CS261811B1 - Process for preparing cellulose enzymes and/or enzymes for the degradation of cell wall - Google Patents

Description

Předkládaný vynález sa týká postupu výroby celulázových enzýmov a/alebo enzýmov na odbúranie bunkovej blány prostredníctvom aeróbnej submerznej kultivácie mutantov pliesní. Vytvořený komplex enzýmov možno použit na čiastočné alebo úplné odbúranie celulózy, ako aj hemicelulóz v priemyselných produktoch, odpadoch, odpadových vodách alebo při odbúraní živých alebo odumretých rastlinných buňkových stien.

Je známe, že enzýmy celulázového komplexu sa vyrábajú aeróbnou submerznou kultiváciou pliesní. Známe postupy sa líšia hlavně čo do použitých kmeňov pliesní, čo do substrátov, použitých při fermentačn-om procese a čo do sposobu vedenia procesu. Hospodárnost získavania celuláz je v podstatě definovaná enzymatickou aktivitou, docielenou v jednotke objemu fermentačného média, množstvom enzýmu, vyprodukovaného za časovú jednotku (enzymatickou produktivitou], ako aj množstvom enzýmu, vytvořeného a vztiahnutého na použitý substrát (výťažok enzýmu). Ako vhodní producenti celuláz sú známe najma pliesňové kmene rodov Aspergillus, Penicillium a Trichoderma.

Napr. podlá patentu DD-WP 225 712 sa používá ako producent celulázy Penicillium janthinellum, pričom ako substrát sa používá celulóza v kombinácii s předpřipravenou zelenou rezankou. Při šaržovitej kultivácii sa při použití spolu 6 % celulózy, pridanej к zelenej rezanke po 8 dňoch dosiahne celulázová aktivita 6 medzinárodných jednotiek/cm³ při skúške na filtračnom papieri, čo zodpovedá výtažku 100 medzinárodných jednotiek/g celulózy. V inom postupe, podlá JP 59—151 888 sa ako producent celulázy používá kmen Trichoderma koningii: ako substrát slúži mikrokryštalická celulóza (Avicel) v koncentrácii 3 °/o. Výsledné enzymatické aktivity po 7 dňoch holi 11,5 medzinárodnej jednotky/cm³ (m. j./cm³) v případe endo-beta-glukanázovej aktivity a 0,85 m. j./cm³ v případe exo-celobiohydrolázy, čo zodpovedá výtažku exocelobiohydrolázy potrebnej na odbúranie mikrokryštalickej celulózy v rozsahu 28,3 m. j. na gram celulózy; zodpovedajúca produktivita je 5 m. j. exocelobiohydrolázy na dm³ a hodinu. Z patentovej a odbornej literatúry známi producentami celuláz s dosiaf najvyššou známou tvorbou celuláz, patria к druhu Trichoderme reesei (predtým Trichoderma viride). Za účelom zlepšenia tvorby celuláz sa vypěstovali rožne mutanty Trichoderma reesei.

V patentovom spise DD—VO 80/01080 sa popisuje tvorba celuláz pomocou mutantu Trichoderma reesei MCG 77. Tvorba celuláz sa potláča glukózou, nie však glycerolom; laktóza indukuje tvorbu celuláz. Celulázová aktivita v živnom médiu obsahujúcom 1 % celulózy představuje 1 až 1,8 m. j./cm³ FPA, v živnom médiu s 1 % laktózy 1,35 m. j./cm³ FPA a v živnom médiu s 1 % laktózy a 1 % celulózy 1,75 m. j./cm³ FPA. V patentovom spise US 4 472 504 sa popisuje tvorba celuláz pomocou mutanta Trichoderma reesei MCG 80, ktorý bol vyšfachtený z mutanta Trichoderma reesei Rut C 30. Při použití živného média s 8 % celulózy a s přísadou biotínu sa při diskontinuálnej fermentácii dosahuje celulázová aktivita 17,2 m. j./cm³ FPA, čo zodpovedá výtažku 215 m. j. FPA/g celulózy. Při kultivácii rovnakého kmeňa na živnej pode s 2 % laktózy sa dociefuje celulázová aktivita 1,7 m. j./cm³ FPA, čo zodpovedá výtažku 85 m. j. FPA/g laktózy. Tieto mutanty Trichoderma reesei vytvárajú na základe celulózy, najma mikrokryštalickej celulózy a bavlnenej celulózy poměrně vysoké celulázové aktivity, nie však na základe rozpustných substrátov, ako naipr. glukózy. Z toho okrem vysokých nákladov na substrát vyplývájú aj nedostatky pře vedeme procesu.

Vyšlechtili sa aj mutanty Trichoderma reesei, ktoré sú schopné produkovat celulázy na základe glukózy, ako zdroja uhlíka. O produkcii celuláz mutantmi T. reesei při použití glukózy ako substrátu sa referovalo na 3. európskom kongrese o biotechnologii (Mnichov, NSR, 10. až 14. septembra 1984; M. Bailey: „Produkcia celulázy mutantmi Trichoderma reesei na necelulózovej pode“). Najvyššia popísaná celulázová aktivita sa získala pomocou mutanta T. reesei VTT-D-79 125 na základe 4 % glukózy -b 4 % liehovarského mláta a představovala 6,4 m. j./ /cm³ FPA. S celulózou namiesto glukózy sa pri tomto kmeni dosahovala přibližné rovnaká celulázová aktivita.

Všetky známe postupy na získavanie celuláz majú tú nevýhodu, že výtažky celulázy, vztiahnuté na použitý substrát sú poměrně nízké, alebo že vyžadujú nákladné substráty, ako mikrokryštalickú celulózu alebo bavlnenú celulózu, alebo že celulázové aktivity dosahované vo fermentačnom médiu su nízké, alebo že zvýšením koncentrácie substrátu nie je možné proporcionálně zvýšenie celulázovej aktivity.

Cielom vynálezu je dosiahnúť vysoké aktivity celulázového erizýmového komplexu pri použití cenovo výhodných substrátov a súčasne dosiahnúť vysoké výtažky enzýmu v přepočte na substrát, aby sa tak zaručilo efektívne využitie objemu fermentora a využitie substrátu. ~

Podstatou vynálezu je získať vylepšené celulázové mutanty a použit ich v kultivačnom procese, pričom v jedinom fermentačnom stupni dosiahnúť vysoké celulázové aktivity pri rovnomernom vysokom výtažku celulázy vzhfadom na substrát a pri použití cenovo výhodných substrátov.

Podlá vynálezu sa úloha rieši tak, že mutanty pliesne Trichoderma reesei ZIMET 43 803 a/alebo Trichoderma reesei ZIMET 43 804 sa kultivujú aeróbne na submerzne známým spósobom v živnej pode, ktorá ob sáhuje jeden alebo viac substrátov, ktoré samé alebo v kombinácii s jedpým alebo viacerými neindukujúcimi substrátmi indukujú 'tvorbu celulázy a/alebo tvorbu enzýmov, odbúravajúclch bunkovú blánu,

Zistilo sa, že tieto mutanty sa vyznačujú tvorbou celulázy s čiastočne potlačenou tvorbou katabolitov aj vo vztahu ku glukóze a že tieto· mutanty vylučujú do půdy vysoké koncentrácie enzýmov celulázového komplexu aj na rozpustných substrátech, ako je napr. glukóza alebo laktóza. Obidva uvedené kmene boli získané mutáciou z kmeíia Trichoderina reesei CCI a bolí deponované v depozite zbierky kultúr ZIMET v Ústrednom ústave pre mikrobiológiu a exiperimentálnu terapiu Akadémie vied NDR a registrované pod číslami ZIMET 4’3 80i3, potažné ZIMET 43 804.

Kmene sú charakterizované nasledovnými znakmi.

Popis kmeňa (morfológia, fyziológíaj:

Obidva kmene sa vyznačajú 'morfologickými znakmi, typickými pre rod Trichoderma a líšia sa vo fyziologických vlastnostiach, čo do tvorby celulázy.

Udržiavanie kmeňov je možné na živných půdách vhodných pre kmene rodu Trichoderma. Vhodný je napr. zemiakovo-glukózový agar alebo sporulaičný agar (síran amonný 0,2 %; primárný fosforečnan draselný 0,5 per cent; glukóza 2 %; kvasničný extrakt 0,7 %; agar 2 %). Málo vhodný pre udržiavanie kmeňa je Czapek-Doxov agar, lebo sa; nezistilo, že by popísané kmene boli schopné asimilovat dusitany ako zdroj dusíka. Vhodná kultivačná teplota je 28 až 30 °C, trvanie kultlvácie asi 5 až 6 dní a dalších 5 až 7 dní pri Izbovej teplote až do plného vyvinutia kmeňa. Preočkovanie sa robí prostredníctvom konídií; farba konídií je zelená, zo začiatku žltozelená.

Udržiavanie kmeňa v lyofilizovanej formě alobo nad potažné v. kvapalnom dusíku je možné pomocou všeobecne praktizovaných metod, bez toho, že by sa doteraz mohol pozorovat pokles schopnosti syntetizovat celulózu.

Obidve kmene majú schopnost produkovat celulózu pri čiastočnom. potlačení represívncho vlivu katabolitov, t. j. v přítomnosti 1’ahko asimilovatelných substrátov, •ako sú napr. různé cukry alebo glycerol, sa až do určitej koncentrácie substrátu tvoria celulážové enzýmy. Schopnost tvořit celulázu sa u obidvoch deponovaných kmeňov liší čo do oblasti koncentrácií 1'ahko asimilovatelných substrátov, v kterých tvorba celulázy nie je ešte potlačená.

Schopnost vytvárať celulázu s potlačením tvorby katabolitov sa dá testovat s použitím metódy B. S. Montecourta a D. E. Eveleigha (Applied and Enviromental Microbiology 33, 1977, 178—183).

Ako substrát na agarovom médiu slúži v kyselině napučaná celulóza v kombinácii s příslušným skúmaným represorom, najmá glukózou, fruktózou, xylózou, laktózou, potažné glycerolom. Za účelům obmedzenia velkosti kolónií sa do agarovej půdy přidává bengálska červeň v koncentrácií 30 mg/ /dm^{1 * 3}. Hrúbka agarovej vrstvy sa upraví na 4 mm. Pri priemere misky 9 cm je účelné precčkovať na jednu misku 100 až 200 konídií. Na základe uvedenej metódy sa kultiváciou a na ňu navádzujúcou inkubáciou pri 45 °C počas 20 hodin vytvoria vyčírené zóny, pričom životaschopnost konídií ostane zachovaná.

Preto možno týmto spůsobom uplatnit aj klonovú selekciu. Tvar a velkost jednotlivých kolónií je u popísaných kmeňov rozdielna, v závislosti od použitého substrátu. Na celulózovom agare sa tvoria vefké kolónie s priliebavým tenkým mycéliora, zatial čo kolónie na glukóze, potažné fruktóze sú menšie, podobné koloniálnym 'mutantom, majú hrubšiu vrstvu mycélia a silnejšie sporulujú. Vo všeobecnosti v okolí sline vyvinutých kolónií dochádza к odfarbeniu agaru s ibengálskou červeňou. Testovanie schopnosti produkovat celulázu pri potlačení tvorby katabolitov u popísaných kmeňov je možné aj v skúmavkách. Napr. konídié sa preočkujú na agarovú půdu s celulózou napučanou v kyselině v kombinácii s příslušným skúmaným represorom, avšak bez přídavku bengálskej červene. Je účelné, aby priemer skúmaviek bol 9 mm. Ako měřítko schopnosti tvorby celulázy slúži hlbka v.yčírenia; kuultivácia a inkubácia pri 45 sa robí rovnako, ako v případe doškového testu.

Kmeň ZIMET 43 804 vykazuje s ohladom na glukózu a fruktózu výraznejšiu schopnost produkovat celulázu pri čiastočne potlačenej produkcii katabolitov:

Substrát

ZIMET 43 803

ZIMET 43 804 °/o celulózy 2 mm % celulózy · I- 5 % laktózy 8 mm °/o celulózy -j- 5 % glukózy 0 mm % celulózy 5 % fruktózy 0 mm °/o celulózy 5 % glycerolu, 2 mm mm '5 mm mm mm mm (celulóza napučaná v kyselině) (hlbka vyčírenia pri skúmavkovom teste)

281 Sil

Teplota kultivácle mutantov T. reesei ZIMET 43 803 a T. reesei ZIMET 43 804 je 22 až 36 C, přednostně 30 až 34 °C pře rast mycélia a 25 až 30 °C pre tvorbu enzýmu. Hodnota pH pre kultiváciu je v oblasti 2 až 7, přednostně 2,5 až 5,5 pre rast mycélia a 3,2 až 6,0 pre tvorbu enzýmu. Ako kultivačně nádoby sú vhodné všetky fermentory, prevádzkovateřné s vylúčením cudzej infekcie, ktoré zaručujú dostatočné zásobovanie kyslíkom a v ktorých nedochádza к trvalým a extrémně vysokým střihovým silám, ktorým je neustále vystavená značná časť fermentačného média.

Východiskům pre kultiváciu sú konídiá povrchových kultúr, najma kultúr na šikmom agare na zemiakovo-dextrózovej půdě. Ako inokulum pre fermentačné médium slúžia konídiá, přednostně v koncentrácil 10⁷ až 10⁹ na liter fermentačnej pódy, alebo suspenzie vegetatívneho mycélia, přednostně v množstve 1 až 15 obj. % pódy, ktorá sa má zaočkovať. Na očkovanie velkých fer· mentorov je účelné Inokulum přidávat' vo vlacerých stupňoch po sebe. Vedenie procesu pri kultivácii mutantov T. reesei ZIMET 43 803 alebo T. reesei ZIMET 43 804 za účelom získavania celulázových enzýmov alebo enzýmov, odbúravajúcich buňkové steny, je rozdielne v závislosti od použitých substrátov alebo substrátových komblnácií, ako aj od zloženia enzýmov, ktoré sa má doslahnuť. Na vytvorenie celulázového enzymového komplexu bez zvýšeného podielu vedlejších aktivit, ako je např. xylanázová aktivita a glukanázová aktivita, možno použit ako indukujúci substrát čistú celulózu, prlčom výhodné je upravit pH a teplotný profil fermentačného média podlá příkladu 1. AŽ do koncentrácie asi 3 °/o celulózy je při diskontinuálnej fermentácii vytvořené množstvo celulázového enzýmu úměrného množstvu použitej celulózy. Vyššie koncentrácie celulózy vedú sice к vyššej koncentrácil celuláz, avšak prírastok koncentrácie celuláz už nie je úměrný množstvu použitej celulózy, takže výtěžnost celuláz vztlahnutá na množstvo substrátu klesá. Zvýšenle -koncentrácie enzýmu celulázy, úměrné množstvú použitej celulózy je možné podlá popísanej prítokovanej techniky (fed-batch), pri ktorej sa přívod celulózy riadi regulačným zariadením alebo počítačom rladeným ovládáním procesu v závislosti od obsahu oxidu uhličitého CO2 vo fermentačnom odpadovom plyne tak, že vývoj oxidu uhličitého, vztiahnutý na bielkoviny mycélia ostává pri inak rovnakých procesových parametroch počas podávania substrátu přibližné rovnakým. Pomocou pšeničných otrúb alebo inej zložky komplexného živného média sa méže zvýšit rozvoj vedlejších aktivit, ako celobiázovej a xylanázovej. Na výrobu enzýmov na odbúranie bunkovej steny pliesní sa ako Indukujúci substrát pri diskontinuálnom procese s výhodou používajú buňkové steny pliesní. Vytvořený enzymatický komplex má zloženie, na základe ktorého je vhodný například na výrobu živých pliesňových protoplastov.

Získavanie celulázových enzýmov na báze rozpustného Indukujúceho subtrátu alebo rozpustných neindukujúcich substrátov v komblnácií s indukujúcimi substrátmi, sa vykonává podfa tohoto vynálezu pomocou fed-hatch techniky, pri ktorej sa rozpustné indukujúce substráty alebo rozpustné neindukujúce substráty alebo kombinácie rozpustných Indukujúclch a rozpustných neindukujúcich substrátov privádza do fermentačného média tak, že skutočná koncentrácia rozpustných substrátov vo fermentačnom médiu sa upraví tak, aby bola v oblasti, v ktorej sa tvorba celuláz indukuje, alebo aspoň nepotláča. Horná hranlca tejto oblasti sa stanovuje stupňom schopnosti produkovat' celulázu pri čiastočnom potlačení tvorby katabolitov, ktorý stupeň zodpovedá příslušnému použitému substrátu.

Fermentaéný proces fed-batch techniky sa skládá s dlskontlnuálneho úseku (batoh) a fázy doplňovania substrátu (úsek fed-batch). Dlskontinuálna fáza slúži na kultiváciu mycélia, zatial čo vo fáze doplňovania substrátu dochádza prevážne ku tvorbě enzýmu. Dodávanle substrátu sa riadi prostřed níctvom koncentrácie oxidu uhličitého vo fermentačných odpadových plynoch. Ak sa nepridávajú neindukujúce substráty, musí základné živné médium obsahovat aspoň jeden indukujúci substrát, ako např. celulózu, pšeničné otruby alebo liehovarské výpalky. Ak sa prldávajú rozpustné Indukujúce substráty, nemusí živné médium obsahovat žladne dalšie Indukujúce látky; v tomto případe je aj možné kultivovat mycélium v diskontinuálnom úseku fermentácie na báze nelndukujúcich substrátov, ako např. glukózy, sacharózy alebo glycerolu.

Je aj možné začat s prívodom rozpustných indukujúclch substrátov ihned¹ po zaočkovaní, ked sa očkovanie robí pomocou vegetatívneho mycélia v koncentrácii najradšej 2 až 8 g/dm³ v přepočte na sušinu. Pri použití rozpustných indukujúcich substrátov, ako napr. laktózy, je aj možné kontinuálně oddělovat z fermentačného média vylůčené enzýmy pomocou známých membránových separačných procesov. Pomocou mikrofiltrácie sa od enzýmov oddella tuhé látky (plesňové mycélium) a pomocou ultraflltrácie nízkomolekulárne rozpustné zložky živnej pódy. Je účelné tuhé látky okamžité vracať do živného média, zatial' Čo časť alebo celý ultrafiltrát sa zavádza do přidávaného indukujúceho substrátu a spolu s týmto sa vracia do fermentačného média.

Oddelovanie a čistenie získávaných enzýmov sa může robit pomocou známých postupov. Podl'a aplikácie možno použit nespracované fermentačné médium, končen261811 trát kultúry, sušené surové enzýmy alebo rafinované enzýmy.

Specifická aktivita surových celulázových enzýmov, fermentovaných na báze drevitej celulózy alebo laktózy, je v rozmedzí 1,4 až 1,9 m. j. (FPA)/<mg bielkoviny.

Příklad 1:

Vo fermentori s hrubým objemom 30 dm³ sa za účelom získavania celulázových enzýmov kultivuje kmeň Trichoderma reesei ZIMET 43 803. Ako substrát sa používá dřevitá celulóza He.weten 10 Hz; fermentácia sa vedle v diskontinuálnom procese.

Fermentor je opatřený všeobecne používaným šesťlistovým vrtulovým miešadlom, ktorého celkový priemer je asi třetina vnútorného priemeru fermentor-a. Výška zabudovania miešadla vo fermentori je asi jedna patina celkovej výšky vnútorného priestoru fermentora. Zásobovanie fermentora plynom sa robí cez krúžok, nachádzajúci sa pod miešadlom, pričom tento krúžok má priemer přibližné rovnaký ako miešadlo a je opatřený 1 mm širokými otvormi vo vzdialenosti po 8 mm. Fermentor je vybavený bežne používanou meracou a regulačnou technikou, najmá zariadením na meranie a reguláciu teploty, zariadením na meranie a reguláciu pH, zariadením na meranie a reguláciu rozpuštěného kyslíka, zariadením na meranie koncentrácle oxidu uhličitého v odpadových fermentačných plynoch, s ovládacím signálom, například na ovládanie dávkovačích čerpadiel, čo zaručuje ochranu před nadměrným přidáváním odpefíovača. Osobitne vhodný je fermentor, ktorý umožňuje proces riadený počítačom.

Živné médium má následovně zloženie:

celulóza He.weten 10 Hz	30,0 g/dm3
síran amónny	4,8 g/dm3
dihydrogénfosforečnan
draselný	3,0 g/dm3,
síran horečnatý,
heptahydrát	0,4 g/dm3
chlorid vápenatý	0,3 g/dm3
peptón	1,5 g/dm3
Tweon 80, polyoxyetylén-	1,0 g/dm3
sorbitan monooleát
roztok stopových solí	10,0 cm3/dm3
Zloženie roztoku stopových solí:
heptahydrát síranu
železnatého	0,50 g/dm3
heptahydrát síranu
manganatého	0,16 g/din3
heptahydrát síranu	0,14 g/dm3
zinočnatého
chlorid kobaltnatý	0,20 g/dm3

Zložky živného média potřebné na přípravu 16 dm³ sa vhodným spósobom rozpustia v 16 dm³ vody, potažné sa suspendujú a s vylúčením qudzích zárodkov sa zavedú do sterilizovaného fermentora. Napokon sa do fermentora zaočkuje 1 dm³ čerstvej suspenzie mycélia ako inokula.

Inokulum sa připravuje v trepačkovej kultúre. Používajú sa rovnaké zložky živného média ako pre 30-litrový fermentor, ale koncentrácia KH2PO4 sa zvýši na 15 g/dm³ a navýše sa do média přidá 0,9 g/dm³ močoviny; koncentrácia ostatných přidávaných zložiek je rovnaká, ako v živnom médiu vo fe.rme,ntori.

Připraví sa 10 baniek po 100 cm³ tohto živného média a s vylúčením cudzích zárodkov sa každá banka zaočkuje asi 10⁷ konídiami deponovaného kmeňa T. reesei ZIMET 43 803. Kulitivácia sa robí na bežnej trepačke, používanej na kultiváciu mikroorganizmov* pri teplote 30 °C. Dlžka kultivácie je 36 až 60 h. až do zaočkovania fermentora.

Teplota kultivácie sa na začiatku fermentácie nastaví na 30 ^cC; regulačně medze pre pH sa nastavia na 3,5 (dolná hranica) a 5,5 (horná hranica regulácie) počet otáč-ok miešadla sa nastaví na 500/min. a intenzita plynenia na 30 norma lnych dm³ vzduchu za hodinu a 1 dm³ fermentačného média, čo zodpovedá celkovému množstvu 4'50 normálnych dm³ vzduchu za hodinu. Proti tvorbo pěny sa používá silikonový odpeňovač. Podlá stavu a veku inokula je hodnota pH na začiatku fermentácie v želanom rozmedzí asi od 4,0 do 5,4. Počas fermentácie dochádza к poklesu pH, pri dosiahnutí dolnej regulačnej hranice sa pomocou 12 %-ného čpavkového roztoku udržiava konštantným na úroyni 3,5. Niekedy sa zaznamená v počiatočnej fáze dočasný rast pH, ktorý sa pri dosiahnuití hor.ne-j regulačnej hranice zastaví a udržiava na úrovni 5,5 pomocou 10 %-nej kyseliny sírovej.

Pri dosiahnutí rastu mycélia, ktorý zodpovedá logaritmické] fáze rastu jednobunkových org-anizmov, nastaví sa teplota fermentácie 11a 28 °Ό. Tento okamžik sa dosiahne asi po 35 až 60 hodinách a je rozoznatelný stúpaním koncentrácie oxidu uhličitého v odpadovom plyne fermentora. V predkladanom příklade sa pri dosiahnutí koncentrácie CO2 vo vysušenom odpadovom plyne vo výške 0,2 % obj. nastaví fermentačná teplota na 28 ^,0C. Koncentrácia CO2 rastie ďalej a po překročení maxima opať klesá. Fermentácia sa ukončí po 120 až 1'50 hodinách, keď koncentrácia CO2 v odpado-vom plyne z fermentora klesne na 0,05 % obj. alebo nižšie a hodnota pH stupně.

Celulázová aktivita v kultivačnom filtráte představuje na konci fermentácie 9,0 až 9,4 m. j. FPA/cm³ na filtračný papier, čo zoclpovedá výťažku 300 až 310 m. j. FPA na gram drevitej celulózy Heweten 10 Hz. Pomocou známého postupu mikrofiltrácie a ultrafiltrácie sa enzymatický komplex oddělí od ostatného živného média a lyofilizuje sa. Lyofilizovaný surový enzým má následovně zloženie, ipoťažne aktivity:

obsah bielkovín 44,5 % aktivita na filtračný papier (FPA) (m. j./mg bielkoviny) 1,52 celobiáza (m. j./mg bielkoviny)0,034 alfa-amyláza (m. j./mg bielkoviny, 30 °C)0,54 xylanáza (m. j./mg bielkoviny)5,8 proteáza nedokazatelná

Tuhé látky, oddělené od fermentačného média, ktoré sa skladajú prevažne z buňkových stien použitej pliesne, sa podrobia sušeniu rozprašováním alebo lyofilizácii a napokon sa piilverizujú. Tioto- buňkové steny sú vhodné napr. ako substrát na výrobu enzýmov na odbúranie buňkových stien.

Stanovenie celulázovej aktivity, ako aj obsahu bielkovín sa robí pódia metod, odporúcaných ШРАС (T. K. Ghose: ,.Finál Recommendations on Hie Measurement of Cellulase Activities“, připravené pře IUPAC, Komisia pro biotochnoíógiu; júl 1983). Stanovenie amylázovej aktivity sa roku pri 30 stupňoch Celzia, všetky ostatně enzymatické aktivity sa stanovuji! při 50 °C; 1 medzinárodná jednotka zodpovedá uvoineniu 1 mikromólu glukózy za 1 minutu z použitého substrátu.

P г í к 1 .a d 2

Vo fermentori, ako je popísaný v příklade 1 sa kultivuje pleseň T. reesei ZIMET 43 803 za účelom získáváni a celulázových enzýmov. Ako substrát sa používá dřevitá celulóza Heweten 10 Hz. Fermentácia sa vykonává technikou fed-batch, pri ktorej sa dodatočné privádzanie substrátu riadi metabolickou aktivitou mycélia pliesne.

Zloženie základného živného média je následovně:

celulóza Heweten 10 Hz 300,0g síran amónny 72,0g dihydrogénfosforečnan draselný 00,0g iheptahydrát síranu horečnatého 7,5g chlorid -vápenatý 7,5g peiptón 45,0g

Tween 80, polyoxyetylónsorbitan monooleát 15,0g roztok stopových solí 150 cm³ [ako v příklade 1).

Tieto zložky sa rozpustia vo vodě, potažné sa suspendujú, upravia sa na objem 10,5 dm³ a zavedli sa do fermentora. Ako inokulum slúži 1 drn³ suspenzie mycélia, ako je popísané v příklade 1. Médium na doplnovanie substrátu sa připraví následovně: 1 350 g celulózy Heweten 10 Hz a 45 g karboxymetylcelulózy sa za sucha rovnoměrně premieša a za miešania sa suspenduje vo vodě, vodou sa doplní na celkový objem 4,5 dm³ a sterilizuje sa.

Fermentácia:

Nastavenie teplotného profilu a otáčok miešadla, ako aj regulácia pH a odpeňovanie sa robí ako v příklade 1. Vzdušnenie sa nastaví na 420 normálnych dm³ vzduchu za hodinu. S privádzaním suspenzie celulózy sa začne, akonáhle koncentrácia oxidu uhličitého vo fermentačnom odpadovom plyne překročí maximum a poklesne asi na 80 % maximálnej hodnoty, za rovnakého nastavěli ia procesných parametrov. Maximum koncentrácie oxidu uhličitého je asi 0,7 až 0,9 objemových vo vysušenom odpadovom plyne z fermentácie; občasné slabo výrazné maximum koncentrácie oxidu uhličitého v odpadovém plyne z fermentora netřeba z hladí ska riadenia procesu brať do úvahy.

Táto koncentrácia oxidu uhličitého vo výške 80 % maximálnej hodnoty sa na začiatku doplňovania substrátu nastaví ako regulačná medza; pri poklese pod regulačnú medzu s-a zapne podávacie čerpadlo, ktoré přiváti za celulózovú suspenziu do fermentačného média tak dlho, kým koncentrácia oxidu uhličitého nepřekročí regulačnú medzu. Podávači výkon čerpadla sa nastaví na množstvo 0,5 % hmotnosti fermentačného média za hodinu, pri začiatku pridávania substrátu teda na 53 g/h celulózovej suspenzie. Koncentrácia bielkovín mycélia vo fermentačnom médiu sa stanoví na začiatku pridávania substrátu; regulačná medza oxidu uhličitého sa iprispósobí meniacej sa koncentrácii bielkovín mycélia, teda s rastúcou koncentráciou bielkovín mycélia sa proporcionálně zvyšuje.

Spolu sa přidá 4,5 dm³ 30 % celulózovej suspenzie do fermentačného média. Fermentácia sa ukončí po 320 až 360 h., keď koncontrácia oxidu uhličitého v odpadovom plyne poklesne na 0,2 % alebo nižšie a hodnota pH stúpne.

Celulázová aktivita v kultivačnom filtráte na konci fermentácie je 32 m. j. FPA/cm³, čo zodpovedá výtažku 290 m. j. FPA na gram celulózy Heweten 10 Hz.

Příklad 3

Na výrobu enzýmov na odbúranie bukových stien sa v třep ač kovej kultúre fermentuje plieseň T. reesei ZIMET 43 803. Ako substrát sa používajú buňkové steny pliesne, ktoré sa získá napr. ako je popísané v příklade 1. Živné médium má následovně zloženie:

sušené pliesňové buněčné steny 25,0 g/dm³ dihydrogénfosforečnan draselný 15,0 g/dm³ síran amónny 4,8 g/dm³ heptahydrát síranu horečnatého 0,4 g/dm³ chlorid vápenatý 0,3 g/dm³

281811 močovina 0,6g/dm peptón 1,5g/dm

Tween 80, polyoxyetylénsorbitean monooleát 1,0g/dm roztok stopových solí (ako v příklade 1) 10,0cm³/dm³

Třepáčkové banky, napr. okrúhle banky s brutto objemem 500 cm³, sa naplnia po 100 cm³ živného média a zaočkujú sa konídiami v koncentrácii 5 X 10⁸/dm³ živného média. Kultivačná teplota je 30 °C, čas kultivácie 8 dní. Získaný kultivačný filtrát sa ultrafiltráciou alebo dialýzou zahustí v poměre 10 : 1. Kultivačný koncentrát, ktorý sa móže spracovať na sušený enzymatický produkt, je vhodný napr. na výrobu živých plesňových protoplastov.

Příklad 4

Vo fermentori s miešadlom, ako je popísaný v příklade 1, sa kultivuje pleseň T. reesei ZIMET 43 804 za účelom získavania celulázových enzýmov. Živné médium obsahuje pšeničné otruby a celulózu ako indukujúce substráty v kombinácii s glukózou ako neíndukujúcim substrátom. Fermentácia sa výkonáva technikou fed-batch, pri ktorej je dodatočné pridávanie substrátu z regulačnětechnického híadiska riešené ako je to popísané v příklade 2.

Zloženie základného živného média je následovně:

pšeničné otruby	140,0	g
celulóza Heweten 10 Hz	140,0	g
glukóza	210,0	g
síran amonný	67,0	g
dihydrogénfosforečnan draselný	45,0	g
heptahydrát síranu horečnatého	5,6	g
chlorid vápenatý	5,6	g
peptón	21,0	g
Tween 80 polyoxyetylén sorbitan
monooleát	14,0	g
roztok stopových solí
(ako v příklade 1)	140 cm3

Tieto zložky sa pridajú do fermentora v 12,6 dm³ vody. Ako inokulum sa použijú 2 dm³ suspenzie mycélia, ktoré sa v předstupni (třepáčkově kultúra alebo fermentor) kultivuje na živnej pode rovnakého zloženia, ako je základné živné médium, 24 až 36 hodin; predkultúra sa inokuluje konídiami. Ako médium na doplňovanie substrátu sa používá 50 %-ný roztok glukózy.

Fermentácia:

Vzdušneinie sa nastaví na 490 normálnych dm³ za hodinu. Ostatně procesně parametre sú rovnaké, ako je udané v příkladech 1, potažné 2. S prívodom glukózového roztoku sa začne, akonáhle koncentrácia oxidu uhličitého po překročení maxima poklesne na asi 70 °/o maximálnej hodnoty. Podávači vý kon čerpadla sa nastaví na 75 cm³/h. Čerpadlo, ako je popísané v příklade 2, sa zapíná pri poklese koncentrácie CO2 na hodnotu pod regulačnou medzou, a po překročení regulačnej medze sa znovu vypíná. Regulačně medza koncentrácie oxidu uhličitého, ako je ipopísané v příklade 2, sa prisposobí meniacej sa koncentrácii mycéliových bielkovín.

Koncentrácia oxidu uhličitého vo fermentačných odpadových plynoch má počas doplňovania substrátu oscilačný priebeh. Spolu sa přidá 1,4 dm³ 50 % roztoku glukózy do fermentačného média. Fermentácia sa ukončí po: 120 až 140 hodinách, keď ko<ncentrácia oxidu huličitého poklesne na 0Д percenta alebo nižšie a stupně hodnota pH. Celulázová aktivita v kultivačnom filtráte je na konci fermentácie 12,5 m. j. FPA/cm³.

Příklad 5

Kultivuje sa pleseň T. reesei ZIMET 43 804 za účelom získania celulázových enzýmov 11a báze laktózy. Vedenie procesu sa uskutečňuje technikou fed-batch, ako je popísané v príkladoch 2 a 4. Zloženie základného živného média je následovně:

laktóza	140,0 g
síran amónny	67,0 g
dihydrogénfosforečnan draselný	45.0 g
chlorid vápenatý	5,6 g
heptahydrát síranu horečnatého	5,6 g
peptón	21,0 g
Tween 80, polyoxyetylén sorbitan
monooleát	14,0 g
roztok stopových solí
(ako v příklade 1)	140 cm3

Tieto zložky sa dajú do fermentora v 12,8 'decimetra³ vody. Ako inokulačný materiál slúži 1 dm³ suspenzie mycélia, ktoré sa kultivuje 35 až 40 hodin na živnom médiu rovnakého zloženia v třepáčkových bankách; třepáčkově kultúra sa Inokuluje konídiami. Na doplňovanie substrátu sa použije 20 %-ný roztok laktózy.

Fermentácia:

Vzdušnenie sa nastaví na 420 normálnych dm³ vzduchu za hodinu; ostatně procesně parametre sú nastavené ako v příklade 1, potažné 2. S privádzaním roztoku laktózy sa začne, akonáhle koncentrácia oxidu uhličitého poklesne asi na 80 % maximálnej hodnoty. Podávači výkon čerpadla sa nastaví na 100 cm³/h. Fermentácia sa ukončí asi po 100 až 110 hodinách, kedy sa do fermentačného média přidalo spolu 2,8 dm³ 20 percentého roztoku laktózy. Celulázová aktivita v kultivačnom filtráte je 10,5 m. j. FPA na cm³. Pomocou membránových separačných procesov z fermentačného média oddělený a napokon lyofilizovaný surový en13 zým má následovně zloženie, poťažne aktivity:

obsah bielkovín 45,7 o/_o aktivita na filtračný papier’ (FPA) (m. j./mg bielkoviny)i celobiózy (m. j./mg bielkoviny)0,035 alfa-amyláza (m. j./mg bielkoviny,0,50 °C)5,6 xylanáza proteáza zateTná proteáza tel'ná

Příklad 6

Schopnost plesňových kmeňov T. reesei ZIMET 43 803 a T. reesei ZIMET 43 804 produkovat celulázy sa skúma kultiváciou na róznych substrátoch a porovnává sa s východzím mutantom T. reesei CCI. Živné médium má následovně zloženie:

281811

16
dihydrogénfosforečnan
draselný	15,0 g/dm1 2 3
síran amonný	1,4 g/dm3
chlorid vápenatý	0,3 g/dm3
heptahydrát síranu
horečnatého	0,3 g/dm3
močovina	0,3 g/dm3
peptón	1,5 g/dm3
Tween 80, polyoxyetylén
sorbitan monooleát	1,0 g/dm3
roztok stopových solí
(ako v příklade 1)	10,0 cm3/dm3
substrát	10,0 g/dm3

Třepáčkové banky sa naplnia po 100 cm³ testovaného živného média a zaočkuje sa 10⁷ konídiami jednej a tej istej suspenzie příslušného kmeňa. Cas kultivácie je 7 dní, kultivačně teplota 30 C°. Získajú sa naslerovné celulázové aktivity:

Substrát	ZIMET 43 803	ZIMET 43 804	CCI
0,5 % pšeničných otrúb Ц- 0,5 % drevitej celulózy	3,0	2,9	1,5
0,5 % glukózy -ΊΟ,5 % drevitej celulózy	2,0	2,1	1,0
0,5 % laktózy + 0,5 % drevitej celulózy	1,4	1,8	1,2
5,5 % glukózy + liehovarské výpalky	1,0	1,3	0,6

(50 o/o-né)

Celulázová aktivita je udávaná v m. j. FPA/cm³.

Možné oblasti použita sa týkajú například priemyslu spracovania ovocia a zeleniny, liehovarského a pivovarského priemyslu, extrakcie rastlinných látok, obsahujúcich buničinu, ako aj zlepšovania strávitelnosti objemových krmív a silážovania krmív v poTnohospodárstve. Získané enzýmové komplexy sa móžu používat aj ako biochemikálie, například na výrobu protoplastov a na analytické hodnotenie krmív.

Claims (4)

1. Spósob přípravy celulázových enzýmov a/alebo enzýmnv na odbúranie bunkovej steny pomocou plesní v submerznom procese, vyznačujúci sa tým, že plesnové mutanty Trichoderma reesei, ZIMET 43 803 a/alebo Trichoderma reesei ZIMET 43 804 sa kultivujú při teplote 22 až 36 °C, při pH 2 až 7, za podmienok známých pře kultiváciu kmeňov rodu Trichoderma, v živnom médiu, ktoré obsahuje jeden alebo viac substrátov indukujúcich tvorbu celulázových enzýmov a/alebo enzýmov na odbúranie bunkovej steny, buď jednotlivo, alebo v kombinácii s jedným alebo viacerými, neindukujúcimi substrátmi.

2. Spósob přípravy podía bodu 1, vyznačujúci sa tým, že indukujúce substráty sa používajú buď rozpustné, ako je laktóza, alebo srvátka, alebo nerozpustné, ako je celulóza, celulózové odpady alebo buněčné steny plesní.

3. Spósob přípravy podl'a bodov- 1 a 2 vy- značujúci sa tým, že sa použijú rozpustné indukujúce substráty a/alebo rozpustné neindukujúce substráty, ktoré sa pridávajú do média technikou fed-batch tak, že přidávané substráty indukujú vo ferrnentačnom médiu tvorby enzýmov alebo ju aspoň nepotláčajú. _A *

4. Spósob přípravy podlá TOdov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa používajú ako indukujúci substrát otruby alebo' liehovarské výpalky v kombinácii s rozpustnými sacharidmi, ako je glukóza, xylóza, laktóza alebo so srvátkou.