný 10,10

Glukóza 0,0—1,0

Chlorid vápenatý dihydrát 0,004

Síran horečnatý heptahydrát 0,10

Chlorid železitý sextahydrát 0,000135

Chlorid horečnatý tetrahydrát 0,001

Destilovaná voda do 1 000 ml g

Q o

pg g

g g

Po ukončení laboratórnych ověřovacích experimentov bola připravená perorálna, chemicky inaktivovaná E. coli K99⁺ vakcína, ktorú autoři testovali v praktických chovatelských podmienkach. Vakcinácia bo a vykonaná v mesiacoch februát, marec a apríl 1985. Celkove bolo vakcinovaných 294 teliat. Ako kontrola slúžila štatistika z mesiacov december 1984 a január 1985. Úhyn teliat po započatí vakcinácie bol znížený o

19,5 %, počet diagnostikovanej hnačky klesol o 50,2 %, pričom nebola diagnostikovaná koli hnačka a pokles mortality bol 71,8 pere.

Z uvedeného vyplývá, že vynález najde široké uplatnenie v chovoch hovadzieho dobytka pri znižovaní výskytu neonatálnych kolieneritíd. Aplikácia tohto preparátu je jednoduchá, nakolko je možné vakcínu podávat v kolostre, připadne v mlieku.

5 2 5 3 7 β

Příklad 1

Enteropatogénny kmeň Escherichia coli CCM 3908 sa kultivuje v 300 ml Erlenmayerových bankách s obsahom 20 ml sterilněho média, ktorého zloženie je na str. 2 a ktoré obsahuje 0,5 % kyslého kazeínového hydrolyzátu a je bez glukózy. Následná inkubácia prebleha 4 hod. pri 37 °C za intenzívneho miešania. Po tejto inkubácii objem 20 mi kultúry prenesieme do 4 000 ml Erlenraayerovej banky s obsahom 300 ml steriluého média a inkubujeme 3 hod. pri 37 °C za intenzívneho miešania. Takto připravená subkuitúru použijeme na inokuláciu fermentora v pomere 300 ml subkultúry na 7 litrov sterilného média vyššie uvedeného. Submerzná kultivácia prebieba pri 37 °C za stálého miešania 600 ot/min. a aretácie sterilným vzducliom 8 1/min. Počas 8-hodinovej kultivácie sú odoherané vzorky kultúry pre testáciu bakteriálnej sterility, pH hodnoty, denzity a detekcie adherečného antigénu. Výsledná bakteriálna masa nesraie obsahovat žiadne kontaminuj ňce mikroorganizmy, s výslednou denzitou 1,0 meranou na Spekole oproti referenčnej vzorke 540 nm s pozitívnou aglutinačnou reakciou s monošpecifickým K99 ⁺ antisérom.

Bakteriálna kultúru chemicky inaktivujeme přidáním 5 % vodného roztoku formaldehydu tak, aby výsledná koncentrácia bola 0,050 až 0,090 g na 100 ml. Inaktivovaná kultúru egalizujeme tak, aby vo vakcíne bol zastúpený každý kmeň v rovnakom objeme. Výsledná koncentrácia inaktivovaných mikroorganizmov v egalizovanej bakteriálnej kultuře je 1—3 X 10¹⁰.

Výsledná vakcína nesmie obsahovat cudziu bakteriálna a pliesňovú mikroflóru a je neškodná pre myš po perorálnej vakeinácii 0,5 ml vakcíny. 20-násobné riedenie vakcíny musí vykazovať pozitivnu aglutinačnú reakciu s monošpecifickým K99⁺ antisérom.

Příklad 2

Enteropatogénny kmeň Escherichia co i CCM 3911 bol kultivovaný v 300 ml Erlenmayerových bankách s obsahom 20 ml síerilného média, ktorého zloženie je na str. 2 a ktoré obsahuje 1,5 % kyslého kazeínového hydrolyzátu a 0,1 % glukózy. Ďalšia technologická příprava a spracovanie biomasy uvedeného kmeňa je analogické ako sa udává v příklade 1.

Příklad 3

Enteropatogénny kmeň Escherichia coli CCM 391.0 bol kultivovaný v 300 m! Erlenmayerových bankách s obsahom 20 ml sterilného média, ktorého zloženie je na straně 2 a ktoré obsahuje 0,5 % kyslého kazeínového hydrolyzátu a 0,1 % glukózy. Ďalšia technologická příprava a spracovanie biomasy uvedeného kmeňa je analogické ako sa udává v příklade 1.

Příklad 4

Enteropatogénny kmeň Escherichia coli CCM 3909 bol kultivovaný v 300 ml Erlenmayerových bankách s obsahom 20 ml sterfného média, ktorého zloženie je na straně 2 a ktoré obsahuje 0,3 % kyslého kazeínového hydrolyzátu a 0,1 % glukózy. Ďalšia technologická příprava a spracovanie biomasy uvedeného kmeňa je analogické ako sa udává v příklade 1.

Claims

PREDMET

1. Inaktivovaná vakcína proti neonatálnej koli hnačke teliat, vyznačujúca sa tým. že obsahuje 1 X 10¹⁰ až 3 X 10^í0 inaktivovaných kmeňov mikroorganizmov Escherichia coli CCM 3908, CCM 3909, CCM 3910, CCM 3911 v 1 ml vakcíny.
2. Inaktivovaná vakcína podfa bodu 1, sa

VYNALEZU vyznačuje tým, že kmene mikroorganizmov vo vakcíne sú minimálně z 90 % opilusované.
3. Inaktivovaná vakcína podfa bodov 1 a 2, vyznačujúca sa tým, že jednotlivé kmene Escherichia coli sú vo vakcíne zastúpené v rovnakom objemovom pomere.