CS261305B1 - Mezidruhový (potkan x myš) lymfocytární hybridom produkující protilátku proti stadijně specifickému embryonálnímu antigenu TEC-4 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká mezidruhového (potkan x myš) lymfocytárního hybridomů, produkujícího protilátku proti stadijně specifickému embryonálnímu antigenu, uloženého ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS TEC-04. Monoklonální protilátka hybridomů je vhodná pro identifikaci buněk, nesoucích stadijně specifický embryonální antigen TEC-4 (časná preimplantační stadia) a pro biochemickou a biologickou analýzu cílové antigenní struktury.

Description

Vynález se týká nového hybridomů, t j . hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a krysí slezinné buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu TEC-4 přítomnému na povrchu myších embryonálních a embryonálních karcionomových buněk.

Studium řady aspektů vývojové biologie, buněčné diferenciace i onkologie vyžaduje používaní vysoce specifických protilátek rozpoznávajících stadijně-specifické embryonální antigeny. Protilátky proti antigenům buněčného povrchu, které nevykazují vnitrodruhový polymorfismus, nelze připravit přímou imunizací zvířete jednoho druhu buňkami nebo jejich membránovou frakcí jiného druhu, t j . konvenční imunizací. Konvenční imunizace má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti řadě membránových antigenů, z nichž některé jsou přítomny na řadě buněčných typů. Konvenční séra nelze proto běžně používat k jemnému rozlišení buněčných typů. Příprava čistého antigenu, vhodného pro konvenční imunizaci, je pracná a většinou neúspěšná.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomů - monoklonální protilátka - je namířen vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li připraven dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něj podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozpoznává antigen s vlastnostmi stadijně-specifického embryonálního antigenu, tj., že se vyskytuje jen na buňkách určitého stadia embryogenese a na buněčných liniích, které mají některé vlastnosti embryonálních buněk.

Na povrchu embryonálních a embryonálních karcinomových buněk se nachází řada stadijně-specifických embryonálních antigenů. Podle publikovaných výsledků (souborně: Feizi, T.: Demonstration by monoclonal antibodies that carbohydrate structures of glycoproteins and glycolipids are oncodevelopmental antigens. Nátuře 314, 53 až 57, 1985; Muramatsu, T.:

Cell surface glycoproteins as markers in monitoring in vitro differentiation of embryonal carcinoma cells. Cell Differ. 15:101 až 108, 1984) se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky, které specificky reagují pouze s určitým stadiem embryogeneze. Všechny doposud připravené a charakterizované monoklonální protilátky proti stadijně-specifickým diferenciačním antigenům rozpoznávají cukerné determinanty, které se nacházejí bud na glykolipidech nebo na glykanu o molekulové hmotnosti více než 10 000, nazývaného embryoglykan. ·

Podstatného pokroku v analýze myší embryogeneze, buněčné diferenciace i při řešení problémů onkologie, projevujícího se v rozšíření spektra používaných signálních znaků, se dosáhne je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti nově zjištěné antigenní determinantě embryonálních a embryonálních karcinomových buněk, uložený ve Sbírce hybridovů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská 1 083, pod označením IMG CZAS TEC-04.

Uvedený hybridom byl získán postupem známým z odborné literatury (Kóhler, G., Milstein,

C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nátuře 256:495 až 497, 1975; Kennett, R. H., McKearn, T. J., Bechtol, Κ. B. (eds.): Monoclonal antibodies, hybridomas: A new dimension in biological analysis, Plenům Press, New York and London, 1980). Pro fúzi byly použity buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buňky získané ze sleziny potkana kmene Lewis imunizovaného buňkami embryonální karcinomové linie P19XT.1.1, defektní v expresi embryoglykanu.

Výhodou uvedeného hybridomů je, že produkuje homogenní (monoklonální) protilátku, která specificky reaguje pouze s vajíčky a časnými preimplantačními stadii myších embryí a embryonálními karcinomovými buňkami. Hybridom TEC-04 je možné kultivovat in vitro v mediígh určených pro savčí buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině bezthymových nu/nu myší. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možné zahájit produkci protilátky, aniž by bylo nutné provádět imunizace a náročná testování na specifitu protilátek.

Příklad

Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 10⁶ hybridomových buněk do peritoneální dutiny bezthymových nu/nu myší. Aby došlo k větší produkci ascitické tekutiny, byla myš 14 dnů před aplikací hybridomových buněk ovlivněna olejem 2,6,10,14-tetramethylpentadecanem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 12 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byly z myši odebrány 3 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 6 mg/ml imunoglobulinu. Monoklonální protilátka reagovala v nepřímém imunofluorescenčním testu s neoplozenými vajíčky, oplozenými vajíčky a dvoubuněčnými stadii myších embryí a nereagovala s 16buněčnými stadii, morulami a časnými a pozdními blastocystami Balb/c myší. Výsledky přímého radioimunologického a nepřímého fluorescenčního testu prokázaly, že protilátka reaguje pouze s embryonálními karciomovými buňkami a nikoliv s diferencovanými buňkami. Při diferenciaci embryonálních karcinomových buněk, indukované kyselinou retinovou, došlo během tří dnů kultivace k úplnému vymizení antigenu u všech buněk s morfologickými projevy diferenciace (viz tabulka)

Tabulka

Reaktivita protilátky produkované hybridomem TEC-04 s buněčnými liniemi.

Buněčná linie ¹ Test použitý pro detekci reaktivity ' radioimunologický³ imunofluorescenční⁴ (vázaná aktivita) cpm ( i pozitivních buněk)

Embryonální karcinomové buňky P19S1801A1

PCC4

Diferencované buňky P19S1801A1-RA-3 dny² PYS-2

LEC 12

000 6 800

800 200 300 netestováno ipůvod a kultivační podmínky a exprese jiných stadijně-specifických embryonálních entigenů jsou uvedeny v práci Dráber, P., Pokorná, Z.: Differentiation antigens of mouše teratocarcinoma stem cells defined by monoclonal antibodies. Cell Differ. 15, 109 až 113, 1984.

²Buňky linie P19S1801A1, u kterých byla indukována diferenciace působením 10 ⁶M kyselinou retinovou, jak popsáno dříve (Dráber, P., Stanley, P.: Isolation and characterization of lectin-resistant F9 cells. Sómat. Cell Genetics 10, 445 až 454, 1984).

12 5

Byl použit přímý radioimunologický test, ve kterém I-značená monoklonální protilátka £

(100 000 cpm) byla inkubována s 0,25x10 buněk, a byla měřena radioaktivita vázaná na buňky jak popsáno dříve (Dráber, P., Stanley, P.: Cytotoxicity of plant lectins for mouše embryonal carcinoma cells. Sómat. Cell Genetics 10, 435 až 443, 1984).

⁴Byl použit nepřímý imunofluorescenční test, ve kterém buňky byly inkubovány postupně s monoklonální protilátkou, králičí protilátkou proti monoklonální protilátce a FITC-značenou anti-králiči protilátkou.

Monoklonální protilátka rozpoznává antigenní determinantu, která byla označena TEC-4, která se liší od všech doposud ve světové literatuře popsaných antigenních determinant stadijně-specifických embryonálních antigenů. K vymezení unikátnosti antigenů. K vymezení unikátnosti antigenní determinanty TEC-4 bylo použito pěti přístupů.

1) Monoklonální protilátka reagovala v přímém radioiraunologickém a nepřímém imunofluorescenčním testu s panelem linií embryonálních karcinomových buněk a nereagovala s buněčnými liniemi odvozenými od diferencovaných buněk. Protilátka reagovala rovněž s neoplozenými a oplozenými vajíčky a dvoubuněčnými stadii myšších embryí a nereagovala s 16buněčnými stadii, morulami a časnými a pozdními blastocystami.

2) V absorpčních testech s tkáněmiz dospělých zvířat reagovala monoklonální protilátka pouze s homogenátem z ledvin a nereagovala s homogenátem z mozku, jater, plic, brzlíku, sleziny, testes, epididymis a svalu.

3) Při indukci diferenciace embryonálních karcinomových buněk linie P19S1801A1 10 kyselinou retinovou došlo k poklesu vazby protilátky na buňky s morfologickými projevy diferenciace {viz tabulka).

4) Monoklonální protilátka precipitovala glykoprotein buněčného povrchu o molekulové hmotnosti přibližně 230 000, prokázaný pomocí elektroforetické analýzy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného.

5) Monoklonální protilátka reagovala s mutatními buňkami embryonálních karcinomových buněk, které jsou defektní v expresi embryoglykanu. To znamená, že TEC-4 epitop, na rozdíl od epitopů jiných stadijně-specifických embryonálních antigenů nacházejících se na vysokomolekulárních nosičích, není vázán na embryoglykan.

Buňky hybridomu TEC-04 mají morfologické znaky typické pro myelomové buňky. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním mediem je Eaglovo minimální esenciální medium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM) a pyruvát sodný (ImM). Toto medium (označované H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu TEC-04 doplněno penicilinem, streptomycinem a teplotěn (56 °C, min) inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10%). Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační doba je 17 hod. 4 měsíce po sestrojení byl modální počet chromozomů 78. Produkovaná monoklonální protilátka je krysí imunoglobulin třídy IgG.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem TEC-04 reaguje specificky s vajíčky a časnými preimplantačními stadii myších embryí a embryonálními karcinomovými buňkami.

Hybridom TEC-04 může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky pro identifikaci buněk nesoucích stadijně-specifický embryonální antigen TEC-4 a pro biochemickou a biologickou analýzu cílové antigenní struktury.

Claims (1)

1. Mezidruhový (potkan x myš) lymfocytární hybridom IMG CZAS TEC-04, produkující protilátku proti stadijně specifickému embryonálnímu antigenu TEC-4.