CS260068B1 - Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3987 s vysokou produkci hydrolázy 7/3-(4-karboxybutanamido)cafalosporánovékyseliny - Google Patents

Abstract

Řeěení se týká nového kmene mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3 987, produkující ve zvýšeném množství vnitrobuněčný enzym, hydrolázu Ίβ-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny, pro přípravu 7-aminocefemsloučenin, zejména 7-aminocefalosporánové kyseliny, která je výchozím meziproduktem pro výrobu polosyntetických cefalosporinů, například cefazolinu.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3 987 s vysokou produkci hydrolázy 7-beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny použitelného pro enzymovou přípravu 7-aminocefemsloučenin zejména pro přípravu 7-aminocefalosporánové kyseliny (dále jen 7-ACK ). 7-ACK je významný meziprodukt pro přípravu polosyntetických cefalosporinových antibiotik, např. cefazolinu.

Je známo, že působením specifického enzymu hydrolyzujícího amidickou vazbu, hydrolázy 7-beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny (dále jen glutaryl-7-ACK ), lze získávat 7-aminocefemsloučeniny obecného vzorce I ^H2N-I—ΓΊ

-CHjX

COOH (I), ve kterém X značí atom vodíku, skupinu -OH, -OCOCHj nebo nukleofilní skupinu, z jejich 7-acylaminoderivátů obecného vzorce II

A,—CO—ΝΗΟ'

COOH (II), ve kterém R značí skupinu -(CH₂>₃-COOH nebo -(CH₂)₃-CO-COOH a X značí totéž co ve vzorci I.

Mikrobiální kmeny s aktivitou uvedeného enzymu lze použít pro dvoustupňovou enzymovou technologii přípravy 7-ACK z cefalosporinu C, tj. sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém X značí skupinu -OCOCH-j a R skupinu -(CHj)j-CHNHj-COOH. Tato enzymová technologie zahrnuje přípravu 7-acylaminocefemsloučenin obecného vzorce III, kde R značí skupinu -(CH₂)₃~COOH, to jest 7-beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny neboli 3-acetometoxymetyl-7-beta-(4-karboxybutanamido)-cef-3-em-4-karboxylové kyseliny, a její následnou hydrolýzu.

Zmíněné 7-acylaminocefemsloučeniny lze získat z cefalosporinu C, a popř. z jeho derivátů bud chemicky (japonské patentové spisy č. 7 777 078 a 78 112 891),nebo enzymaticky působením permeabilizovaných resp. imobilizovaných buněk, producentů oxidázy D-aminokyselin (bristký patentový spis č. 1 272 769, japonské patentové spisy č. 7 688 694, č. 7 744 695, č. 77 125 696, č. 77 128 295 a č. 79 154 592 a čs. autorské osvědčení č. 251 457, závislé na čs. autorském osvědčení č. 231 458)

Pro hydrolýzu uvedených 7-acylaminocefemsloučenin jsou popsány kmeny Pseudomonas ovalis, Comamonas (japonské patentové spisy č. 75 101 584 a č. 7 670 884), Bacillus, Arthrobacter a Alcaligenes (japonské patentové spisy č. 77 128 293 a č. 7 886 094) .

V čs. autorském osvědčení č. 239 293 je popsán kmen Pseudomonas sp. CCM 3 635 vykazující konstitutivní syntézu vnitrobuněčné hydrolázy glutaryl-7-ACK, takže není nutno do kultivačních živných půd přidávat induktor syntézy enzymy, glutarovou kyselinu. Další výhodou tohoto kmene je, že nevykazuje nežádoucí aktivitu beta-laktamáz.

Předmětný vynález se týká nového mikrobiálního vysokoprodukčního kmene, který byl odvozen z rodičovského kmene Pseudomonas sp. CCM 3 635 chemickou mutagenezí a výběrem monokoloniových izolátů, jehož výhoda ve srovnání s původním kmenem je více jak dvojnásobná specifická aktivita hydrolázy glutaryl-7-ACK, při zachování původních vlastností rodičovského kmene, které jsou z průmyslového hlediska výhodné, tj. syntéza tohoto enzymu v nepřítomnosti induktoru v živné půdě (konstitutivita) a neschopnost syntetizovat beta-laktamázy. Ostatní biochemické charakteristiky nového kmene se neliší od rodičovského kmene.

Nový kmen je uložen v čs. sbírce mikroorganismů (Czechoslovak Collection of Microorganismus) , Univerzita J. E. Purkyně, Brno, tř. Obránců míru 10, pod označením Pseudomonas sp.

CCM 3 987.

. Množství této specifické hydrolázy v buňkách bylo kvantitativně určováno měření počáteční rychlosti hydrolýzy glutaryl-7-ACK v prostředí 0,1 M fosfátového pufru o pH 7,0 a teplotě 37 °C v oblasti enzymové kinetiky nultého řádu. Produkty reakce byly stanoveny spektrofotometricky za použití p-dimetylaminobenzaldehydu (Balasingham a sp., Biochim. Biophys. Acta 276, 250, 1972). Jedna jednotka (U) enzymové účinnosti hydrolázy glutaryl-7-ACK je takové množství enzymu, které odpovídá tvorbě jednoho mikromolu (1 jum) 7-ACK za minutu za výše uvedených podmínek reakce. Specifická aktivita je definována, jako U . g^-1 suché hmoty buněk. Pro chromatografii byla použita tenká vrstva celulózy a systém n-propanol-voda (7:3) s ninhydrinovou detekcí (R_f 0,5) se semikvantitativním vyhodnocením na densitometru Vitatron TLD 100. Obsah účinné látky v produktu byl ověřen vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC).

Předmětný kmen Pseudomonas sp. CCM 3 987 je použitelný pro enzymovou hydrolýzu glutaryl7-ACK připravenou buá chemicky (chemickou syntézou) nebo enzymově (oxidací cefalosporinu C oxidázou D-aminokyselin). S výhodou lze předmětný vysokoprodukční kmen využít jako výchozí zdroj pro výrobu imobilizovaných biokatalyzátorů a to jak na bázi imobilizovaných buněk, tak pro izolaci a následnou imobilizaci této specifické hydrolázy. Předmětný kmen lze rovněž využít pro další genovou manipulaci s cílem multiplikace strukturálních genů nesoucích informaci pro syntézu tohoto enzymu.

Výhodou využiti nového kmene Pseudomonas sp. CCM 3 987 ke podstatně vyšší specifická aktivita hydrolázy glutaryl-7-ACK v průměru o 150 % ve srovnání s rodičovským kmenem. Biosyntéza tohoto enzymu u předmětného nového vysokoprodukčního kmene se na konci kultivace pohybuje v rozmezí 220 až 270 U . litr^ kultivační kapaliny a specifická aktivita buněk dosahuje 50 až 75 U . g^-1 suché hmoty buněk.

Tyto výhodné vlastnosti nového kmene umožňují zkrácení doby během hydrolýzy oxidovaných forem cefalosporinu C, zejména glutaryl-7-ACK, čímž se sníží celkové množství nežádoucích vedlejších produktů.

Dále je v genealogickém schématu uvedeno kvalitativní a kvantitativní srovnání vlastností kmene mikroorganismu s aktivitou hydrolázy glutaryl-7-ACK.

Charakteristika Přírodní izolát kmene Pseudomonas sp.

Přítomnost beta-laktamáz +

Indukce snytézy enzymu glutarovou kyselinou +

Specifiská aktivita

Pseudomonas sp. CCM 3 635

Pseudomonas sp. CCM 3 987

25_

208,3 až 75

417 až 625

V následujících příkladech provedení je detailně popsán způsob získání nového vysokoprodukčního kmene mikroorganismu.

Příklad

Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3 987 byl získán tímto postupem. Kulturou kmene Pseudomonas sp. CCM 3 635 vyrostlou na šikmém masopeptonovém agaru bylo očkováno 100 ml tekuté živné půdy v 500 ml varných baňkách následujícího složení: 1 % pepton, 0,5 % hovězí extrakt, 0,1 % kvasničný extrakt, 0,5 % chlorid sodný. Baňky byly inkubováný na rotačním třepacím stroji o frekvenci 240 otáček . min ¹ při teplotě 28 °C po dobu 24 hodin.

ml této kultury první vegetativní generace inokula bylo použito pro očkování živné půdy stejného složení při stejném plnění baněk a provedena kultivace za jinak stejných podmínek. Kultura druhé vegetativní generace byla ve druhé třetině exponenciální fáze růstu buněk asepticky odstředěna a supernatant slit. Separované buňky (sediment, byly za aseptických podmínek promyty sterilním 0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 a suspendovány do stejného objemu téhož pufru. Připravená suspenze buněk byla poté přidána k roztoku N-metyl-N'-nitro-N-nitro7 8 — i soguanidínu ve stejném pufru tak, aby výsledná směs obsahovala cca 10 až 10 buněk . ml a 150 fig uvedeného mutagenu . ml

Směs byla míchána 60 minut při teplotě místnosti a poté byla vyseta na Petriho misky obsahující pevnou živnou půdu s masopeptonovým agarem. Po třídenní inkubaci při 28 C byly vyrostlé kolonie pomoci sametových razidel přeneseny na pevnou půdu na Petriho misky obsahující 0,5 % bílkovinného hydrolyzátu (komerční výrobek Vitana), 0,5 % kvasničného extraktu, 0,1 % kukuřičného extraktu a 0,3 % p-nitroanilidu glutarové kyseliny (sterilizace této látky filtraci přes sterilní Seitz filtr) a 2 % agaru.

Po 14denní imkubaci při 28 °C byl proveden výběr monokolonlových izolátů (klonů), jehož princip spočívá v tom, že kolonie, které byly nejmenší, byly vyočkovány na mosopeptonové šikmé agary.

Poté byly jednotlivé izoláty, po jejich submersní kultivaci v baňkách prováděné výše uvedeným způsobem a v tekuté živné půdě obsahující 1 % peptonu a 25% filtrátu roztoku 4 % kukuřičného extraktu (který byl předem předsrážen za varu při pH 7,6), opět výše popsaným způsobem mutagenizovány pomocí stejného chemického mutagenu.

Suspenze po mutagenezi byla vyseta na pevnou neselektivní masopeptonovou živnou půdu v Petriho miskách a provedena pasivní selekce monokolonlových izolátů, které byly testovány submersní jednorázovou kultivací v baňkách následujícím způsobem.

500 ml varné baňky byly naplněny 100 ml tekuté živné půdy dříve uvedeného složení (obsahující pepton a předsrážený kukuřičný extrakt), do které byly očkovány monokoloniové izoláty ze šikmých masopeptonovýoh agarů, které byly získány dvojitou mutagenezi a cílenou a pasivní selekcí. Baňky byly inkubováný na rotačním třepacím stroji způsobem a za podmínek uvedených dříve po dobu 24 hodin.

Po uvedené době bylo 5, ml kultury takto připravené první vegetativní generace použito pro inokulaci 100 ml tekuté živné půdy v 500 ml varných baňkách, jejíž složení bylo: 5 % bílkovinného hydrolyzátu (komerční výrobek Vitana) a 50 ml filtrátu roztoku 4 % kukuřičného extraktu předsráženého předem za varu při pH 7,6. Druhá vegetativní generace kultur byla kultivována za jinak stejných podmínek po dobu 42 hodin. Poté byly kultury separovány odstředěním (16 000 G 10 minut), supernatant slit, buněčný sediment promyt stejným Objemem 0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 a připraveny standardní suspenze buněk v témže pufru obsahující 8 mg suché hmoty buněk . ml^-7. Tyto suspenze byly dále hodnoceny na specifickou enzymovou aktivitu hydrolázy glutaryl-7-ACK ve srovnání s kontrolní suspenzí buněk rodičovského kmene, které rovněž vyrostly za,stejných kultivačních podmínek, přičemž reakční podmínky stanovení jsou uvedeny v popisu předmětného vynálezu.

Ze série zkoumaných monokolonlových izolátů (klonů), které byly podrobeny kvantitativní enzymové analýze popsaným způsobem vyplynulo, že pouze jeden z nich dosahuje specifické aktivity v rozmezí 50 až 75 U . g^-1, což jest o 100 až 200 % vyšší specifická aktivita ve srovnání s rodičovským kmenem.

Claims (1)

1. Kmen mikroorganismu Pseudomonas species CCM 3 987 s vysokou produkcí hydrolázy 7-beta-(4-karboxybutanamido)cefalosporánové kyseliny.