CS256197B1 - Sposob indikácie a kvantitativného hodnotenia herhicídnej účinnosti látok inhibujúcich fotosyntézu - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká sposobu indikácie a kvantitativného hodnotenia herhicídnej účinnosti látok inhibujúcich fotosyntézu porovnáním radioaktivity listových segmentov ošetřených testovanými látkami s rádioaktivitou neošetrených kontrolných segmentov po svetelnej expozícii za posobenia rádionuklidom 14C označeného oxidu uhličitého. Riešenie je možné využit vo výskume nových herbicídov, pri kvantítatívnom vyhodnotení stupňa ich selektivity, inhibície fotosyntézy, rezistencie niektorých biotypov ako aj vplyvu aditívov na potenciáciu herbicídnych účinkov.

Description

Riešenie sa týká sposobu indikácie a kvantitativného hodnotenia herhicídnej účinnosti látok inhibujúcich fotosyntézu porovnáním radioaktivity listových segmentov ošetřených testovanými látkami s rádioaktivitou neošetrených kontrolných segmentov po svetelnej expozícii za posobenia rádionuklidom ¹⁴C označeného oxidu uhličitého. Riešenie je možné využit vo výskume nových herbicídov, pri kvantítatívnom vyhodnotení stupňa ich selektivity, inhibície fotosyntézy, rezistencie niektorých biotypov ako aj vplyvu aditívov na potenciáciu herbicídnych účinkov.

Vynález sa týká sposobu indikácie a kvantitativného hodnotenia herbicídnej účinnosti látok inhibujúcich fotosyntézu. Inhibitory fotosyntézy tvoria prevažnú časť herbicídne účinných látok.

Před zavedením nového herbicidu do praxe je potřebné na herbicídnu účinnost biologicky otestovat desattisíce zlúčenín. Převážná časť komerčně dostupných herbicídov patří svojim mechanizmom účinku medzi inhibitory fotosyntézy. Svojim inhibičnym účinkom postupné vyraďujú životné důležité asimilačné pochody tvorby biomasy, čo sa v konečnom důsledku prejaví v uhynutí rastliny [Buchel, Κ. H.: Pěst. Sci. 3, 89 až 110 (1972)].

Doteraz najviac používané skríningové metody na hodnotenie herbicídnej účinnosti sú založené prevažne na sledovaní fytotoxicity vyjadrenej bonitačnou stupnicou připadne pri upřesnění výsledkov sa hmotnostně sleduje časový úbytok biomasy v závislosti na koncentrácii skúmaných inhibítorov v v porovnaní s kontrolnými neošetrenými rastlinami [Bradhury, D. T.: Proč. 10^th British Weed Control Conf. 1970, 986 — 996 (1970); Saggers, D. T.: Herbicídne Academie Press London, ed AUDUS, 447 — 473 (1976)]. Tieto metody sú časovo, pracovně a energeticky náročné, vyžadujú velké skleníkové priestory, čím je podstatné limitovaný rozsah testovaných zlúčenín. Herbicídne symptomy sa prejavujú často oneskorene, čím sa na dlhší čas blokujú testovacie priestory. Spůsob aplikácie a příprava postrekových roztokov vyžadujú aspoň niekolkogramové množstvá testovaných substancií, čo kladie vyššie nároky na přípravu a dostupnost týchto zlúčenín. Vzhíadom na kapacitně obmedzenie sa tieto metody používajú pri systematickom výskume známých herbicídne účinných skupin a cielenora výskume syntéz nových herbicídnych zlúčenín, kde je výskyt herbicídne aktívnej látky pravděpodobnější. Tieto metody sú nevyhnutné pre upresnenie výsledkov hodnotenia herbicídnej aktivity v podmienkach praktickej aplikácie na ošetřené kultúry v príslušnom spoločenstve burín.

Pri hladaní nových herbicídne účinných skupin třeba otestovat desattisíce zlúčenín s výrazné účinnými štruktúrami. Pre tieto účely třeba mať k dispozícii velmi rýchle, pracovně, energeticky a priestorovo nenáročné testovacie metody, maximálně sa približujúce podmienkam praktickej aplikácie s minimálnymi nárokmi na množstvo skúmanej látky. Tieto požiadavky len čiastočné splňujú niektoré tzv. „in vitro“ metody, založené napr. na inhibícii Hillovej reakcie izolovaných chloroplastov, připadne fotosyntézy na segmentoch listov sledováním hmotnostného úbytku sušiny biomasy, ako aj potápania plávajúcich ošetřených segmentov [Moreland, D. E., Hill, K. L.: 1B, 229 — 236 (1962); Šesták, Z., Čadský, J.: Metody studia fotosyntetické produkce rostlin, Academia, 1966, str. 396; Truelove, B. al. Weed Sci. 22, 15 — 17 (1974); Saltzman,

S., Heuer, B.: Pestic. Sci. 16, 457 — 462 (1985)]. Uvedené metody sú pracovně náročné, nakolko z aspektu preukaznosti výsledkov vyžadujú velké štatistické súbory a neumožňujú automatizáciu vyhodnocovania výsledkov.

Dalšie metody využívajú na stanovenie herbicídnej účinnosti intaktné mikroorganismy, nižšie rastlinné organismy ako sú riasy aj v kombinácii s fluorescenčnou metodou [Addison, D. A., Bardsley, C. E., Weed Sci. 16, 427 — 429 (1968] Bohme, H. et al.: Weed Sci. 29, 371 — 375 (1981)], alebo raeraním spotřeby COz IČ spektrofotometrickou, připadne rádiometrickou metodou (DD 212 985—A). Kvantitativné hodnotenie inhibície fotosyntézy je zatažené velkou chybou, nakolko spotřebované množstvo oxidu uhličitého CO2 je v porovnaní s celkovým množstvom oxidu uhličitého CO2 velmi nízké. Metoda založená na inhibícii Hillovej reakcie, využívajúca vhodný redox-indikátor na detekciu nanogramových množstiev inhibítorov [Kováč, J„ Henselova, M.: Photosynthetica 10 (3), 343 — 374 (1976)], spíňa základné požiadavky rýchlej rutinnej testovacej metody, pokial' mechanismus účinku nespočívá v inhibícii iných fotosyntetických pochodov. Metoda v sebe nezahřňa změny v účinnosti, zapříčiněné transportem inhibítora k miestu účinku.

Podobné metoda [Okut, T., Kawahara, H., Tomita, G.: Plant cell physiol. 12 (4), 559 až 566 (1971)], založená na vyhodnotení inhibície Hillovej reakcie meraním obsahu kyslíka v homogenáte izolovaných chloroplastov kyslíkovou elektrodou neindikuje účinné látky zasahujúce do iných fotosyntetických procesov.

Uvedené nedostatky testovacích postupov pri indikovaní a hodnotení herbicídnej účinnosti velkého počtu z aspektu inhibície fotosyntetických procesov odstraňuje spůsob indikácie a kvantitativného hodnotenia herbicídnej účinnosti látok inhibujúcich fotosyntézu podlá vynálezu. Podstata vynálezu spočívá v tom, že na vykrojené rastlinné listové segmenty sa topikálne nanesie roztok testovanej látky, tieto sa spolu so symetrickými, ale neošetrenými kontrolnými segmentami vložia do fotosyntetickej komory, kde sa za působenia rádioaktivneho ¹⁴CO2 podrobia svetelnej expozícii. Po expozícii sa zmeria radioaktivita ošetřených aj neošetrených segmentov a z poklesu rádioaktivity ošetřených segmentov v porovnaní s kontrolnými segmentami sa indikuje přítomnost látok inhibujúcich fotosyntézu a z poklesu rádioaktivity sa kvantitativné vyhodnotí inhibícia fotosyntézy v %.

Výhoda spůsobu indikácie a kvantitativného hodnotenia herbicídnej účinnosti látok inhibujúcich fotosyntézu spočívá predovšetkým v tom, že vzhíadom na vysokú citli5 vosť rádiometrickej metody možno pokles radioaktivity pri ošetřených listových segmentech postrehnúť už pri krátkej svetelnej expozícii. Toto umožňuje s využitím automatickcj rádiomebickej techniky nieleti otestovat v krátkom čase velký počet vzoriek v množstvách niekofkých miligramov, ale aj kvantitativné rýchle vyhodnotit koeficient selektivity pri použití segmenťov z róznych rastiinných materiálov ako aj vplyv aditívov a finálnej úpravy na biologickú aktivitu herbicídov.

Na priloženom obrázku je zobrazené zariadenie na fotosyntézu v atmosféře s obsahom ¹⁴CO.?, tvořené fotosyntetickou komorou 2 z plexiskla s podložkou 1 na uloženic segmentov, křídlovými maticami 3 a ventiimi 8, 9 na hermetizáciu, s otvorom 7 na zavedenie injekčnej striekačky s ihlou 5 prostredníctvom gumovej zátky 4, pričom na ihle injekčnej striekačky 5 je uchytený knot 5 z filtračného papiera. Sňčasfou zariadenia na fotosyntézu, je aj membránové čerpadlo 10 na recirkulovanie ovzdušia fotosyntetickej komory 2 a ahscrbér 11 na absorpciu neasimilovanébo ¹⁴CO?.

Uvedené příklady ilustrujú, ale ncobmedzujú predmet vynálezu.

Příklad 1

Rádiometrická indik.ácia inhibítorov fotosyntézy na báze močovinových triazínovýcb, diazínových a karbamátových herbicídov.

Zarladenie: automatický kvapalný scintilačný merač rádioakavity Rack-Beta LKB; zariadenie na fotosyntézu v atmosféře s obsahom ¹⁴CO?, obr. 1; Hamiltonova striekačka (10 mm³).

Roztoky a chemikálie: vodný roztok rádioaktívneho uhličitanu sodného (Na2¹⁴COjj, konc. 11,1 mg. cm'³ s celkovou aktivitou 37 MBq, roztok NaOH konc. 2 mol.. 1^_1, roztok H?SOa konc. 2 mol.. 1^_1, etylalkoholové roztoky účinných látok herbicídov-inhibítorov fotosyntézy - konc. 2 mg . cm³.

Účinné látky:

2-etylamíno-4-chlor-6-terc.butylomíno-1,3,5-triazin (terbutylazin),

2-etylamíno-4-metyltio-6-terc.butyla.míno-l,3,5-triazin (terbutryn j,

N,N-dimetyl-N-(3-chlor-4-tolylj-močovina (chlorotoluronj,

N-4- (4-chlorf enoxy) -f enyl-N,N-dimetylmočovina (chlor oxuronj,

4-amíno-3-metyltio-6-terc.butyl-l,2,4-triazin-5-on (metribuzin),

2-chlor-4-etylamíno-6-isopropylamíno-1,3,5-triazin (atrazin),

N- (4 j -metoxyfenoxy j -fenyl) -N,N-dimetylmočovina (difenoxuron),

N-(3.4-dichlorfenyI )-N-metoxy-N-metylmočovina (linuron),

N-(4-bromfenyl)-N-metyl-močovina (metobromuron),

N,N-dimetyl-N- (4-isopropylf enyl) -močovina (isoproturon),

O-(3-n)etoxykarbonylani.liuoj-N-(3-metylfenyl j-karbamát (feumedifamj,

2- metyltio-4,6-bis-isopropylamíno-l,3,5-triazin (prometryn),

3<sopropyl-l-hydro-2,l,3-benztiadiazin-4-0U-2,2-dioxid (bentazon j,

4-chlor-2-oxo-3-benztiazolinocl0vá kyselina (benazolin),

N-(4-chlor fenyl j-N-metoxy-N-metylmočovina (monolinuron j,

3- cyklohexyl-5,6-trimetylenuracil (lenacil),

4- amíno-l-fenyl-5-chlor-6-pyridazon (chloridazonj, l,l-dimetyl-3-trifluormetylfenyl-močovina (fluometuron).

Z listovéj plochy fazule (Phaseolus vulg.) vo vývojovom stádiu prvých dvoch listov sa vykrojila dvojica kruhových segmentov pozd ž nervu listu tak, že sa zachovala symetria u příslušných druhov listov. Z každého listu sa vykrojili minimálně štyri dvojice segmentov. Segmenty sa uložili na disky z filtračného papiera (0 1 cm] rovnoměrně zmáčané destilovanou vodou, umiestnené na sklenenej podložke. Segmenty miernym přitlačením přilnuli k vlhkej podložke, čím sa znížilo odparovanie vody z povrchu segmentov a dosiahla sa požadovaná fixácia segmentov na povrchu podložky. Potom sa na povrch segmentu príslušnej dvojice vzorka — kontrola nanieslo kapilárnou mikroplpetou (5 mm³) etylalkoholového roztoku skúmanej látky. Podložka 1 so segmentami sa vsunula do fotosyntetickej komory 2 z plexiskla. Po uzavretí fotosyntetickej komory 2 krytom 12 s gumovým těsněním a po jej dokonalej hermetizácii křídlovými maticami 3 a ventilmi 8, 9 sa z otvoru 7 fotosyntetickej komory 2 vybrala gumová zátka 4, prepichnutá ihlou injekčnej striekačky 5 na konci ktorej bol uchytený knot 6 z filtračného papiera. Injekčná striekačka 5 sa čiastočne naplnila zriedeným roztokom kyseliny sírovej, ihla sa vyměnila za ihlu

25B197 so zátkou 4 a na konci knotu 6 z filtračného papiera sa Hamiltonovou striekačkou nanieslo 5 mm³ roztoku rádioaktívneho uhličitanu sodného. Potom sa do otvoru 7 fotosyntetickej komory 2 vsunula gumová zátka 4 s injekčnou striekačkou 5 a ihlou s knotom 6. Po uzavretí ventilu 8, 9 sa fotosyntetická komora 2 zakryla čiernym papierom a vytlačením kvapky roztoku kyseliny sírovej z injekčnej striekačky 5 sa knůt 6 zmáčal a kyselina sírová uvolnila z uhličitanu sodného rádioaktívny ¹⁴CO2 do priestoru íotosyntetickej komory 2. Po 15-minútovom zrovnovážnení ovzdušia fotosyntetickej komory 2 sa segmenty vystavili 30-minútovej expozícii světelného žiarivkového zdroja (3 x 40 W), umiestneného 20 cm od podložky 1 so segmentami. Po ukončení expozície otvorením ventilov 8, 9 a zapnutím membránového čerpadla 10 ovzdušie fotosyntetickej komory 2 recirkulovalo cez absorbér 11 s roztokom hydroxidu sodného. Absorpcia neasimilovaného ¹⁴CO2 prebehla počas 30 minút. Potom sa otvoril zadný uzáver fotosyntetickej komory 2 a podložka 1 so segmentami sa vysunula. Segmenty sa vniesli do scintilačných meracích nádobiek a zaliali sa 10 ml kvapalného scintilátora SLT-31. Meranie rádioaktivity sa uskutečnilo na automatickom kvapalnom scintilačnom merači rádioaktivity Rack-Beta LKB (je možné použit aj iný ekvivalentný přístroj). Pokles rádioaktivity, poukazujúci na stupeň inhibície fotosyntézy a tým aj na herbicídnu účinnost, je zřejmý z tabulky 1.

Tabulka 1

Rádiometrická indikácia biologickej účinnosti herbicídov na segmentech z listov fazule vyjádřená inhibíciou fotosyntézy v %

Testovaná

Rádioaktivita

Rádioaktivita

Inhibícia fotosyntézy

účinná kontrol, seg.	ošetr. seg. (c.p. m.)	(i--^-).100 (%)
látka	(c. p. m.j
Terbutryn	31 445	75	99,8
Prometryn	30 060	85	99,7
Ghloridazon	31 665	90	99,7
Atrazín	30 055	95	99,7
Difenoxuron	29 905	105	99,6
Lenacil	29 470	170	99,4
Fluometuron	29 435	175	99,4
Fenmedifam	30 565	210	99,3
Izoproturon	31115	235	99,2
Bentazon	31 765	245	99,2
Monolinuron	30 230	260	99,1
Metobromuron	29 705	315	98,9
Metribuzin	29 970	335	98,9
Terbutylazin	30 795	425	98,6
Linuron	31 305	550	98,2
Chlortoluron	30 385	605	98,0
Chlorroxuron	31 205	815	97,4
Benazolin	31400	995	96,8
Příklad 2		medzi koncentrácii 0,001 až 2,00 mg . cm'3. Z jednotlivých roztokov sa nanieslo mikro-
Kvantitativné rádiometrická hodnotenie ú-	pipetou na vykrojené	segmenty z listov
činnosti herbicídov vyjádřené závislosťou	fazule rovnakým postupom ako v příklade
fotosyntézy od koncentrácie účinnej látky	1 a po svetelnej expozícii sa vyhodnotila
v aplikačnom roztoku.		z nameraných rádioaktivit ošetřených a ne-
		ošetřených segmentov	inhibícia fotosyntézy
Postup: Připravili	sa vodné roztoky	v %, ako je to zřejmé	z tabulky 2 a 3. Vý-
finálnych prípravkov herbicídov na báze ú-	sledky sú priemerom	šiestich paralelných
činných látok atrazínu	a bentazonu v roz-	stanovení.

Tabulka 2

Radiometrické vyhodnotenie inhibície fotosyntézy (°/o) v závislosti od koncentrácie atrazínu v aplikačnom roztoku

Koncentrácia atrazínu (mg. cm³j radioaktivita kontrolného segmentu (c. p. m.)

A radioaktivita ošetřeného segmentu (c.p. m.)

B inhibícia fotosyntézy °/o (1--?—) · 100

0,001	25 030	20150	19,5
0,002	24 750	16 530	33,2
0,004	24 710	11 970	51,6
0,020	26 045	8 190	68,6
0,040	25 150	5 147	79,5
0,400	26 570	305	98,9
2,000	24 775	125	99,5
		Tabulka 3
Rádiometrické	vyhodnotenie inhibície	fotosyntézy (%) v závislosti	od koncentrácie
	bentazonu v	aplikačnom roztoku
Koncentrácia	rádioaktivita	rádioaktivita	inhibícia fotosyntézy
bentazonu	kontrolného segmentu ošetřeného segmentu	(%)
(mg. cm'3)	(c. p. m.)	(c. p. m.)	p Í1 1 1ΠΠ
	A	B	[i a * 1UU
0,001	25 970	21 960	15,4
0,002	26 160	19 310	26,2
0,004	25 035	13 745	45,1
0,020	24 030	8 980	62,6
0,040	24 220	5 980	75,3
0,400	25 005	1 990	92,0
2,000	26 970	270	99,0

Příklad 3

Radiometrické vyhodnotenie potenciácie herbicídneho účinku vplyvom aditívu.

Postup: Na segmenty listov fazule sa naniesli vodné roztoky finálnych produktov skúšaných herbicídov Zeazínu (účinná látka bentazon) bez přídavku ako aj s prídavkom aditívu, pri odstupňovaných koncentráciách atrazínu a bentazonu. Připravil sa vodný 0,2 %-ný roztok aditívu (Sloviol-R, obsahujúci 16 % polyvinylalkoholu). Porovnala sa inhibícia fotosyntézy odstupňovaných koncentrácií příslušných herbicídov, získaných riedením vodou a vodným roztokom aditívu. Další postup bol rovnaký ako v predchádzajúcich príkladoch. Potencujúci účinok aditívu je zřejmý z tabuliek 6 a 7.

Tabulka 4

Potenciácia herbicídneho účinku atrazínu fotosyntézy pri odstupňovaných aditívom Sloviol-R vyjádřená koncentráciách herbicidu inhibíciou

Konc. atrazínu (mg. cm~³) (c. p. m.) rádioaktivita kontrolného segmentu (c.p. m.)

A rádioaktivita ošetřeného segmentu (c. p. m.)

B inhibícia fotosyntézy (%) (1(1 ) . 100

0,001	27 050	18 905
0,002	25 110	14 095
0,004	25 750	9 640
0,020	26 330	62 295
0,040	25 175	1 995
0,400	26 970	190
2,000	26 145	75

30.1 43,9 62,6

76.1

92.1 99,3 99,7

25B197

Tabulka 5

Potenciácia herbicídneho účinku bentazonu aditívom Sloviol-R vyjádřená inhibíciou fotosyntézy pri odstupňovaných koncentráciách herbicidu

Koncentrácia bentazonu rádioaktivita kontrolného segmentu rádioaktivita ošetřeného segmentu inhibícia fotosyntézy

(mg . cm-3)	(c. p. m.)		(c. p. m.)	(1	Ď -1	. 100
A J
0,001	24 070			18 150		24,6
0,002	25 300			16 002		36,8
0,004	25 120			11 300		55,0
0,020	25 025			7 150		71,4
0,040	26 130			4 700		82,0
0,400	25 055			155		99,4
2,000	26 035			80		99,7
		T a b u Ϊ k a	6
Porovnanie inhibície	fotosyntézy	atrazínom	bez přídavku a s	prídavkom	aditívu
Koncentrácia	0,001	0,002	0,004	0,020	0,040	0.400	2,000
atrazinu
(mg. cm-3)
inhibícia (%}	20	34	52	69	80	99	99
bez aditívu
inhibícia (%)	31	44	63	77	93	99	99
s prídavkom aditívu
		T a b u 1' k a	7
Porovnanie inhibície	fotosyntézy	bentazonom bez	přídavku a	s prídavkom aditívu
Koncentrácia	0,001	0,002	0,004	0,020	0,040	0,400	2,000
bentazonu
(mg. cm-3)
inhibícia (%)	16	7Π	46	63	76	93	99
bez aditívu
inhibícia (%)	25	37	56	72	83	99	99
s prídavkom aditívu
Příklad 4			ných roztokov	finálneho	produktu	bentazo-

Rádiometrické \ /hotcvunie selektivity atrazinu a bentazonu na segmentech z Hotov fazule, kukuřice a jačmeňa.

Postup: Na segmenty listov fazule a kukuřice sa naniesli odstupňované koncentrácie vodných roztokov finálneho produktu atrazinu a na segmenty z listov fazule a jačmeňa, odstupňované koncentrácie vodnu. Inhibícia fotosyntézy sa vyhodnotila radiometricky z hodnot radioaktivit ošetřených a kontrolných ss/mentov ako v předešlých příkladech. Selektivita skúšaných berbicídov je zřejmá z výsledkov tabuliek 2. 3, 8 a 9 z porovnania inhibície fotosyntézy (%) v závislosti od koncentrácie týchto berbicídov po ošetření segmentov z listov fazule, kukuřice a jačmeňa.

Tabul'ka 8

Radiometrické vyhodnotenie inhibície fotosyntézy (%) v závislosti od koncentrácie atrazínu na segmentoch listov kukuřice.

Koncentrácia atrazínu (mg. cm-3)	Rádioaktivita kontrolného segmentu (c. p. m.j	Rádioaktivita ošetřeného segmentu (c. p. m.j	Inhibícia fotosyntézy (%)
2,0	18 665	15 330	17,9
2,5	17 545	11 220	36,1
5,0	18 025	495	97,5
10,0	17 985	195	98,9

Tabulka 9

Rádiometrické vyhodnotenie inhibície fotosyntézy (%] v závislosti od koncentrácie
Koncentrácia bentazonu (mg. cm3]	bentazonu na segmentoch z listov jačmeňa.	Inhibícia fotosyntézy (%)
Rádioaktivita kontrolného segmentu (c. p. m.j	Rádioaktivita ošetřeného segmentu (c. p.m.)
2,0	18 110	13 705	24,3
2,5	17 995	9 445	47,5
5,0	17 025	305	98,2
10,0	18 445	70	99,6

PREDMET

Claims (1)

1. Spósob indikácie a kvantitativného hodnotenia látok inhibujúcich fotosyntézu, vyznačujúci sa tým, že na listové segmenty rastlín sa nanesie roztok testovanéj látky, tieto sa spolu so symetrickými neošetrenými kontrolnými segmentami podrobia za pósobenia rádioaktívneho ¹⁴CO2 svetelnej exVYNÁLEZU pozícii, po ktorej sa rádiometricky stanoví aktivita ošetřených a neošetrených segmentov, pričom pokles aktivity ošetřených segmentov v porovnaní s neošetrenými indikuje přítomnost látok inhibujúcich fotosyntézu a z poklesu rádioaktivity sa kvantitativné vyhodnotí inhibícia fotosyntézy v %.

   1 list výkresov

   Sewcografla, η. p. závod 7, Most

   Cfcna 2,40 KCs