CS258607B1 - Spdsob izolácie SH-aminokyselín, peptidov a proteínov - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká spůsobu oddelenia sulfhydrilových od nesulfhydrilových zložiek zó zmesi proteínov kovalentnóu chromatografiou. Podstata riešenia spočívá v tom, že vzorka sa naneste na kolónu obsahujúcu ako sorbent 2-nitrofenylhydrazónpropándinitrilové deriváty polymérov obecného vzorca I, kde X znamená Y—O—CO alebo Y—NH—CO a Y je anhydroglukózový polymér, polyhydroxymetylmetakrylát, gél na báze agarózy alebo celulóza zá přítomnosti tlmivého roztoku o pH až 5 a po přetečení celého objemu Vzorky sa kolóna premyje tlmivým roztokom o pH 7 až 8.

Description

Vynález sa týká spósobu izolácie SH-amínokyselín, peptidov a proteínov zo zmesi obsahujúcej sulfhydrilové a nesulfhydrilové zložky proteínov kovalentnou cbromátografiou.

SH-skupiny majú v štruktúre žívej hmoty esenciálny význam (P. J. Jocelyn: Biochemistry of SH-group, Academie Press, London — N. Y. 1972). Sú súčasťou enzýmových a proteinových štruktúr, v peptidoch sa zúčastňujú oxidačno-redukčných, katalytických, detoxikačných procesov atď. Izolácia peptidov a proteínov je vo všeobecnosti dosť zložitý problém. Jednou z možností jeho riešenia je imobilizáčia týchto látok na různých sorbentoch cez SH-skupiny zabudovaného cysteinu (K. Brocklehurst: Int. J. Biochem. 10, 259(1979], D. Podhradský, P. Kristián: Chem. zvěsti 35, 567 [1981]). Tieto metódy izolácie však narážajú na problém desorpcie z nosiča, ktorá sa vačšinou uskutočňuje vytěsňováním iným tiolom, čím sa vlastně znehodnocuje izolovaný produkt. Iným problémom bývá poměrně malá životnost sorbenta, alebo neschopnost jeho regenerácie. Napriek tomu je reverzibílna kovalentná chromatografia pre izoláciu SH látok velmi perspektivná.

Otázka váčšieho využitia kovalentnej chromatografie sa týká hlavně výboru vhodného ligandu, ktorý by specificky a reverzibilne reagoval s S.H-skupinami aminokyselin, peptidov a proteínov. Bol popísaný ligand fenylhydrazónopropándinitrilového typu, ktorý po naviazaní na celulózu umožňuje zachytávat nízkomolekulové tioly (V. Marko, P. Gemeiner, M. Antalík, E. Šturdík,

I). Drobnice, P. Kristián: Reactive Polymers 1, 91 (1983). Desorpcia z takéhoto nosiča prebieha však len pri vysokých hodnotách pH (cca 12), kedy váčšina SH-skupín sa oxiduje na disulfid. Pri próteínoch vedie takáto imobilizáčia k nevratným štrukturálnym změnám a u enzýmov sa stráca aktivita.

Uvedené nevýhody v podstatné] miere odstraňuje spósob izolácie SH-amínokyselín, peptidov a proteínov podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že vzorka sa nanesie na kolónu obsahujúcu 2-nitrofenylhydrazónpropándinitrilové deriváty polymérov obecného vzorca I

X N *C(CNl, ~^NO,

- 2 _(/) kde X znamená Y—O—CO alebo Y—NI-I—CO a Y je' ahhydroglukózový polymér, polyhydroxymetylmetakrylát, gél na báze agarózy alebo celulóza za přítomnosti tlmivého roztoku o pH 4 až 5 a po přetečení celého objemu vzorky sa kolona premyje tlmivým roztokom o pH 7 až 8. Polyméry 2-nitrofenyl-hydrazónoprppándinitrilového typu majú výhodu v tom, že pK_a hodnota ich amínoskupín sa nachádza v rozmedzí 5,3-5,6, čo principiálně znamená, že sorbujúca látka sa viaže pri pH 4—5 a uvolňuje pri pH 7—8. Viazanie a uvolňovanie SH-látok na polymer sa.móže znázornit rovnicou ^λ ” \Ρζ ^NH ~ ^N ~^C(Cn)z^+R~

N0_z

pričom X je hoře uvedené.

Popísaná metóda izolácie SH-amínokyselín, peptidov a proteínov podta vynálezu má oproti iným metodám výhody v tom, že: viazanie a uvolňovanie látky sa uskutočňuje velmi jednoducho — změnou pH v režime 4—8, čím SH-skupiny imobilizovanej látky zostávajú zachované, pri vytěsňovaní sa nepoužívá iná látka, ktorá by kontaminovala vzorku, ďalej odpadá regenerácia nosiča, stačí ekvilibrácia kolóny na pH viazania a nakoniec v dósledku vysokej reaktivity ligandu je aj vázobná schopnost nosiča velmi vysoká.

Přikladl

Izolácia SH-amínokyselín, peptidov a proteínov

Vzorka v ktorej sa nachádza glutatión, cystein, alebo iný SH-proteín v koncentrácii najviac 2 mg/ml (napr. vodný extrakt z kvasiniek, deproteínovaný homogenát živočišných, alebo rastlinných tkaniv a pod.) sa nanesie na 10 cm stípec nosiča s 2-nitrofenylhydrazónopropándinitrilovým ligandom, ktorý bol ekvilibrovaný na pH 4—5. Po premývaní pufrom o rovnakom pH, kto258607 ry obsahuje 0,01 % EDTA, sa z kolony odstránia všetky zložky neobsahujúce SH-skupiny. Po zmene pH na 8 sa z kolony vymyjú SH-amínokyseliny, peptidy alebo proteiny. Detekcia sa urobí Ellmanovým činidlom [G. L. Ellman; Arch. Biochem. Biophys. 74, 443 [1958]}, alebo UV detekciou v případe proteínov. Návratnost sorpcie je 96—97 %. Příklad 2

Separácia SH-proteínov

V pufri o pH 4—5 sa rozpustia 2 mg proteínov, ktoré sú zmesou sulfhydrilových a nesulfhydrilových zložiek. Po nanesení vzorky na kolonu s 2-nitrofenylhydrazónpropándinitrilovým ligandom sa pri pH 4 až 5 oddelia proteiny, ktoré neobsahujú SHskupiny zabudovaného cysteinu. Po gradien6 tovej zmene pufru na pH 8 sa vytesnia SHproteíny. Detekcia z kolony vychádzajúcich zložiek sa robí pomocou UV254, alebo UVzoe. Příklad 3

Koncentrovanie enzýmu mg enzýmu, ktorý obsahuje SH-skupiny [napr. ureáza, oxidoreduktázy a pod.) sa rozpustí v 5 dm³ pufru o pH 4—5 v ktorom sa nachádza 0,01 % EDTA. Uvedený roztok enzýmu sa přečerpává cez kolonu pomocou peristaltického čerpadla, pri prietoku 2 ml/min. Po přečerpaní celého objemu sa na kolóne zachytený enzým uvolní pufrom o pH 7—8. Pomocou zmeranej enzýmovej aktivity je možné zistit 100-násobné zakoncentrovanie enzýmu.

Claims (3)

1. Sposob izolácie SH-kyselín, peptidov aproteínov zo zmesi obsahujúcej sulfhydridové a nesulfhydrilové zložky proteínov kovalentnou chromatografiou pomocou nosiča s fenylhydrazónpropándinitrilovým ligandom vyznačujúci sa tým, že vzorka sa nanesie na kolonu obsahujúcu ako sorbent 2-nitrofenylhydrazónpropándinitrilové deriváty polymérov obecného vzorca I kde X znamená Y—O—CO alebo Y—NH—CO a Y je anhydroglukózový polymér, polyhydroxymetylmetakrylát, gél na báze agarózy alebo celulóza za přítomnosti tlmivého roztoku o pH 4 až 5 a po přetečení celého objemu vzorky sa kolona premyje tlmivým roztokom o pH 7 až 8.

   NH—N=C(CN)2

   NO2