CS259704B1 - Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenu myší - Google Patents

Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenu myší Download PDF

Info

Publication number
CS259704B1
CS259704B1 CS84452A CS45284A CS259704B1 CS 259704 B1 CS259704 B1 CS 259704B1 CS 84452 A CS84452 A CS 84452A CS 45284 A CS45284 A CS 45284A CS 259704 B1 CS259704 B1 CS 259704B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
load
fractions
serum
sediment
sucrose
Prior art date
Application number
CS84452A
Other languages
English (en)
Other versions
CS45284A1 (en
Inventor
Anna Jandova
Jiri Coupek
Jaroslav Sanitrak
Karel Motycka
Otakar Mach
Jan Pekarek
Original Assignee
Anna Jandova
Jiri Coupek
Jaroslav Sanitrak
Karel Motycka
Otakar Mach
Jan Pekarek
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anna Jandova, Jiri Coupek, Jaroslav Sanitrak, Karel Motycka, Otakar Mach, Jan Pekarek filed Critical Anna Jandova
Priority to CS84452A priority Critical patent/CS259704B1/cs
Publication of CS45284A1 publication Critical patent/CS45284A1/cs
Publication of CS259704B1 publication Critical patent/CS259704B1/cs

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu přípravy imunologicky funkční frakce získané ze séra inbredních kmenů laboratorních myší, např. infikovaných virem zvyšujícím izoenzym laktátdehydrogenázu. Výsledkem je imunologicky účinná frakce.
Autoři vynálezu se zabývali stanovením izoenzymu LDH (1.1.1.27 L-iactate: NAD oxidoreduktázy) u experimentálních i lidských nádorů) ve vztahu k chemoterapii. Pokud se používalo v experimentálním studiu myší různých, kmenů, autoři zjistili, že izoenzym 'LDII jo ojediněle v myším séru významně zvýšen ještě před pokusem. Toto zvýšení způsobuje LDH virus, „perfektní“ parazit u myší. LDH virus (Rileyův virus, LDVJ je zařazen mozi neklasifikované „pomalé“ RNA viry. Jeho replikace nevyžaduje DNA-dependentní syntézu ribonukleové kyseliny. Jeho reservoárem je populace divokých myší, jimž působí doživotní onemocnění. Autoři sledovali tento jev dále a po rozvinutí gelové chromatografie a některých imunologických metod se pokusili o detekci protilátkové odpovědi na toto agens i u lidských pacientů. K ověření zvolili takové choroby, u nichž byla již dříve popsána zvýšená aktivita izoenzymu LDH.
Autoři zjistili, že u pacientů s nejrůznějšími druhy zhoubných nádorů a prekance2 roz existuje významná imunologická odpověď lidského leukocytu v různých imunologických testech na frakce získané z myšího LDH viru. Též jsou na tyto frakce citlivé leukocyty pacientů s infarktem myokardu, pacientek, které spontánně potrácejí bez gynekologické příčiny a u nichž je vyloučeno onemocnění Jinými virozami nebo antropozoonozami a konečně pacientů se schizofrenií.
Způsob přípravy imunologicky funkční frakce získané ze séra inbreidních kmenů laboratorních myší, např. C3H, infikovaných virem zvyšujícím izoenzym laktátdehydrogenázu spočívá podle vynálezu v tom, že myší plazma získaná z krve upravené heparinem se podrobí nejméně dvojnásobné centrifugám po dobu 20 až 30 min. při zatížení 3 až 3,5 X 101 * 3 g, odebraný supernatant se čeří 1 až 2 min. při 9 až 11 X 1O3 g, získaný supernatant se podrobí další centrifugám po dobu 50 až; 70 min. při zatížení 50 až 100 X 103 g, získaný sediment se suspenduje v pufru majícím pH 7 až 7,4 sestávajícím z tris (hydroxymethyl)-aminomethan-NaCl (Tris-NaCIJ a dvojsodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny v minimálním objemu maximálně 1 ml s rovnovážnou centrifugací v sacharozovém hustotním gradientu se rozdělí a oblast odpovídající 32 až 38 % hmot. sacharózy s maximem 35 % hmot. sacharózy se odebere a po neředění výše uvedeným pufrem v objemovém poměru 1 : 0,5 až 1,5 se podrobí centrifugaci při zatížení 50 až 100 x 103 g, 50 až 70 min. přičemž manipulace s krevní plazmou až po získání posledního sedimentu se provádí při 2 až 6 C, získaný sediment se rozpustí v 1,5 až 3,0 ml fyziologického roztoku a podrobí se vysokotlaké gelové chromatografii, frakce odpovídající molekulové hmotnosti 3 .105 až 1,5 . 104 jsou imunologicky aktivní. Rovnovážná centrifugace se provádí po dobu 180 až 210 min při zatížení 150 až 180 X X 103 g. Jako stacionární fáze pro vysokotlakou gelovou chromatografii se použije Seiparon Herna — glcR, který je suspenzním kopolymerem 2-hydroxyethylmethakrylátu s ethylendlmethakrylátem s vylučovacím limitem kolony vyjádřeným molekulovou hmotností 3 X 105, velikost partikulí gelu je 32 až 40 fim, k detekci se používá diferenciální refraktometr a UV spektrofotometr s variabilní vlnovou délkou. Jako mobilní fáze se používá fyziologický roztok a jímá se frakce při vínové délce 340 nm.
Popsaným způsobem zhotovené frakce jsou použitelné v různých imunologických testech, testech pro buňkami médiovanou imunitu, pro protisměrnou elektroforézu na agarozovém gelu, elektrofokusaci, pro značení radioizotopy, pro studium hormonálních receptorů, pro experimentální ipráce v cytogenetice a genetickém inženýrství s cílem stanovit včasnou diagnostiku a monitorování níže uvedených onemocnění. Získané frakce jsou velice časnými (až několik let před vypuknutím onemocnění) pozitivními marketv lidskému tělu cizí ribonukleové kyseliny, která pravděpodobně kontaminuje lidské i zvířecí nádory, šedou kůru mozkovou schizofreniků a srdeční sval postižený infarktem myokardu, jakož i endometrium žen, které potrácejí z gynekologicky nezjistitelné příčiny a u nichž nebylo zjištěno jiné virové onemocnění.
Jestliže jsou frakce získané z LDH viru v libovolném z výše uvedených testů u pacienta pozitivní, lze konstatovat, že je v těle přítomen tzv. univerzální rizikový faktor a je nutno dále testovat stejnou metodou citlivost jednotlivých orgánů, zda nejsou napadeny. V tom případě se použijí antigeny připravené z těchto orgánů podle AO 254 706. Pozitivní orgánová odpověď bývá přítomna 3,5 i více len před výskytem prekancerózy a 10 i více let před výskytem nádoru.
U infarktu myokardu lze analogicky použít k testování frakce získané z LDH viru a jsou-li pozitivní, pak frakce získané ze srdce postiženého infarktem myokardu.
U onemocnění schizofrenií lze použít k testování frakce získané z LDH viru a jsou-11 pozitivní, pak frakce získané ze šedé kůry mozkové.
U žen potrácejících z gynekologicky nezjistitelné příčiny, u nichž je vyloučeno jiné virové onemocnění, ev. antropozoonóza, lze použít k testování frakce získané z LDH viru a jsou-li pozitivní (nutno testovat i jejich partnery], ipak u ženy frakce získané z lidského karcinomu endometria.
Statisticky významné pozitivní výsledky se získají také u tzv, kontaktů, to jest u osob, které žijí s výše uvedenými nemocnými ve společné domácnosti. Nejčastěji mají takové osoby pozitivní testy na frakce získané z LDH viru, ale také na orgánový antigen většinou stejný jako nemocný, 1 když se cítí zdrávy.
Stanovení tzv. rizikového faktoru, to jest frakcí získaných z LDH viru, má význam proto, že se hodí jako levný časný markér lidskému tělu cizí ribonukleové kyseliny, k vytypování a monitorování skupiny obyvatelstva, z níž později pocházejí v časovém pořadí ženy potrácející z gynekologicky nezjistitelné příčiny, nemocní kardiovaskulárními chorobami, schizofrenií, nemocní zhoubnými nádory.
Význam stanovení spočívá v kombinaci vytypovaných antigenů a v jejich pravidelném sledování u rizikových skupin, protože se zdá, že adaptace lidského organismu na LDH virovou ribonukleovou kyselinu může být mírou zdraví jedince a naopak, že včasnými zásady do obranyschopnosti by k některým onemocněním nemuselo dojít. V tétm souvislosti doporučujeme provést vyšetření na LDH virus u partnerů před početím dítěte. Jsou-li oba pozitivní, je plod ohrožen.
V následujícím je předmět vynálezu osvětlen na příkladu, který však nijak neomezuje jeho rozsah:
Příprava imunologicky funkčních frakcí získaných ze séra myší infikovaných LDH virem.
Myši týden inokulované sérem obsahujícím infekční LDH virus se vykrvácí podstřižením, krev po sražení a 30 min stání při teplotě místnosti se podrobí centriíugování při zatížení 2.1Ό3 g 20 min. Sérum se upraví heparinem a podrobí se dvakrát centrifugování při zatížení 3,5 . 103 g po dobu 25 min při teplotě -j- 4 °C. Získaný supernatant se po dobu 2 min při teplotě -j- 4 °C podrobí další centrifugaci při zatížení 104 g. Získaný spernatant se opět centrifuguje při zatížení 5.104 při + 4 °C 60 min. Obdrží se sediment, který obsahuje virus. Suspenduje sé v max. 1 cm3 pufru o pH 7 až 7,4. Pufr sestává z tris (hydroxymethylj-aminomethan-NaCl (Tris-NaCl) a dvojsodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny.
Suspenze se navrství na sacharózový hustotní gradient 15 až 50 % hmot. a centrifuguje se při zatížení 105 g 4 h nebo při 5.104 g přes noc při + 4 °C.
Gradient se rozdělí a bere se frakce v oblasti 35 % sacharózy, obsahující virus.
Naředí se výše uvedeným pufrem 1:1a znovu se centrifuguje při zatížení 5 .104 g 1 h při + 4 °C. Získaný sediment se rozpustí ve 2 cm3 fyziologického roztoku a zataví se do ampulí. Uchovává se ve zmrazeném stavu.
Obsah ampule se po rozmražení injukuje do kolony po 1 ml a dělí se pomocí vysokotlaké gelové chromatografie. Kolona je naplněna suspenzním kopolymerem 2-hydroxyethyl-methakrylátu a ethylendimethakrylátu s vylučovacím limitem 3.105. Detekce se provádí diferenciálním refraktometrem R 043 a UV průtokovým spektrofotometrem s variabilní vlnovou délkou. Jako mobilní fáze se používá fyziologický roztok a jímá se frakce při vlnové délce 340 nm s molekulovou hmotností 105 až 1,5 . 104.

Claims (2)

predmet
1. Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenů myší, infikovaných virem zvyšujícím izoenzym laktátdehydrogenázu, vyznačující se tím, že myší plazma získaná z krve upravené heparinem se podrobí nejméně dvojnásobné centrifugaci po dobu 20 až 30 min při zatížení 3 až 3,5 X 103 g, odebraný supernatant se čeří 1 až 5 min při zatížení 9 až 11 X 103 g, získaný supernatant se podrobí další centrifugaci po dobu 50 až 70 min. při zatížení 50 až 100 X 103 g, získaný sediment se suspenduje v pufru o pH 7 až 7,4 sestávajícím z tris (hydroxymethylj-aminomethan-NaCl (Tris-NaCl) a dvojsodné sole ethylendiamintetraoctové kyseliny v objemu maximálně 1 ml, rovnovážnou centrifugací v sacharózovém hustotním gradientu (po dobu 180 až 210 min při zatížení 150, až 180 X 103 g) se rozdělí a oblast odpovídající 32 až 38 % hmot. sacharózy s maximem 35 % sacharóYNALEZU zy se odebere a po naředění výše uvedeným pufrem v objemovém poměru 1 : 0,5 až 1,5 se podrobí centrifugací při zatížení 50 až 100 x 103 g, 50 až 70 min., přičemž manipulace s krevní plazmou až po získání posledního sedimentu se provádí při 2 až 6 °C, získaný sediment se rozpustí v 1,5 až 3,0 ml fyziologického roztoku a podrobí se vysokotlaké gelové chromatografii a zachycují se frakce odpovídající molekulové hmotnosti 3 .105 až 1,5.104 jako imunologicky aktivní.
2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že jako stacionární fáze pro vysokotlakou gelovou chromatografii se použije suspenzní kopolymer 2-hydroxyethyl methakrylátu s ethylendimethakrylátem s vylučovacím limitem 3 X 105 a velikostí částic gelu 32 až 4Q μΐη a jako mobilní fáze se používá fyziologický roztok.
CS84452A 1984-01-19 1984-01-19 Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenu myší CS259704B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS84452A CS259704B1 (cs) 1984-01-19 1984-01-19 Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenu myší

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS84452A CS259704B1 (cs) 1984-01-19 1984-01-19 Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenu myší

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS45284A1 CS45284A1 (en) 1988-03-15
CS259704B1 true CS259704B1 (cs) 1988-10-14

Family

ID=5336608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS84452A CS259704B1 (cs) 1984-01-19 1984-01-19 Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenu myší

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS259704B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS45284A1 (en) 1988-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hehlmann et al. RNA in human leukemic cells related to the RNA of a mouse leukemia virus
Krishnan et al. Immunopathologic studies of systemic lupus erythematosus. II. Antinuclear reaction of γ-globulin eluted from homogenates and isolated glomeruli of kidneys from patients with lupus nephritis
Kaiser et al. STUDIES ON THE PATHOGENESIS OF FEVER: IX. THE PRODUCTION OF ENDOGENOUS PYROGEN BY POLYMORPHONUCLEAR LEUCOCYTES
CA1052245A (en) Detection of breast cancer
Cooper et al. In vivo release of glycoprotein I from the Ha subline of TA3 murine tumor into ascites fluid and serum
EP0067646B1 (en) In vitro method and test kit for determining cellular immunocompetence
Breederveld et al. The localization of factor V within normal human platelets and the demonstration of a platelet‐factor V antigen in congenital factor V deficiency
Bouma et al. Presence of factor VIII-related antigen in blood platelets of patients with von Willebrand's disease
US4329331A (en) Diagnostic method for detection of systemic lupus erythematosus
RU2437098C1 (ru) Способ экспресс-определения атерогенности крови (варианты)
EP0313156A1 (en) SnRNP-A antigen and fragments thereof
Hockmeyer et al. A complement fixation test for visceral leishmaniasis using homologous parasite antigen I
Steward et al. Circulating antigen-antibody complexes in onchocerciasis
CS259704B1 (cs) Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí ze séra inbredních kmenu myší
Savolainen et al. Enhanced IgE response to Candida albicans in postoperative invasive candidiasis
RU2130615C1 (ru) Способ экспресс-диагностики туберкулеза на основе реакции латекс-агглютинации
US4474876A (en) Flow cytometric analysis of histamine receptors
RU2530627C2 (ru) Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах
CN100519759C (zh) 一种制备用于快速检测伤寒的凝集试剂的方法
Inami et al. Micro-hemagglutination tests for detection of native and single-strand DNA antibodies and circulating DNA antigen
Helson et al. Carcinoembryonic antigen in children with neuroblastoma
Chenthamarakshan et al. Diagnostic potential of fractionated Brugia malayi microfilarial excretory/secretory antigen for bancroftian filariasis
RU2050003C1 (ru) Способ диагностики трансформации кератоакантомы в плоскоклеточный рак кожи
EP0439548B1 (en) Provision of density specific blood cells for the structuredness of the cytoplasmic matrix (scm) test
Rasyid et al. Identification of IgG and IgM in TB Patients During 2 Months of Treatment Using SDS-PAGE