CS258053B1

CS258053B1 - Method for determining biological tolerance and toxicity of substances or mixtures thereof

Info

Publication number: CS258053B1
Application number: CS852175A
Authority: CS
Inventors: Pavel Hoffman; Vladimir Puza
Original assignee: Pavel Hoffman; Vladimir Puza
Priority date: 1985-03-26
Filing date: 1985-03-26
Publication date: 1988-07-15
Also published as: CS217585A1

Abstract

Způsob stanovení biologické toleranoe a toxicity látek, popřípadě jejich směsí. spočívá v tom, že se zkoušené látky fixulí na nosič, se kterým ee uv$de do kontaktu s živými živočišnými buňkami v kultivačním médiu, biologická ode člšnýoh buněk na zkousene látky fixované ná nosič se sleduje mikroskopicky, popřípadě mikrofotografioky nebo mikrokinematografioky. Způsob stanovení lze využít ve zdravotniotví a v potravinářství.The method of determining the biological tolerance and toxicity of substances, or their mixtures, consists in fixing the tested substances on a carrier, with which they are brought into contact with living animal cells in a culture medium, the biological reaction of the cells to the tested substances fixed on the carrier is monitored microscopically, or by microphotography or microcinematography. The method of determination can be used in healthcare and in the food industry.

Description

Vynález ee týká způsobu stanovení liologické tolerance a toxicity látek nebo jejich směsí.The invention relates to a method for determining the liological tolerance and toxicity of substances or mixtures thereof.

V současné době je biologická tolerance a toxicita látek nebo jejich směsí zjišťována celou řadou biologických zkoušek. Československý lékopis předpisuje následující biologické zkoušky. Zkoušku akutní toxicity, jejíž podstatou je vstřikování roztoků do žíly laboratorních myší, zkoušku na krysím srdci in šitu, zkoušku přežívání krysích spermií, zkoušku na hemolytický účinek, zkoušku na pyrogenní látky, zkoušku na kožní dráždivost, zkoušku na oční dráždivost a zkoušku na lokální reakci. Obdobně tomu je i u lékopisů jiných států. Používané biologické zkoušky mají četné přednosti, ale i některé nevýhody. Největší potíže bývají u látek ve vodě málo rozpustných nebo nerozpustných, dále u nečistot provázejících látky ve stopových množstvích.At present, the biological tolerance and toxicity of substances or mixtures thereof is determined by a number of biological tests. The Czechoslovak Pharmacopoeia prescribes the following biological tests. Acute toxicity test consisting of injection of solutions into the vein of laboratory mice, in-situ rat heart test, rat sperm survival test, hemolytic test, pyrogenic test, skin irritation test, eye irritation test and local reaction test . The same applies to pharmacopoeias from other countries. The biological tests used have numerous advantages, but also some disadvantages. The greatest difficulty is in water-insoluble or insoluble substances, as well as in trace amounts of impurities accompanying the substances.

' Rovněž výsledky bývají často ovlivněny individuelním stavem laboratorních zvířat i|způsobem aplikace látek. Ve většině případů zkouška neumožňuje práci ve větší sérii, archivaci materiálu i dokumentaci pro reprodukce a vzájemné srovnání nebo probíhá v živém makroorganismu.Also, the results are often influenced by the individual condition of the laboratory animals and the mode of administration of the substances. In most cases, the test does not allow for larger series work, material archiving and documentation for reproduction and comparison, or is performed in a living macro-organism.

Výše uvedené nedostatky jsou částečně odstraněny způsobem stanovení biologické tolerance a toxicity látek podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zkoušené látky fixují na nosič, s nímž se uvedou do kontaktu s živými živočišnými buňkami v kultivačním mediu,' biologická odezva živočišných buněk na zkoušené látky fixované na nosiči se sleduje mikroskopicky, případně mikrofótograficky nebo mikrokinematograficky. Jako nosiče je vhodné použití filtračních membrán. Nosič může být také živočišného půVodu na bázi kolagenu a elastinu,připravený například z přírodní blanité vtstvy serosy, submukosy nebo fascie.The above drawbacks are partially eliminated by the method of determining the biological tolerance and toxicity of the substances according to the invention, which consists in fixing the test substances to a carrier with which they are brought into contact with live animal cells in the culture medium. The test substances fixed on the support are monitored microscopically or, where appropriate, by microphotography or micro-cinematography. Filter membranes are suitable as carriers. The carrier may also be of animal origin based on collagen and elastin, prepared, for example, from the natural membranes of serosa, submucosa or fascia.

Přednostmi způsobu stanovení biologické tolerance a toxicity létek nebo jejich směsí podle vynálezu jsou možnosti sledovat látky plynné, kapalné, v suspenzích, rozpustných ve vodě nebo rozpouštědlech nebo i vůbec nerozpustných. Další předností je schopnost velmi citlivé detekce příměsí a nečistot, provázejících biologicky zcela nezávadné látky, a to i v jinak obtížně stanovitelných množstvích. Použitím nosičů k vázáni látek a jejich směsí umožňuje se protrahované, časově sledovatelné, postupné uvolňování jejich složek vyvolávajících reakci živočišných buněk pěstovaných in vxtro. Podle této reakce je možno zjistit dynamiku působení určité látky nebo i určité koncentrace látky. Rovněž je možně, za použití části téhož nosiče s látkou vyzkoušet reakci kultivovaných buněk různých druhů živočichů nebo jejich různých tkání. Sledování biologické odezvy živočišných buněk na zkoušenou látku podle vynálezu umožňuje vzájemné porovnání působení látek v časovém sledu, ale i statistické vyhodnocení.Advantages of the method of determining the biological tolerance and toxicity of drugs or mixtures thereof according to the invention are the ability to monitor substances gaseous, liquid, in suspensions, soluble in water or solvents, or even insoluble at all. Another advantage is the ability to very sensitive detect impurities and impurities accompanying biologically harmless substances, even in otherwise difficult to determine amounts. By using carriers to bind the substances and mixtures thereof, the protracted, time-trackable, sustained release of their components causing the reaction of animal cells grown in vitro is possible. According to this reaction, it is possible to determine the dynamics of action of a certain substance or even a certain concentration of a substance. It is also possible to test the reaction of cultured cells of different animal species or their different tissues using a portion of the same carrier with the substance. The monitoring of the biological response of animal cells to the test substance according to the invention enables a comparison of the action of the substances over time, as well as a statistical evaluation.

Uvedenou metodikou lze sledovat chování různých živočišných buněk vůči zkoušenému materiálu, z čehož lze usuzovat i na biologickou odezvu jednotlivých částí tkání organismů vůči zkoušenému materiálu. U látek nepodléhajících při skladování změnám, lze uchovávat části nosičů s nanesenými látkami pro pozdější srovnání nebo reprodukci. Kikrofotografické nebo mikrokinematografické záběry reakce buněk na zkoušené látky nane- . sené na nosičích slouží jako trvalý doklad.Using this methodology, the behavior of different animal cells towards the test material can be monitored, which also suggests the biological response of individual parts of tissues of organisms to the test material. For substances not subject to change in storage, portions of the coated vehicles may be retained for later comparison or reproduction. Microphotographic or micro-cinematographic shots of the reaction of cells to test substances are not present. carried on carriers serves as a permanent document.

Pro přípravu nosičů z živočišného pojivá jsou vhodné přírodní blanité vrstvy serosy, submukosy nebo fascie, zbavené nekolagenních a neelastinových příměsí. Dále kolagenní membrány připravené nejlépe z rekonstituovaného kolagenu. Nanášení plynných látek se provádí zavěšením nosičů v prostředí plynů nebo jejich filtrací přes nosiče. Kapaliny se nanáší máčením, natíráním nebo filtrací. Suspense se nanáší obdobně jako kapaliny. Látky rozpustné se nanjáší jako kapaliny a voda nebo rozpouštědlo se vysuší. Nerozpustné látky jemné struktury se za sucha vtírají do nosičů a neulpělé se s povrchu opráší. Nerozpustné látky hrubší struktury se nanesou na vodou zvlhčený povrch,Natural membranes of serose, submucosa or fascia free of non-collagen and non-elastin impurities are suitable for the preparation of carriers from animal binders. Furthermore, collagen membranes prepared preferably from reconstituted collagen. The gaseous substances are applied by suspending the carriers in the gas environment or by filtering them through the carriers. Liquids are applied by dipping, painting or filtering. The suspension is applied similarly to liquids. The soluble substances are applied as liquids and the water or solvent is dried. Insoluble substances of fine structure are dry rubbed into the carriers and the non-adhered surfaces are dusted off. Insoluble substances of a coarser structure are applied to the water-moistened surface,

- 3 případně i jejich filtrací přes nosič a po oschnutí se opráší částečky, které se nepřilepily. Některé, látky se na nosič zachytí při dialyse. Membránové filtry připravené z umělých hmot, jakožto nosiče nejsou tak universální jako nosiče z živočišného pojivá. Nosiče se zkoušenými látkami se nastříhají na proužky 2 až 8 mm široké, délky asi 10 cm. Tahem za volné konce se přitisknou na mikroskopická sklíčka s homogenními narostlými buňkami. Trvalé přitisknutí proužků nosiče k buňkám se. zajistí pomocí těsnění ze silikonové pryže, dosedlého na proužek mimo i- 3, if necessary, by filtering them through the support and, after drying, remove any non-adhering particles. Some substances are retained on the carrier during dialysis. Membrane filters made of plastic as carriers are not as versatile as animal binder carriers. The test substance carriers are cut into strips 2 to 8 mm wide, about 10 cm long. By pulling the free ends, they are pressed onto microscope slides with homogeneous, grown cells. Permanently pressing the carrier strips against the cells. secures by means of a silicone rubber seal that sits on the strip outside i

sklíčko. Po připuštění kultivačního roztoku se kultivuje při stálé teplotě, vhodné pro použité buňky. Mikrofotografické nebo mikrokinematografické snímkování se provádí v časových intervalech od zahájení kultivace. Současně se provádí kontrolní snímky buněčné kultury s nosičem bez zkoušených látek. Konečné hodnocení se provede srovnáním snímků všech časových úseků i původní buněčné kultury.glass. After addition of the culture solution, cultivate at a constant temperature suitable for the cells used. Microphotographic or micro-cinematographic imaging is performed at intervals of time from the start of cultivation. At the same time, cell culture control images are carried out with vehicle without test substances. Final evaluation is performed by comparing images of all time periods and original cell culture.

vin

Mimo zjištování biologické tolerance a toxicity látek používaných ve zdravotnictví lze způsob dle vynálezu využít i k ověřování zdravotní nezávadnosti látek v potravinářství, textilním i kosmetickém průmyslu.In addition to the determination of biological tolerance and toxicity of substances used in health care, the method according to the invention can also be used to verify the health safety of substances in the food, textile and cosmetic industries.

Vynález je blíže osvětlen následujícími příklady .The invention is illustrated by the following examples.

Příklad 1Example 1

Nosič živočišného původu ze submukosy tenkého střeva ovce byl vystaven účinku směsi 80 % kysličníku uhličitého a 20 % ethyíenoxidu po dobu 12 hod. Po odsání směsi a provzdušnění po dobu 6 hod. byl odstřižek přitlačen k buňkám fibroblastní a epitheloidní linie, narostlým na mikroskopickém krycím sklíčku, po připuštění osmoticky vyváženého a obohaceného fyziologického roztoku byla provedena kultivace za stálé teploty 57 °G. Ihned byl zhotoven mikrofotografický záběr nosiče a jeho okolí, který byl opakován každou hodinu po dobu 12 hodin.The animal carrier from the submucosa of the small intestine of the sheep was exposed to a mixture of 80% carbon dioxide and 20% ethylene oxide for 12 hours. After aspirating the mixture and aerating for 6 hours, the shear was pressed against fibroblast and epitheloid line cells grown on a microscope cover. After admitting the osmotically balanced and enriched saline solution, a constant temperature cultivation of 57 ° C was performed. A photomicrograph of the carrier and its surroundings was made immediately and repeated every hour for 12 hours.

Příklad 2Example 2

Ústřižek téhož nosiče, exponovaného účinku směsi 80 % kysličníku uhličitého a 20 % ethyíenoxidu po dobu 12 hod. byl pro258053 ~ 4 vzdušněn po dobu 12 hod. Déle bylo postupováno přesně jak uvedeno v příkladě 1.The shear of the same carrier, exposed to a mixture of 80% carbon dioxide and 20% ethylene oxide for 12 hours, was aerated for 12 hours for 258053 ~ 4. The procedure was as described in Example 1.

V případě příkladu 1 nosič s létkou Vyvolal nežádoucí reakci buněk a byl označen jako toxický. V případě příkladu 2 nosič nevyvolal žádnou reakci buněk, což prokázalo nepřítomnost toxické 1 átky.In the case of Example 1, a carrier with a flight elicited an undesirable cell response and was reported to be toxic. In Example 2, the carrier did not induce any cell response, demonstrating the absence of a toxic agent.

Příklad 3Example 3

Nosič živočišného původu ze serozní vrstvy tenkého hovězího střeva byl 24 hodin máčen v 0,5 % roztoku methylenové modři v 96 % ethanolu denaturovaném 1 % benzinu. Po vyjmutí z roztoku byl po dobu 1 hodiny dvakrát vyluhován 96 % ethanolem denaturovaným 1 % benzinu za teploty 20 °C a po okapání sušen 24 hodin při téže teplotě. V dalším bylo postupováno přesně jak uvedeno v příkladě 1.The carrier of animal origin from the serous small intestine layer was soaked in a 0.5% methylene blue solution in 96% ethanol denatured with 1% gasoline for 24 hours. After removal from the solution, it was leached twice with 96% ethanol denatured with 1% gasoline at 20 ° C for 1 hour and, after dripping, dried at the same temperature for 24 hours. Next, exactly as described in Example 1 was followed.

U příkladu 3 nedošlo k reakci buněk, látka byla označena jako netoxická. Tytéž nosiče připraveně podle příkladu 1, 2, byly zkoušeny in vivo a hodnoceny bez evidentní tkáňové reakce. Z uvedeného plyne, že metoda in vitro je citlivější než in vivo. Nosiče vložené do sterilizátorů plynem mohou tudíž být použity jakožto indikátory residua plynu.In Example 3, there was no cell response, the substance was designated non-toxic. The same carriers prepared according to Examples 1, 2 were tested in vivo and evaluated without an evident tissue response. It follows that the in vitro method is more sensitive than in vivo. Carriers loaded into gas sterilizers can therefore be used as indicators of gas residue.

Příklad 4Example 4

Ústřižek membránového filtru tuzemské výroby Sympor, přes který byla filtrována suspenze vloček vypadlých po ochlazení destilované vody procházející hadicí z nízkotlakého polyetylénu, byl po odsátí a usušení přitlačen jakožto nosič k buňkám diploidní linie lidských buněk narostlých na mikroskopickém krycím sklíčku a po napuštění kultivačního média kultivován za teploty 37 °C. Bezprostředně po napuštění kultivačního média byl zhotoven prvý fotografický náběr, další za ?G min, za 1 hod, 3, 6 a 8 hodin. Vyhodnocení vzorku jakožto netolerantního odpovídalo zkoušením hadice předepsaným pro polymery používané ve zdravotnictví.Sympor membrane filter of domestic production, through which the suspension of flakes precipitated after cooling of distilled water through a low-pressure polyethylene hose was filtered, was sucked and dried as a carrier to cells of diploid lineage of human cells grown on a microscope slide after culturing. temperature 37 ° C. Immediately after impregnation of the culture medium, the first photographic shot was taken, the next one in 1 min, 3, 6 and 8 hours. The evaluation of the sample as intolerant was consistent with the hose tests prescribed for polymers used in healthcare.

Claims

Method for determining the biological tolerance and toxicity of substances or mixtures thereof, characterized in that the test substances are fixed on a carrier * with which they are contacted with live animal cells in a culture medium, biological response of the animal cells to test substances fixed on a carrier is monitored microscopically or micrographically or micro-cinematographically.

2. A method according to claim 1, wherein the carrier is of animal origin based on collagen and elastin, prepared, for example, from a natural membranous layer of serosa, submucosa or fascia.

3. The method of claim 1, wherein the carrier is a filter membrane.