CS259204B1 - Spósob přípravy enzýmových koncentrátov β -D-fruktofuranozidázy - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká spósobu přípravy enzýmových koncentrátov β -D-fruktofurano ­ zidázy z kvasiniek Saccharomyces cerevisiae, obzvlášť z kmeňov nadprodukujúcich tento enzým. Postup po uvolnění -D-furktofurano- zidázy z buniek do roztoku zahrnuje odstrá ­ nenie balastných makromolekúl sedimentáciou po predchádzajócej chemickej alebo tepelnej úpravě, selektívne zahustenie supernatantu a dehydratáciou za zníženého tlaku. Postupom možno získať tekuté alebo bezvodé preparáty β -D-furktofuranozidázy o vysokej, špecifiokej aktivitě, viac ako 7 500 U/ml, resp. 75 000 U/g sušiny, použitelné pre potravinář ­ské účely.

Description

Vynález sa týká spůsobu přípravy enzýmových koncentrátov beta-D-fruktofuranozidázy.

Beta-D-fruktofuranozidáza /EC 3.2.1.26/ je enzým, uplatňující sa v různých odboroch potravinářského priemyslu pri hydrolýze sacharózy na glukózu a fruktózu. Vyskytuje sa v hubách, nejma kvasinkách, schopných využívat sacharózu ako jediný zdroj uhlíka a energie. V buňkách kvasiniek sa tento enzým vyskytuje prevážne vo formě externého glykoproteínu a v malom množstve aj ako cytoplazmatická neglykozylovaná beta-D-fruktofuranozidáza v izolovanej alebo imobilizovanej formě, ako aj jej aktivita v kvasinkách, sú významné z hladiska biotechnologického vo viacerých odboroch potravinářského priemyslu.

Jej nevýznamnějším zdrojom sú pekárske kvasinky. Doterajšie známe spůsoby přípravy beta-D-fruktofuranozidázy sú značné komplikované a nadobudli vSčšinou iba laboratorně preparatívny význam. Využitie alkylglykoléterov a trietylénglykolu na priemyselnú výrobu enzýmu /Čsl. pat. č. 101 971/ /1960/ sa zatial z ekonomických a hygienických důvodov neujalo.

V súčasnosti popři výrobě bielkovín pre potravinářské účely z jednobunkových mikroorganizmov je snaha komplexně využiť kvasničnú biomasu i na izoláciu biologicky aktivných bielkovín, ako aj iných cenných látok, ktoré sme zatial ako produkty mikrobiálrieho metabolizmu u nás nevyrábali.

Tak je tomu i v případe beta-D-fruktofuranozidázy, ktorá sa pre potravinářsky priemysel, najmS cukrovinkárský, zatial k nám iba dováža.

Výhodou spůsobu přípravy beta-D-fruktofuranozidázy podlá vynálezu je skutočnosť, že postup zohledňuje požiadavky komplexnej frakcionácie kvasničnej biomasy a vedie k prídavkom invertázy o vysokej špeoifickej aktivitě, obzvlášť ak je aplikovaný na kmene, schopné výraznej nadprodukcie tohoto enzýmu. Naviac balastné bielkoviny, ako mezdiprodukt izolačného postupu, sú po úpravě použitelné pre potravinářské alebo krmovinárske účely.

Podstata vynálezu spočiva v tom, že beta-D-fruktofuranozidáza sa najprv uvolní z buniek kvasiniek do roztoku, a to bud autolýzou buniek, indukovanou elektrolytmi a organickými rozpúšťadlami alebo enzymatickým, resp. mechanickým rozrušením buňkových stien.

Solubilizovaná beta-D-fruktofuranozidáza z viac ako 50 % zostáva po sedimen£ácii partikulárnych buňkových štruktúr v bezbunkovém extrakte. Specifická aktivita beta-D-fruktofuranozidázy v extrakte sa zvýši hydrolýzou, resp. sedimentáciou balastných makromolekúl po ich kyselej denaturácii a izoelektrickej precipitácii. Vzniknutý supernatant s beta-D-fruktofuranozidázou se zbavi nízkomolekulárnych látok ultrafiltráciou a obsah beta-D-fruktofuranozidázy sa může dalej skoncentrovať dehydratáciou za zníženého tlaku alebo precipitáciou etanolom, resp. aoetónom. Týmto spůsobom možno získať pri 30 až 45 % výťažnosti preparáty beta-D-fruktofuranozidáza, ktorých Specifická aktivita je vyššia ako 75 000 ϋ/g sušiny, resp. 7 500 U/ml přípravku.

Vynález je možné prakticky uskutečňovat podlá niektorého z nasledujúcich príkladov bez toho, aby sa iba na ne výlučné obmedzoval.

Příklad 1

R

Buňky kvasiniek Saccharomyces serevisiae kmeňa M2A-C 2 /3,5 g Sušiny/ sa suspendovali v destilovanej vodě a dezintegrovali s účinnosťou viac ako 98 % v homogenizátore firmy Braun v přítomnosti skleněných guličiek /priemer 0,45 mm/ pri 4 °C po dobu 3 min. Homogenáty, připravené z dvakrát 3,5 g sušiny buniek sa spojili, guličky sa odstránili filtráciou cez fritu Sintr Sl, premyli a celkový objem homogenátu sa upravil na 100 ml. Sedimentáciou buňkových stien, jadier a nerozbitých buniek vznikol bezbunkový extrakt beta-D-fruktofuranozidázy. Jeho pH sa upravilo na hodnotu pH 6 a extrakt sa inkuboval 2 hod. pri 50 °C za občasného premiešania.

Po okyslení základného extraktu s HCl na pH 3,6 sa balastné makromolekuly oddělili sedimentáciou. Vzniknutý supernatant sa podrobil ultrafiltrácii a diafiltrácii cez membránu, zachytávajtícu částice o molekulovej hmotnosti 50 000 a neprepúšťajúcu beta-D-fruktofuranozidázu Vzniknutý retentát o aktivitě 8 360 U/ml sa podrobil lyofilizácii za vzniku bezvodého preparátu beta-D-fruktofuranozidázy o špecifickej aktivitě 87 030 U/g sušiny.

Příklad 2

O

100 g droždia z produkčného kmeňa s. cerevisiae M2A-C 2 sa podrobilo autolýze v přítomnosti NaCl /5 g/100 ml/a etanolu /6 g/100 ml/ v celkovom objeme 120 ml pri 40 °C po dobu 70 hod. Suspenzia autolyzovaných buniek sa odstředila, 1-krát premyla vodou a supernatanty sa spojili. Vzniknutý extrakt beta-D-fruktofuranozidázy sa podrobil ultrafiltrácii cez membránu, zachytávajúcu částice o molekulovej hmotnosti 50 000. Retentát sa vákuovo zahustil za vzniku preparátu beta-D-fruktofuranozidázy o špecifickej aktivitě 70 500 U/g.

Příklad 3

R

Buňky kvasiniek Saccharomyces cerevisiae kmeň M2A-C 2 sa podrobil enzymatickej dezintegrácii glukanázami, připravenými zo žalúdka slimákov. Buňky /10 g sušiny/ sa najprv vystavili dvojminúťovému účinku 0,5 M merkaptoetanolu pri pH 9,3. Potom sa odstředili, suspendovali v 100 ml vody, obsahujúcej 1 g enzýmového výtažku zo žalúdka slimákov a nechali inkubovať pri 30 °C po dobu 70 minút. Po sedimentácii.osmoticky, resp. enzymaticky rezistentných buniek, vznikol bezbunkový extrakt beta-D-fruktofuranozidázy, ktorý sa dalej podrobil tepelnej denaturácii, izoelektrickej precipitácii a ultrafiltrácii, ako je uvedené v příklade 1.

Retentát po ultrafiltrácii mal aktivitu 7 750 U/ml. Po dialýze retentátu oproti vodě pri 4 °C a jeho lyofilizácii, vznikol bezvodý preparát beta-D-fruktofuranozidázy o špecifickej aktivitě 76 300 U/g sušiny.

Vynález nájde široké použitie v potravinárskom priemysle pri priemyselnej výrobě beta-B*fruktofuranozidázy a jej aplikácii pri výrobě invertného cukru, ktorý je sladší a v roztokoch stabilnější, resp. rozpustnější ako repný cukor sacharóza.

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   SpSsob přípravy enzýmových koncentrátov beta-D-fruktofuranozidázy z buniek kvasiniek Saccharomyces cerevisiae , s výhodou kmeňov nadrpodukujúcich tento enzým, po uvlnení beta-D-fruktofuranozidázy do roztoku autolýzou, enzymatickou alebo mechanickou dezintegráciou buniek, vyznačujúči sa tým, že z cytosolu, vzniknutého po sedimentácii buňkových štruktúr, sa balastné makromolekuly odstránia dalšou sedimentáciou po predcházajúcom vystaveni cytosolu účinkom teploty 20 °C až 60 °C s výhodou 50 °C, pri pH 3 až 8 s výhodou pH 6, po dobu 15 min až 240 min s výhodou 120 min, bez alebo s následnou úpravou pH na hodnotu 3 až 4, na čo sa beta-D-fruktofuranozidáza skoncentruje ultrafiltráciou, na ultrafiltroch zachytávájúcich částice o molekulovej hmotnosti 50 000 až 500 000, a odpařením vody za zníženého tlaku pri teplote 4 °C až 50 °C.