CS254050B1 - Sposob přípravy acetyldigoxinu - Google Patents

Description

. Vynález sa týká spůsobu přípravy acetyldigoxinu selektívnou mikrobiálnou deglukozidáciou lanatozidu C pomocou mikroorganizmov Penicillium vermiculatum Dang. CCM F-276 alebo Aspergillus niger CCM F-330.

V predkladanom riešení sa uvádza sposob přípravy acetyldigoxinu, ktorého podstata spočívá v tom, že sa do živnej pody obsahujúcej zdroj uhlíka, organického a anorganického dusíka, naočkovanej kultúrou P. vermiculatum přidá lanatozid C (100 až 500 mg . L^-1) rozpuštěný v polárnom rozpúšťadle, s výhodou v dimetylformamide a kultivuje sa 8—24 hodin pri teplote 26—30 stupňov Celzia za stálého miešania a prevzdušňovania. Po transformácii sa filtrát půdy, ktorá obsahuje acetyldigoxin extrahuje chloroformom, získaný extrakt sa po vysušení, za zníženého tlaku zbaví rozpúšťadla a surový produkt sa rekryštalizuje zo zmesi rozpúšťadiel benzén : etanol (3 : 1). Na extrakciu látky z filtrátu možno takisto použit ďalšie chlorované uhlovodíky s počtom uhlíkov 1—5 s výhodou dichlórmetán alebo estery kyseliny octovej s výhodou octan etylnatý.

Acetyldigoxin je biela kryštalická látka, u ktorej holi namerané nasledujúce hodnoty: t. t. 203—206°C (rozklad), pre sumárny vzorec C43H66O15 823,0, vypočítané: C 62,75 pere. H 8,08 %, nájdené C 62,59 %, H 7,96 %. IC (KBr) v cm⁴: 3 410, 2 966, 2 943, 1741, 1720, 1 631, 1457, 1 347. Kryštalická látka poskytla pri tenkovrstevnej chromatografii na Silufole v sústavách benzén : etanol : : voda (30 : 10 : 0,3] jednu škvrnu s hodnotami Rf 0,41 a v sústave octan etylnatý : : metanol : voda (79 : 19 : 11) škvrnu s Rf 0,85. Důkaz aglykonu sa robil po hydrolýze získanej látky s kyselinou sírovou. Pri tenkovrstevnej chromatografii na Silufole^R v sústave benzén : octan etylnatý (1:1) poskytla látka jednu škvrnu s Rf 0,28 a v sústave octan etylnatý taktiež jednu škvrnu s Rf 0,11, ktoré boli identické so škvrnami získanými rovnakým postupom zo štandardu acetyldigoxinu.

V pokusoch použité kmene P. vermiculatum aj A. niger transformujú přidaný lanatozid C velmi selektívne, bez dalších sprievodných metabolitov takmer kvantitativné za 8—24 hodin.

V nasledujúcich príkladoch sú uvedené spůsoby transformácie lanatozidu C na acetyldigoxin.

Příklad 1

Do 25 varných baniek o objeme 500 ml připraví sa půda nasledujúceho zloženia: (g . L^-1) glukóza 20, kvasničný extrakt 5, sójová múka 5, NaCl 5, KH2PO4 5, vodovodná voda 1 liter, pH 6,5-7,0. Póda sa sterilizovala 15 minút pri 120 °C a po ochladení sa naočkovala 15 ml vegetatívneho inokula Penicillium vermiculatum. Kultivácia pri teplote 28 °C na rotačnej trepačke s 220 ot . . min^-1. Po 24 hodinovej kultivácii sa do každej banky přidalo 30 mg lanatozidu C rozpuštěného v 0,3 ml dimetylformamidu. Celkom sa v pokuse použilo 720 mg lanatozidu C. Transformácia sa ukončila v 20. hodině kultivácle, kedy bol přidaný substrát takmer kvantitativné transformovaný. Mycélium použitého mikroorganizmu sa oddělilo filtráciou, získaný filtrát (1,900 ml, pH

6.1) , sa extrahoval trikrát za sebou chloroformom (v pomere 2 : 1), za neustálého miešania po dobu 15—20 minút, pri laboratorně]' teplote. Získané extrakty sa spojili, bezvodým síranom sodným výsušili a za zníženého tlaku zahustili. Po zahuštění a ochladení na +4°C sa vylúčil acetyldigoxin, ktorý sa oddělil filtráciou a premyl dietyléterom. Po přidaní dietyléteru, ktorý sa získal po premytí prvého podielu surového produktu k matečným lúhom, vypadla ďalšia časť acetyldigoxinu. Získané surové produkty sa spojili a rekryštalizovali zo zmesi rozpúšťadiel chloroform : benzén (1 : 3). Celkom sa získalo 420 mg čistého acetyldigoxinu, čo představuje výťažok 62 % vzhťadom na použitý substrát.

Příklad 2

V pokuse sa použila půda rovnakého zloženia ako v pokuse 1. Po 24 hodinovej kultivácii sa do půdy přidalo 60 mg lanatozidu C na 100 ml půdy. Transformácia sa ukončila v 24 hodině. Číry filtrát (1,800 ml, pH

6.2) sa trikrát za sebou extrahoval octanom etylnatým (v pomere 2:1). Spojené extrakty po vysušení bezvodým síranom sodným sa zahustili a po ochladení na +4 °C sa vylúčil acetyldigoxin. K matečným lúhom sa přidal dvojnásobný objem dietyléteru, čím sa získal další podiel acetyldigoxinu. Surové produkty sa rekryštalizovali zo zmesi octan etylnatý : benzén (3 : 1). Celkom sa získalo 510 mg čistého acetyldigoxinu, čo představuje 63,7 % výťažok, vzhladom k použitému substrátu.

Příklad 3

Postup biotransformácie lanatozidu C bol rovnaký ako je uvedený v příklade 1, ale vytvořený acetyldigoxin sa extrahoval dichlórmetánom. Výťažok vzhladom k použitému substrátu bol 57,2 °/o.

Příklad 4

Postup biotransformácie bol rovnaký ako je uvedený v příklade 1, ale ako mikroorganizmus sa použil kmen Aspergillus niger

CCM F-330. Výťažok acetyldigoxinu vzhladom k použitému substrátu bol 48,7 %.

PREDMET

1. Sposob přípravy acetyldigoxinu vyznačujúci sa tým, že sa do tekutého média obsahujúceho zdroj uhlíka, organického a anorganického dusíka naočkuje kultúra Penicillium vermiculatum Dang. CCM F-276 alebo Aspergillus niger CCM F-330, přidá sa 10 až 60 mg lanatozidu C rozpuštěného v polárnom rozpúšťadle na 100 ml pódy, zmes sa kultivuje pri teplote 26 až 30 °C za stálého miešania a vzdušnenia po dobu 12 až 24 h, přefiltruje sa, získaný filtrát sa extrahuje organickými rozpúšťadlami, extrakt sa po vysušení zahustí a zvyšok sa kryštalizuje.

2. Spósob podta bodu 1 vyznačujúci sa

Claims (4)

1. VYNALEZU tým, že ako polárné rozpúšťadlo na rozpustenie lanatozidu C sa použije dimetylformamid.
2. 3. Spósob podfa bodu 1 vyznačujúci sa tým, že filtrát po kultivácii sa extrahuje chlorovanými uhíovodíkmi s počtom uhlíkov 1 až 4, s výhodou chloroformom, alebo estermi kyseliny octovej s alkoholmi s počtom uhlíkov 1 až 3, s výhodou octanom etylnatým.
3. 4. Sposob podlá bodu 1 vyznačujúci sa tým, že zvyšok po odpaření extrahovadla sa krystalizuje zo zmesi chloroform — benzén, alebo octan etylnatý — benzén.