CS254163B1 - Sposob přípravy ohromolytického substrátu na stanovenie /(1-3) glukanázy - Google Patents
Sposob přípravy ohromolytického substrátu na stanovenie /(1-3) glukanázy Download PDFInfo
- Publication number
- CS254163B1 CS254163B1 CS581585A CS581585A CS254163B1 CS 254163 B1 CS254163 B1 CS 254163B1 CS 581585 A CS581585 A CS 581585A CS 581585 A CS581585 A CS 581585A CS 254163 B1 CS254163 B1 CS 254163B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- glucanase
- glucan
- polysaccharide
- weight
- determination
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Účelom riešenia je sposob přípravy chromolytického substrátu na stanovenie beta glukanázy. Uvedeného účelu sa dosiahne tak, že v prvom stupni sa beta (1-3) glukán alkyluje etylénoxidom alebo kyselinou monochlóroctovou v alkalickom prostředí na stupeň substitúcie 0,2 až 0,3 a v druhom stupni sa na alkyl-polysacharid naviaže farbivo dvojsodná sol' kyseliny 8-amíno-5-[3- - (sulfoetylsulfonylJanilíno ] 6-antrachinónsulfonovej v množstve 10 až 12 % hmot. na hmotnost polysacharidu pri teplote 15 až 20 °C a koncentrácii hydroxidu sodného 1,0 až 2,0 % hmotnostných po dobu 2 až 4 hodin. Spésob přípravy chromolytického substrátu na stanovenie beta-glukanázy má použitie v analytike enzýmov, biotechnologii a všade, kde třeba pohotovo merať beta (1-3) glukanázovú enzýmovú aktivitu.
Description
Vynález sa týká sposobu přípravy chromolytického substrátu na stanovenie /3(1-+3) glukanázy, EC 3.2.1.6.
V posledných rokoch osvědčeným sposobom stanovenia polysacharid-hydrolázových enzýmových aktivit je sposob fotokolorimetrický. Spočívá v tom, že s-a enzým nechá reagovat s nerozpustným polysacharidovým gélom, na ktorom je kovalentne viazané vhodné farbivo. Počas hydrolýzy účinkom přítomných příslušných enzýmov polysacharid-hydroláz stává sa chromolytický gél postupné rozpustný, pričom intenzita zafarbenla supernatantu je úměrná aktivitě enzýmu. Pochopitelné, toto platí iba za předpokladu, že polysacharidový chromolytický gél je dokonale přístupný molekule enzýmu a že kovalentne viazané farbivo na polysacharid nemá inhibičný účinok na samotnú enzýmovú reakciu [K. Kenedy: Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry, 29, (1974) str. 350—376]. Sú známe·aj u nás postupy na přípravu róznych polysacharidových chromolytických substrátov Čs. AO 192 210, 203 676, 219 575, 224 156. Jedná sa váčšinou o polysacharidy v prírode najčastejšie sa vyskytujúce a teda najviac výskumne i priemyslovo využívané. Příprava vodorozpustných chromolytických substrátov i vzácnějších polysacharidov je predmetom Čs. AO 237 101.
Je známe, že rožne polysacharidy sa líšia chemickou a nadmolekulovou štruktúrou, ktorá sa musí rešpektovať pri príprave chromolytického substrátu vhodného pre stanovenie príslušnej enzýmovej polysacharid-hvdrolázovej aktivity.
K málo preštudovaným mikrobiálnym polysacharidom patří /3(1-+3) glukán, ktorý je súčasťou buněčných stien kvasinkových mikroorganizmov, z ktorých sa izoluje. Je to polvsacharid nerozpustný vo vodě a velmi málo reaktívny pri následných modifikačných reakciách tak v alkalickom alebo kyslom prostředí. Z uvedených dovodov je priame viazanie farbiva na tento polysacharid nevhodné za účelom přípravy dostatočne citlivého chromolytického substrátu pre stanovenie /3(1-+3] glukanázovej enzýmovej aktivity.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa /3(1-+3) glukán alkylu je etylénoxidom alebo kyselinou monochlóroctovou v alkalickom prostředí na stupeň substitúcie 0,2 až 0,3 a v druhom stupni sa na alkyl-polysacharid naviaže farbivo dvojsodná so! kyseliny 8-amíno-5-[3-(sulfoetylsulf onyl) aniiíno ] 6-antrachinón-sulf onove j v množstve 10 až 12 % hmot. na hmotnost polysacharidu pri teplote 15 až 25 °C a koncentrácii hydroxidu sodného 1,0 až 2,0 % hmot. po dobu 2 až 4 hodin.
Připravený chromolytický gél má napúčací objem 12 až 15 ml/g, čo je dostatočné pre požadovanú citlivost na stanovenie enzýmovej aktivity. Optimálny stupeň substitúcie je pre hydroxyetyl 0,2 a pre karhoxyetyl 0,3.
Pri týchto úrovniach substitúcie má chromolytický gél maximálně výtažky a ešte sa pri vymývaní volného farbiva nerozpúšťa vo vodě. Pri vyšších stupňoch substitúcie sa už rýchlo zvyšuje rozpustnost vo vodě, čím dochádza ku značnej strate chromolytického gélu pri premývaní. Hydroxyetyl-derivát sa lepšie vyfarbuje ako karboxymetyl-derivát, posledný sa však 1'ahšie připravuje.
Výhodou nového postupu přípravy chromolytického gélu /3(1-+3) glukánu je, že umožňuje připravit z tohto málo reaktívneho polysacharidu dostatočne citlivý enzýmový substrát vhodný pre kolorimetrické stanovenie príslušnej enzýmovej aktivity.
Příklad 1
200 g suchého /3(1-+3) glukánu izolovaného z buněčných stien kvasiniek Saccharomyces cerevisiae sa suspenduje v 200 ml etanolu (o koncentrácii 96 % hmot.], v ktorom sa predom rozpustilo 75 ml vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentrácii 600 g. 1_1. Suspenzia sa mieša pri teplote 20 °C po dobu 40 minút a potom sa přidává po častiach 40 g kyseliny monochlóroctovej. Reakčná zmes sa potom postupné vyhrieva na teplotu 55 °C v priebehu 1 hodiny a pri konečnej teplote 55 °C sa reakčná zmes udržuje za stálého miešania celkove 3 hodiny. Potom sa vol'ný hydroxid sodný neutralizuje konc. kyselinou octovou, reakčná zmes sa přefiltruje a na filtri sa nerozpustný karboxymetyl-/3 (1-+3) glukán premýva najprv destilovanou vodou, potom alkoholom a alkohol sa odsaje. Produkt sa suspenduje v 2 litroch hydroxidu sodného o koncentrácii 2 % hmot. a pri teplote 15 °C sa po častiach přidává v priebehu 30 minút farbivo dvojsodná sol' kyseliny 8-amono-5-[3-(sulfoetylsulfonyl j aniiíno ] 6-antrachinónsulfonove j v množstve 20 g. Potom sa do roztoku přidá 100 g octanu sodného a reakčná zmes sa pri teplote 15 až 25 °C mieša 4 hodiny. Po ukončení vyfarbovania sa reakčný roztok zneutralizuje konc. kyselinou octovou, odsaje sa nerozpustný produkt a premýva sa na filtri destilovanou vodou tak dlho, až premývacia voda je bezfarebná. Nakoniec sa voda z produktu vytěsní etanolom a nakoniec sa etanol odpaří vol'ne na vzduchu alebo vo vákuovej sušiarni pri teplote do 60 °C. Vysušený produkt sa vytriedi na sitách a použije sa frakcia s velkosťou častíc medzi 80 až 250 μΐη. Hotový· gél má napúčací objem vo vodě 12 až 15 ml. g-1 a je velmi dobrým substrátom na stanovenie /3(1-+3) glukanázy.
Příklad 2
K 200 g suchého práškového /3(1-+3) glukánu izolovaného z buněčných stien kvasiniek Saccharomyces cerevisiae sa za miešania přidává 200 ml vodného roztoku hydro254 xidu sodného o koncentrácii 20 % hmot. a nechá sa aktivovat po dobu 1 hodiny. Potom sa aktivovaný glukán zaleje v zatvorenom reaktore s 2 litrami acetonu a privádza sa cez ventil postupné 22 ml etylénoxidu. Reakčná zmes sa vyhřeje na 40 °C a pri tejto teplote sa reakčná zmes udržuje 2 hodiny. Po ukončení reakcie sa volný hydroxid sodný v reaktore neutralizuje konc. kyselinou octovou, nerozpustný produkt hydroxyetyl-/3(l-3) glukán sa odfiltruje, premyje
3 vodou, nakoniec etanolom a ďalej sa vyfarbí podlá postupu v příklade 1 s 12 g f.arbiva dvojsodnej soli kyseliny 8-amíno-5-[3- (sulf oetylsulf onyl j anilíno ] 6-antrachinónsulfonovej. Výsledný produkt /3(1-3) glukán s kovalentne viazaným farbivom je velmi dobrým substrátom na stanovenie /3(1-3)glukanázovej enzýmovej aktivity.
Vynález može nájsf široké použitie v analytike enzýmov, biotechnologii pri meraní /3(1-3) glukanázov-ej enzýmovej aktivity.
Claims (1)
- Sposob přípravy chromolytického substrátu na stanovenie ^(l-3)glukanázy, EC 3.2.1,6 vyznačený tým, že v prvom stupni sa /3(1-3) glukán izolovaný z buněčných stien kvasiniek Saccharomyces cerevisiae alkyluje etylénoxidom, alebo kyselinou monochlóroctovou v alkalickom prostředí na stupeň substitúcie 0,2 až 0,3 a v druhom stupni sa na alkyl-polysacharid naviaže farbivo; dvojsodná sol kyseliny 8-amíno-5-[3-(sulfoetylsulf onyl j anilíno ] 6-antrachinónsulf onovej v množstve 10 až 12 % hmot. na hmotnost polysacharidu pri teplote 15 až 25 °C a koncentrácii hydroxidu sodného 1,0 až 2,0 percent hmot. po dobu 2 až 4 hodin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS581585A CS254163B1 (sk) | 1985-08-09 | 1985-08-09 | Sposob přípravy ohromolytického substrátu na stanovenie /(1-3) glukanázy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS581585A CS254163B1 (sk) | 1985-08-09 | 1985-08-09 | Sposob přípravy ohromolytického substrátu na stanovenie /(1-3) glukanázy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS254163B1 true CS254163B1 (sk) | 1988-01-15 |
Family
ID=5403765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS581585A CS254163B1 (sk) | 1985-08-09 | 1985-08-09 | Sposob přípravy ohromolytického substrátu na stanovenie /(1-3) glukanázy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS254163B1 (sk) |
-
1985
- 1985-08-09 CS CS581585A patent/CS254163B1/sk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Carpita et al. | Extraction of starch by dimethyl sulfoxide and quantitation by enzymatic assay | |
| Tracey | Chitin | |
| Haissig et al. | Starch measurement in plant tissue using enzymatic hydrolysis | |
| Biely et al. | Soluble chromogenic substrates for the assay of endo-1, 4-β-xylanases and endo-1, 4-β-glucanases | |
| Huber et al. | Autolysis of the cell wall β-D-glucan in corn coleoptiles | |
| Corder et al. | Carbohydrate-degrading enzymes in germinating wheat | |
| US6174700B1 (en) | Purification of a polypeptide compound having a polysaccharide binding domain by affinity phase separation | |
| DK159688B (da) | Oploeselig baerer-bundet lever-uricase, fremgangsmaade til dens fremstilling og anvendelse | |
| US6048715A (en) | Two-phase partition affinity separation system and affinity separated cell-containing composition | |
| Linko et al. | Starch conversion by soluble and immobilized α‐amylase | |
| McCleary | New chromogenic substrates for the assay of alpha-amylase and (1→ 4)-β-d-glucanase | |
| Fulcher et al. | Observations on the aleurone layer. II. Fluorescence microscopy of the aleurone-sub-aleurone junction with emphasis on possible β-1, 3-glucan deposits in barley | |
| US3278392A (en) | Water insoluble enzymes | |
| US4321364A (en) | Preparation of soluble chromogenic substrates | |
| Guthrie et al. | Ion Exchange Celluloses for Chromatographic Separations | |
| CS254163B1 (sk) | Sposob přípravy ohromolytického substrátu na stanovenie /(1-3) glukanázy | |
| US4563421A (en) | Method for determining the presence of endohydrolase in a liquid and composition therefor | |
| Simionescu et al. | Bioactive polymers. III. Cellulose derivatives as support for biologically active compounds | |
| Marshall et al. | Comparative studies on β-glucan hydrolases: Isolation and characterization of an exo (1→ 3)-β-glucanase from the snail, Helix pomatia | |
| DE2619451A1 (de) | Verfahren zur bindung von hoch- und niedermolekularen liganden an polymere traeger | |
| CS254162B1 (cs) | Sposob přípravy rozpustného cbromolytickéha substrátu na stanovenie (3(l-*3) glukanázy | |
| Yamaguchi et al. | Incorporation of glucoamylase into some polyelectrolyte complexes | |
| Kennedy et al. | Immobilization of glucoamylase on gelatin by transition-metal chelation | |
| CZ476389A3 (cs) | Spósob přípravy chromolytického substrátu na stanovenie xylanáz ověj enzýmovej aktivity | |
| Cheetham et al. | Studies on dextranases: Part III. Insolubilization of a bacterial dextranase |