CS259289B1 - Spósob uvofňovania cytoplazmatického obsahu kvasiniek indukovanou autolýzou - Google Patents

Abstract

Uvedené riešenie rozšiřuje paletu doposial' používaných iniciačných faktorov autolýzy. Podstata riešenia spočívá v tom že na vstupnú surovinu o sušině 5 až 30 % hmot. sa pósobí aktívnym autolyzátom v objemovom pomere 1 : 3 až 1 : 12, zmes sa lyžuje za miešania pri teplote 45 až 55 °C počas 5 až 30 hodin. Na vstupnú surovinu sa súčasne s autolyzátom móže pósobiť etanolom v hmotnostnom pomere 1 : 99 až 1 : 9 a/alebo chloridom sodným v hmotnostnom pomere 1 : 999 až 1 : 9.

Description

Vynález sa týká spósobu uvoíňovania cytoplazmatického obsahu kvasiniek indukovanou autolýzou za účelom získavania potravinářsky a farmaceuticky využitelných buňkových komponent.

Na rozrušenie bunkovej steny a tým sprístupnenie proteínov a ostatných zložiek biomasy kvasiniek sa používajú rózne fyzikálně, chemické a biochemické spósoby dezintegrácie, pričom potřebný stupeň rozrušenia buňky sa dosahuje často kombináciou týchto metod.

Jednou z fyzíkálnych metod dezintegrácie je balotínová dezlntegrácia, čo je vlastně drvenie alebo mletie biomasy v zariadeniach s róznymi abrazívami (Mogren, H., Lindblom, H., Hedenskog, G., Biotechnol. Bioeng. 16, 261—274, 1974). Nevýhodou tohto spósobu je poměrně velký otěr abrazíva, s čím súvisí potřeba viacnásobného premývania a lokálně zahrievanie susepnzie vyžadujúce chladenie.

Vysokotlaková metoda dezintegrácie (Brookman, J. S., Biotechnol. Bioeng. 17, 465—479, 1975} spočívá v tom, že suspenzia kvasiniek prechádza z oblasti vysokého tlaku cez trysky dezintegračného zariadenia do oblasti normálneho tlaku. Rozbitie buniek je v priamej závislosti na hodnotě hydrostatického tlaku a na rýchlosti změny tlaku v prostředí, v ktorom sú buňky suspendované. Aj pri poměrně vysokých hodnotách tlaku sa však tento spósob vyznačuje poměrně nízkou účinnosťou, nesúcou so sebou nutnost viacnásobne opakovat proces, čím vznikajú fragmenty róznych velkostí a problémy pri ich separácii. Navýše zahrievanie pri změnách tlaku móže viesť k inaktivácii intrancelulárnych enzýmov.

Principem dezintegrácie explozívnou dekompresiou je nasýtenie suspenzie vhodným plynom pod tlakom a rýchle zníženie tlaku (Nesterov, A. I., Stavoroitova, G. A., Prikl. Biochim, Mikrobiol. 11, 593—597, 1975). Následkom vyrovnávania tlakového rozdielu vo vnútri buňky a jej okolí dochádza k rozrušeniu buňkových stien. Vnútrobunečný obsah však zostáva z velkej časti vnútri buniek, natoofko rozrušená buňka po krátkodobom pósobení dezintegrácie už nie je mechanicky namáhaná. To si vyžaduje nutnost viacnásobného opakovania dezintegrácie.

Okrem týchto najznámejších spósobov dezintegrácie sa zriedkavo využívá aj ultrasonikácia, zmrazovanie, sušenie.

Chemické spósoby spočívajú v pósobení určitých látok (napr. tiolovj na zložky bunkovej steny, čím sa buňková stená labilizuje až ropzadá (Shetty, J. K., Kinsella, J. E., Biotechnol. Bioeng. 20, 755—766, 1978].

Biochemické metody sú založené na enzymatickom pósobení cudzleho alebo vlastného lytického aparátu na bunkovú stenu. V experimentálnych podmienkach je hojné rozšířené napíná využívanie exogénnych systémov (Phaff, M. J., Adv. Chem. Ser. 160, 249—282, 1977) získaných z baktérií Arthrobacter luteus, Bacillus subtilis, húb Oerskowia, Albus, Coprinus, Flavus a dalších, alebo- sa v laboratórnom rozsahu využívá tráviaca šťava slimáka Helix pomatia.

Poměrně menej sa využívá endogénny lytický systém kvasiniek (Chrenova, Ν. M., Bezrukov, M. G., Kogan, A. S., Sergejev, W. A., Nahrung 25-, 837—844, 1981). Buňka za určitých okolností (vyčerpáme živin, nevhodná teplota, Ph) produkuje lytické enzýmy — andopeptidázy, karboxypeptidázy, aminopeptidázy, kyslú řosfatázu, j3-(l,3)glukanázu, ktoré pósohie na vlastnú bunkovú stenu a rozkladajú ju. Tento proces — autolýza priebeha v konečnom dósledku až dorozloženia buniek na základné zložky ako sú aminokyseliny, patidy, nukleotidy, nízkomolekulové sacharidy, vitamíny atď. Ak sa však vedle len do určitého požadovaného stupňa, móže slúžiť ako vhodný prostriedok na dezintegráciu buňky a uvoíňovanie proteínov a iných vnútrobunečných zložiek do prostredia. Doba prirodzeného autolytického procesu je poměrně dlhá (niekolko dní), čo vyvolává riziko bakteriálnej kontaminácie.

Tento nedostatok v podstanej miere odstraňuje spósob podía vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že na vstupná surovinu o sušině 5 až 30 % hmot. sa pósobí aktívnym autolyzátom v objemovom pomere 1 : 3 až 1 : 12, zmes sa lyžuje za miešania pri teplote 45 až 55 °C počas 5 až 30 hodin. Na vstupná surovinu sa súčasne s autolyzátom móže pósobiť etanolom v hmotnostnom pomere 1 : 99 až 1 : 9 a/alebo- chloridom sodným v hmotnostnom pomere 1 ku 999, až; 1 : 9.

Spósob podía vynálezu rozšiřuje paletu doposial¹ používaných inřciačných faktorov autolýzy. Spočívá v iniciácii autolýzy přidáním. vhodného množstva už zhyzovanej suspenzie tohoistého mikroorganizmu. V pridávanom lyzáte sú už neprodukované a uvolněné lytické enzýmy, ktoré móžu hned atakovat buňkové steny,, tieto sa stávajú prístupnejšle vlastnému lýtickému systému, ktorý sa zatial utvoří a proces rozloženia buňky sa takto podstatné skráti na 5 až 30 hodin.

Kombináciou s inými iniciačnými faktormi, ako je chlorid sodný a etanol sa ešte zefektivni pósobenie autolytického systému. Ak ako kritérium autolytickej dezintegrácie buniek používáme množstvo uvolněných proteínov, tak potom sa týmto spósobom, t. j. prídavkom etanolu, chloridu sodného a aktívneho autolyzátu k suspenzii za niekolko hodin z buňky uvolní 50—80 θ/o z celkových proteínov, stanovených Lowryho metodou.

Vhodný poměr přidávaného aktívneho autolyzátu k biomase zabezpečuje, že sa k mikrobiálnej suspenzii přidá dostatočné množstvo lytických enzýmov a přitom čo ných spósoboch iniciácie autolýzy udává tanajmenej ulitizovatefných živin. bulka 1.

Množstvo uvolněných proteínov pri rózTabulka 1

Množstvo proteínov uvolněných do supernatantu (v %) z póvodného obsahu proteínov v intaktnom droždí, pri roznych dobách a spósoboch iniciácie autolýzy. Etanol, respektive chlorid sodný přidávaný vo· výsledČas 50 °C 50 °C (h) NaCl

1	0,7	0,9
5	4,6	5,6
10	9,0	12,1
24	36,3	46,3

Příklad 1 te 3 1 kvasničnej suspenzie o sušině 10 % a obsahu proteínov 32,8 mg/ml sa přidá 600 ml štandardného autolyzátu, 30 g chloridu sodného, 150 g etanolu a zmes sa inkubuje za miešania pri 50 °C. Po 5 hodinách sa suspenzia scentrifuguje, pričom sa získá 730 g sedimentu, využitelného na izoláciu například ergosterolu a 2 812 ml supernatantu o sušině 4,1 % a obsahu proteínov

15,5 mg/ml využitelného na izoláciu proteínov.

Příklad 2

Postup rovnaký ako v příklade 1, lýza sa však nepřeruší po 5. hodině, ale po 24. hodině. Po centrifugách sa z rovnakého množstva suspenzie získá 639 g sedimentu a 3 044 ml supernatantu o sušině 6 % a obsahu proteínov 25 mg/ml.

Příklad 3

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 1 000 ml aktívneho autolyzátu a 60 g chloridu sodného. Získaný supernatant má sušinu 9,1 % a obsah proteínov 48,5 mg/ml. Příklad 4

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 3 g chloridu sodného a 30 g etylaikoholu. Získaný supernatant má sušinu 7,4 % a obsah proteínov 43,0 mg/ml.

Příklad 5

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 150 g chloridu sodného a 300 g etylaikoholu. Získaný supernatant má sušinu 11 % a obsah proteínov 44 mg/ml.

nej koncentrácii 5 % hmot., autolyzát v množstve zodpovedájúcom 1/6 objemu vstup-

nej suroviny 10 %).	(kvasničné	mlieko o sušině
50 °C	50 °C	50 °C
etylalkohol	autolyzát	etylalkohol NaCl autolyzát
1,9	17,5	18,2
7,1	26,6	37,2
16,0	45,3	68,5
50,9 Příklad 6	64,7	78,8

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa 500 ml aktívneho autolyzátu, 60 g chloridu sodného a 30 g etylaikoholu. Získaný supernatant má sušinu 8,2 θ/o a obsah proteínov 44 mg/ml.

Příklad 7

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 150 g chloridu sodného a 500 ml aktívneho autolyzátu, získaný supernatant má sušinu 11,2 % a obsah proteínov 41,5 mg/ml. Příklad 8

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 500 ml aktívneho autolyzátu, 3 g chloridu sodného a 300 g etylaikoholu. Získaný supernatant má sušinu 6,9 % a obsah proteínov 46,2 mg/ml.

Příklad ‘9

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 100 ml aktívneho autolyzátu, 150 g chloridu sodného^ a 30 g etylaikoholu, Získaný supernatant má sušinu 10,7 % a obsah proteínov 46,2 mg/ml.

Příklad 10

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 100 ml aktívneho autolyzátu, 3 g chloridu sodného. Získaný supernatant má sušinu 6,2 % a obsah proteínov. 36,2 mg/ml. Příklad 11

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 100 ml aktívneho autolyzátu, 60 g chloridu sodného a 300 g etylaikoholu. Získaný supernatant má sušinu 7,0 % a obsah proteínov 40,5 mg/ml.

Claims (2)

1. PREDMET

   1. Spósob uvofňovania cytoplazmatického obsahu kvasiniek indukovanou autolýzou vyznačujúci sa tým, že na vstupnú surovinu o sušině 5 až 30 % hmot. sa pósobí aktívnym autolyzátom v objemovom pomere 1 ku 3 až 1 : 12, zmes sa lyžuje za miešania pri teplote 45 až 55 °C počas 5 až 30 hodin.

   VYNALEZU
2. 2. Spósob uvoTňovania cytoplazmatického obsahu kvasiniek podlá bodu 1 vyznačujúci sa tým, že na vstupnú surovinu sa súčasne s autolyzátom pósobí etanolom v hmotnostnom pomere 1 : 99 až 1 : 9 a/alebo chloridom sodným v hmotnostnom pomere 1 : 999 až 1 : 9.