CS258054B1

CS258054B1 - A method of biological monitoring of the irritation and toxicity of fibers or flat shapes

Info

Publication number: CS258054B1
Application number: CS852176A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Puza; Pavel Hoffman
Original assignee: Vladimir Puza; Pavel Hoffman
Priority date: 1985-03-26
Filing date: 1985-03-26
Publication date: 1988-07-15
Also published as: CS217685A1

Abstract

Způsob biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo ^lošnýoh tvarů spočívá v tom, že zkoušeny materiál ve formě vláken nebo plošných tvarů se uv$de do kontaktu s živými živočišnými buňkami v kultivačním médiu a biologická odezva .živočišných buněk na vložený zkoušený materiál se sleduje mikroskopicky, popřípadě mikrofotografioky nebo mikrokinematografioky.The method of biological monitoring of the irritation and toxicity of fibers or flat shapes consists in that the tested material in the form of fibers or flat shapes is brought into contact with living animal cells in a culture medium and the biological response of the animal cells to the inserted tested material is monitored microscopically, or by microphotography or microcinematography.

Description

Vynález se týká způsobu biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných tvarů.The invention relates to a method for biological monitoring of the irritation and toxicity of fibers or sheets.

V současné dobé je zjišťována biologická dráždivost chirurgických materiálů výhradně všíváním nebo implantací těchto materiálů do tkání pokusných zvířat a histologiekým vyhodnocováním okolní tkáně. Tyto zkoušky trvají několik měsíců, jsou pracné a nákladné. Při ověřování všitých mikrochirurgických vláken se často stává, že v důsledku jejich migrace a nepatrných rozměrů se nepodaří zhotovit preparát z okolí vlákna. Naproti tomu například u monofilních vláken vyšších průměrů dochází často k projevu dráždění tkáně v důsledku působení většího cizího tělesa.At present, the biological irritability of surgical materials is determined solely by tufting or implanting these materials into the tissues of experimental animals and by histological evaluation of the surrounding tissue. These tests last several months, are laborious and costly. When verifying sewn microsurgical fibers, it often happens that due to their migration and small dimensions, the preparation cannot be made around the fiber. In contrast, for example, monofilament fibers of higher diameters often exhibit tissue irritation due to the action of a larger foreign body.

Výše uvedené nedostatky jsou podstatně odstraněny způsobem biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných tvarů podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zkoušený materiál ve formě vláken nebo proužků uvede do kontaktu s živými živočišnými buňkami v kultivačním mediu a biologická odezva buněk na vložený zkoušený materiál se sleduje mikroskopicky, mikrofotografický nebo mikrokinematograficky. Zkoušený materiál lze na podložku na níž je narostlé vrstva živočišných buněk fixovat pomocí proužku filtrační membrány. Narostlá vrstva živočišných buněk s přiloženým zkoušeným materiálem se přelije kultivačním mediem. Zkoušený materiál lze též na čistou podložku fixovat pomocí bílkovinného lepidla a přelít suspenzí živočišných buněk v kultivačním médiu.The above drawbacks are substantially eliminated by the method of biological monitoring of the irritation and toxicity of the fibers or sheets according to the invention, which comprises contacting the test material in the form of fibers or strips with live animal cells in the culture medium and the biological response of the cells to the the test material is monitored microscopically, micrographically or micro-cinematographically. The test material can be fixed to the substrate on which the grown animal cell layer is fixed by means of a filter membrane strip. The grown animal cell layer with the test material provided is poured over the culture medium. The test material can also be fixed to a clean surface using a protein glue and covered with a suspension of animal cells in the culture medium.

Hlavní výhody biologického sledování dráždivosti a toxicity vláken nebo plošných útvarů podle vynálezu spočívají ve zkrá258054 cení doby zkoušek z několika měsíců na několik hodin. Dále jsou podstatně nižší náklady na tyto zkoušky. V případě zkoušek in vivo vyžaduje každé časové sledování utracení několika laboratorních zvířat. U zkoušek in vitro lze snímat stav biologické odezvy buněk v kteroukoliv dobu jejich kultivace, a to zachycením změn v jejich množení, nárůstu v čase, případně morfologiekých změn bez zvýšení nákladů na zkoušení. V případě toxicity se vytvoří pathologické změny na buňkách narostlých na skle nebo v případě použití buněčné suspenze nedojde k rozprostření nebo adhesi buněk v blízkosti zkoušeného materiálu. Zóna poškozených nebo nerozprostřených a neadhezovaných buněk je tím větší, čím je zkoušený materiál toxičtější. Dokonalé upevnění zkoušených vláken nebo proužků umožňuje mikrofotografické snímky téhož místa a Vzájemné srovnání snímků z různých časových, údobí. Jako kontrolní jsou záběry buněk ničím neovlivněné kultury, bez zkoušených vláken nebo proužků, přechovávané po stejnou dobu v týchž podmínkách. Způsob dle vynálezu je citlivější než zkoušky in vivo a umožňuje sériové ověřování vzorků vláken. Pro velkou potřebu laboratorních zvířat a pracnost není u metod in vivo možná práce ve větších sériích. Metoda podle vynálezu umožňuje sledovat i biologickou odezvu živočišných buněk na vnitřní části zkoušeného materiálu,použije-li se řez monofilních vláken, cévní protézou nebo dutými vlákny.The main advantages of biological monitoring of the irritation and toxicity of the fibers or sheets according to the invention reside in shortening the testing time from several months to several hours. Furthermore, the cost of these tests is substantially lower. In the case of in vivo assays, each time observation requires the sacrifice of several laboratory animals. For in vitro assays, the biological response status of cells can be scanned at any time of culture by capturing changes in their multiplication, growth over time, or morphological changes without increasing the cost of testing. In the case of toxicity, pathological changes occur on the cells grown on the glass, or if the cell suspension is used, the cells do not spread or adhere near the test material. The zone of damaged or unstretched and non-adherent cells is the larger the more toxic the test material is. Perfect fixation of test fibers or strips allows micro-photographic images of the same location and mutual comparison of images from different time periods. As a control, cell shots of an unaffected culture, without test fibers or strips, were kept for the same time under the same conditions. The method of the invention is more sensitive than in vivo tests and allows serial verification of fiber samples. Due to the great need of laboratory animals and laboriousness, in vivo methods are not possible to work in larger series. The method according to the invention also makes it possible to monitor the biological response of animal cells to the internal part of the test material when using a monofilament fiber, vascular prosthesis or hollow fiber section.

Reprodukovatelnost výsledků získaných způsobem podle vynálezu je vyšší než u metod in vivo.The reproducibility of the results obtained by the method of the invention is higher than in in vivo methods.

Úseky vláken nebo odstřižky nebo řezy plošných tvarů v délkách 2 až 5 mm se přilepí na očištěné sklo, nejlépe bílkovinným lepidlem. Na sklo se zkoušenými vzorky se nalije buněčná suspenze s přesným počtem buněk v obohaceném kultivačním mediu a za udržované stálé teploty se od prvého styku buněk s vlákny provádí v časových intervalech mikrofotografické snímkování stejného úseku vzorku a jeho okolí. Při druhé metodě se buněčná suspenze s přesným počtem buněk nalije na očištěná skla, kde se ponechá sedimentovat. Na porostlá skla se položí úseky vláken nebo odstřižky nebo řezy plošných tvarů v délkách· 2 až 5 mm a přitlačí se proužky sterilní filtrační membrány. Potom se při258054Sections of fibers or cuttings or cuts of sheets in lengths of 2 to 5 mm are adhered to the cleaned glass, preferably with a protein glue. A cell suspension with the exact number of cells in the enriched culture medium is poured onto the glass of the test samples, and microphotographic photography of the same section of the sample and its surroundings is performed at intervals of time from the first contact of the cells with the fibers. In a second method, the cell suspension with the exact number of cells is poured onto the cleaned glass where it is allowed to settle. Strips of fibers or shavings or cuts of planar shapes in lengths of 2 to 5 mm are placed on the matted glass and pressed against the strips of a sterile filter membrane. Then at 258054

- 5 dá obohacené kultivační medium, udržuje se stálé kultivační teplota podle druhu použitých živočišných buněk. Mikrofotografické snímkování se provádí rovněž v časových intervalech od prvého styku buněk se vzorkem. Provádí se rovněž kontrolní snímky původní buněčné kultury bez vzorků, za stejných podmínek Při konečném hodnocení se vzájemně srovnávají snímky z jednotlivých časových úseků i původní buněčné kultury.5 gives an enriched culture medium, maintaining a constant culture temperature according to the type of animal cells used. Microphotographic photography is also performed at time intervals from the first contact of the cells with the sample. Control images of the original cell culture without samples are also performed, under the same conditions. The final evaluation compares images from individual time points and the original cell culture.

Výše uvedené příklady a popisy pouze vynález objasňují, ale neomeszyjí.The above examples and descriptions merely illustrate the invention but do not dissolve.

Mimo zjišťování dráždivost! a toxicity chirurgických šicích materiálů a zdravotnických materiálů určených k implantaci lze způsob dle vynálezu využít i k ověřování zdravotní nezávadnosti, například textilních materiálů a folií, které přijdou do přímého styku s Živou tkání. Této metody lze použít i pro případ, kdy dojde ke styku živé tkáně pouze s výluhem zkoušeného materiálu.Beyond detecting irritability! and toxicity of surgical suture materials and medical materials to be implanted, the method of the invention can also be used to verify the health of, for example, textile materials and sheets that come into direct contact with living tissue. This method may also be used in the case where live tissue only contacts the extract of the test material.

Způsob podle vynálezu je ilustrován následujícími příkladyThe process of the invention is illustrated by the following examples

PřikladlHe did

Úsek mikrochirurgického Silonu dekadického značení OA podle PNY 830668 v délce 5 mm byl za sterilních kaut,el přiložen k L buňkám ustálené linie HEp 2, narostlým na mikroskopickém krycím sklíčku. Vlákno bylo přitlačeno a fixováno proužkem sterilní filtrační membrány. Buňky byly pozorovány v polosyntetickém mediu MEM, obohaceném 10 % bovinního séra, antibiotiky, bikarbonátovým ústojným roztokem a fenolovou červení, sloužící jako indikátor pH, za teploty 37 °C· živé buňky byly sledovány fázově koru/trastní optikou od okamžiku kontaktu se zkoušeným vláknem po dobu 12 hodin. V intervalech 30 minut byly snímány mikrofotografické záběry.A 5 mm section of microsurgical silon of OA decadic marking according to PNY 830668 was placed under sterile cautus, el, to the L cells of the steady-state HEp 2 line, grown on a microscope coverslip. The fiber was pressed and fixed with a sterile filter membrane strip. Cells were observed in semi-synthetic MEM medium supplemented with 10% bovine serum, antibiotics, bicarbonate buffer and phenol red as a pH indicator at 37 ° C. for 12 hours. Micrographs were taken at 30 minute intervals.

Příklad 2Example 2

Úseky chromovaného catgutu délky 3 mm byly přilepeny bílkovinným lepidlem do středu dna Petriho misky průměru 50 tam.Sections of chrome catgut of 3 mm length were glued with protein glue to the center of the bottom of a 50-mm Petri dish.

- 4 Byly přelity buněčnou suspenzí, která obsahovala v 1 ml- 4 They were overflowed with a cell suspension containing 1 ml

2,5 x 1O⁵ Živých buněk linie HEp 2. V ostatním byl postup obdob ný jako v příkladu 1.2.5 x 10 ⁵ living cells of the HEp 2 line.

Snímky u každého příkladu byly vzájemně srovnány i porovnány se snímky buněčné kultury, která nebyla ve styku se zkoušenými materiály. U příkladu 1 nevyvolalo zkoušené vlákno žádné změny buněk a jejich organel, ve shodě se zkušebními metodami na pokusných zvířatech dle PNY 83-04-68 a PNY 83-04-78 byl vzorek hodnocen jako tkáňově zcela tolerantní. U příkladu 2 rozprostřely se buňky ve vzdálenosti asi 1 mm od úseku vlákna, rovněž, ve shodě s výše uvedenými oficiálními zkušebními metodami byl vzorek hodnocen jako kontaktně až lokálně mírně toxický.The images in each example were compared and compared to images of a cell culture not in contact with the test materials. In Example 1, the test strand did not induce any changes in cells and their organelles, in accordance with the test methods on test animals according to PNY 83-04-68 and PNY 83-04-78, the sample was assessed as completely tissue tolerant. In Example 2, the cells spread at a distance of about 1 mm from the fiber section, also, in accordance with the above official test methods, the sample was assessed to be slightly toxic to contact to local.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Method for biological monitoring of irritation and toxicity of fibers or sheets, characterized in that the test material in the form of fibers or sheets is contacted with live animal cells in the culture medium and the biological response of the animal cells to the test material embedded is monitored microscopically, optionally by photomicrography or micro-cinematography.

2. A method according to claim 1, characterized in that the test material is fixed to the layer of animal cells grown on the support by means of a filter membrane strip and poured over the culture medium. .

3. Method according to claim 1, characterized in that the test material is fixed to a clean substrate by means of a protein glue and is poured over a suspension of live animal cells in the culture medium.