CS262264B1

CS262264B1 - A method of culturing hybridomas and myeloma cells

Info

Publication number: CS262264B1
Application number: CS867159A
Authority: CS
Inventors: Jan Rndr Csc Kovar; Frantisek Rndr Drsc Cle Franek
Original assignee: Kovar Jan; Franek Frantisek
Priority date: 1986-10-03
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1989-03-14
Also published as: CS715986A1

Abstract

Způsob kultivace hybridomů a myelomových buněk na syntetickém kultivačním médiu, které obsahuje základní složky jako jsou anorganické soli, monosacharidy, aminokyseliny, vitaminy, látky tlumící změny pH a indikátor změny pH, a suplement spočívá v tom, že se kultivace provádí na základním médiu v přítomnosti 2x10"^ až lxlO-2 mol/1 suplementu, tvořeného nejméně jednou vodorozpustnou sloučeninou železa. Kultivaci je výhodné provádět ještě v přítomnosti sloučenin stopových biogenních prvků, kyseliny askorbové, steroidních látek nebo aminu při teplotě 4 až 40 °C, pH kultivačního média 6,0 až 8,0 v atmosféře nad kulturou obsahující 1 až 10 i obj. oxidu uhličitého.The method of culturing hybridomas and myeloma cells on a synthetic culture medium containing basic components such as inorganic salts, monosaccharides, amino acids, vitamins, substances that buffer pH changes and a pH change indicator, and a supplement consists in that the cultivation is carried out on a basic medium in the presence of 2x10-^ to 1x10-2 mol/l of a supplement consisting of at least one water-soluble iron compound. It is preferable to carry out the cultivation also in the presence of compounds of trace biogenic elements, ascorbic acid, steroid substances or an amine at a temperature of 4 to 40 °C, a pH of the culture medium of 6.0 to 8.0 in an atmosphere above the culture containing 1 to 10 vol. of carbon dioxide.

Description

Vynález se týká způsobu kultivace hybridomů a myelomových buněk in vitro.The invention relates to a method for culturing hybridomas and myeloma cells in vitro.

Hybridomy konstruované somatickou hybridisací myelomové buňky a lymfocytu syntetizujícího protilátkou jsou průmyslově používány k výrobě monoklonálních protilátek. Myelomové buňky, do nichž je metodami genového inženýrství zaveden gen pro biologicky aktivní bílkovinu, například enzym, inhibitor enzymu, hormon, imunoregulátor, jsou též průmyslově používány pro výrobu těchto bílkovin.Hybridomas constructed by somatic hybridization of a myeloma cell and an antibody synthesizing lymphocyte are industrially used to produce monoclonal antibodies. Myeloma cells into which a gene for a biologically active protein, such as an enzyme, an enzyme inhibitor, a hormone, an immunoregulator, is introduced by genetic engineering methods, are also industrially used to produce these proteins.

Dosud se hybridomy a myelomové buňky kultivují tak, že se buňky nejprve namnoží v laboratorních nádobách, jako jsou plastikové misky a lahve, kultivace a produkce bílkoviny se dokončí v průmyslovém fermentoru. Monoklonální protilátka nebo jiná do kultivačního média vyloučená bílkovina se získává z kultivačního média po odstředění nebo odfiltrováni buněk. Isolace produktované bílkoviny je tím obtížnější a nákladnější, čím více bílkovin původní kultivační médium obsahovalo. Koncentrace produkované bílkoviny, například monoklonální protilátky v kultivačním médiu, je poměrně nízká. Ekonomická výhodnost výroby je limitována cenou složek kultivačního média. Syntetické kultivační médium obsahuje základní kultivační složky a suplement.To date, hybridomas and myeloma cells have been cultured by first multiplying the cells in laboratory vessels such as plastic dishes and bottles, and culturing and producing protein in an industrial fermenter. The monoclonal antibody or other protein secreted into the culture medium is recovered from the culture medium after centrifugation or filtration of the cells. Isolation of the protein produced is the more difficult and costly the more protein the original culture medium contained. The concentration of protein produced, for example monoclonal antibody, in the culture medium is relatively low. The economic advantage of production is limited by the price of the components of the culture medium. Synthetic culture medium contains basic culture components and supplement.

Základní kultivační složky jsou anorganické soli, například chlorid sodný a fosforečnan sodný, monosacharidy, například glukosa nebo galaktosa, aminokyseliny, například tryptofan, methionin, threonin, glutamin, vitaminy, například thiamin a nikotinamid, látky tlumící změny pH, například N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina, popřípadě pyrohroznan sodný, antibiotika a indikátor změny pH. Tyto základní kultivační složky jsou pro hybridomy a myelomové buňky, stejně tak jako pro jiné živočišné buňky samy o sobě nedosta tečné, a proto jsou doplňovány 10 % objemovými krevního séra, například hovězího, koňského nebo fetálního telecího séra. Krevní sérum vnáší do kultivačního média neznámé látky, z nichž některé růst buněk podporují, jiné mohou růst potlačovat. Krevní séra je proto nutné před použitím testovat a vybírat vhodné šarže. Tím vzrůstají náklady na výrobu kultivačního média. Protože vhodných růst podporujících krevních sér byl nedostatek, byly vyvinuty receptury kultivačních médii, tzv. bezsérových, v nichž je sérum nahrazeno několika definovanými bílkovinami, nejčastěji transferinem, sérovým albuminem a insulinem a případně dalšími látkami/ jako jsou mastné kyseliny, aminy a nízkomolekulární hormony (Kovář J., Franěk F., Methods in Enzymology 121:277, 1986).The basic culture ingredients are inorganic salts such as sodium chloride and sodium phosphate, monosaccharides such as glucose or galactose, amino acids such as tryptophan, methionine, threonine, glutamine, vitamins such as thiamine and nicotinamide, pH buffering agents such as N-2-hydroxyethylpiperazine -N'-2-ethanesulfonic acid, optionally sodium pyruvate, antibiotics and a pH change indicator. These basic culture components are insufficient for hybridomas and myeloma cells as well as for other animal cells and are therefore supplemented with 10% by volume of blood serum, for example bovine, horse or fetal calf serum. Blood serum introduces unknown substances into the culture medium, some of which promote cell growth, others may inhibit growth. Blood sera should therefore be tested and selected before use. This increases the cost of producing the culture medium. Since there was a lack of suitable growth promoting blood sera, recipes of serum-free culture media have been developed in which the serum is replaced by several defined proteins, most commonly transferrin, serum albumin and insulin and possibly other substances / such as fatty acids, amines and low molecular weight hormones ( Kovar J., Franek F., Methods in Enzymology 121: 277, 1986).

Veškeré bílkoviny dosud přidávané do kultivačních médií pro kultivaci hybridomů nebo myelomových buněk musí být prosté toxických příměsí, v důsledku tohoto vysokého stupně čistoty je jejich cena poměrně vysoká.All the proteins added to the hybridoma or myeloma cell culture media so far must be free of toxic impurities, and due to this high degree of purity, their cost is relatively high.

Další nevýhodou stávajících kultivačních médií je obtížná isolace produktů životní činnosti hybridomů popřípadě myelomových buněk z kultivačního média, která spočívá v několika násobném oddělování žádaných produktů bílkovinné povahy od bílkovin obsažených v kultivačním médiu v mnohonásobném přebytku.A further disadvantage of existing culture media is the difficulty of isolating the viable products of hybridomas or myeloma cells from the culture medium, which consists in several times separating the desired proteinaceous products from the proteins contained in the culture medium in a multiple excess.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob kultivace hybridomů nebo myelomových buněk na syntetickém kultivačním médiu obsahujícím základní složky, které jsou tvořeny anorganickými solemi, monosacharidy, aminokyselinami, vitaminy, látkami tlumící pH, indikátorem změny pH a suplementem podle vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom, že se kultivace provádí na -5 -2 základních složkách v přítomnosti 2x10 az 1x10 mol/1 vodorozpustných sloučenin železa.These disadvantages are overcome by a method of culturing hybridomas or myeloma cells on a synthetic culture medium comprising essential components consisting of inorganic salts, monosaccharides, amino acids, vitamins, pH buffering agents, a pH change indicator and a supplement of the invention. Its essence lies in the fact that the cultivation is carried out on -5 -2 basic components in the presence of 2x10 and 1x10 mol / l of water-soluble iron compounds.

Kultivaci je vhodné provádět dále v přítomnosti 0,002 až 2 mg/1 sloučenin biogenních stopových prvků, například selenu a zinku, nebo 1 až 100 mg/1 kyseliny askorbové, popřípadě 0,000 1 až 0,01 mg/1 steroidních látek, jako je třeba hydrokortison.The cultivation is further preferably carried out in the presence of 0.002 to 2 mg / l of biogenic trace element compounds, for example selenium and zinc, or 1 to 100 mg / l of ascorbic acid or 0.000 to 0.01 mg / l of a steroid such as hydrocortisone .

Kultivaci je výhodné provádět též za přítomnosti 0,1 až 15 mg/1 aminů, například ethano1aminu.The cultivation is also preferably carried out in the presence of 0.1 to 15 mg / l of amines, for example ethanolamine.

Kultivace hybridomu, popřípadě myelomových buněk se provádí při teplotě 4 až 40 °C a pH kultivačního média 6,0 až 8,0 a v atmosféře nad kulturou obsahující 1 až 10 % obj. oxidu uhličitého.The cultivation of the hybridoma or myeloma cells is carried out at a temperature of 4 to 40 ° C and a pH of the culture medium of 6.0 to 8.0 and in a culture atmosphere containing 1 to 10% by volume of carbon dioxide.

Bylo zjištěno, že jedinou zcela nepostradatelnou bílkovinnou složkou bezsérového kultivačního média je transferin (Kovář J., Franěk F., Methods in Enzymoiogy 121:277, 1986). Jelikož transferin funguje jako přenašeč železa z prostředí do buňky, byly v dalších pokusech přidávány do kultivačního média různé vodorozpustné sloučeniny železa ve vyšších koncentracích než jaké kdy byly v kultivačních médiích dosud použity.The only completely indispensable protein component of the serum-free culture medium has been found to be transferrin (Kovar J., Franek F., Methods in Enzymoiogy 121: 277, 1986). Since transferrin functions as an environment-to-cell iron transporter, various water-soluble iron compounds were added to the culture medium at higher concentrations than ever used in the culture media in further experiments.

Řada autorů (například Phillips P. D., Cristofalo V. J., Exp. Cell Res., 134:297, 1981; Perez-Infante V., Mather J. P., Exp. Cell Res., 142 : 325, 1982; Taetle R., Thyner K., Castagnola J., To D., Mandelsohn J., J. Clin. Invest., 57:1 061, 1985) použila jako náhradu transferinu vodorozpustné sloučeniny železa v koncentracích 1x10 ⁶ až 20x10 ⁶ mol/1.A number of authors (e.g. Phillips PD, Cristofalo VJ, Exp. Cell Res., 134: 297, 1981; Perez-Infante V, Mather JP, Exp. Cell Res., 142: 325, 1982; Taetle R., Thyner K. (Castagnola J., To D., Mandelsohn J., J. Clin. Invest., 57: 1 061, 1985) used water-soluble iron compounds at concentrations of 1x10 ⁶ to 20x10 ⁶ mol / L to replace transferrin.

Tyto koncentrace jsou však v případě hybridomů a myelomových buněk nedostatečné.However, these concentrations are insufficient for hybridomas and myeloma cells.

Ukázalo se, že sloučeniny železa nejsou pro hybridomy a myelomové buňky toxické až -2 do koncentrace 1x10 mol/1 a naopak umožňují růst hybridomu a myelomových buněk v kultivačním médiu, v němž není přítomna žádna bílkovina. Mezi sloučeniny železa, schopné nahradit transferin, patří například síran železnatý, chlorid železitý, citronan železitý a ferikyanid “5 — 2 draselný. Účinné koncentrace se pohybují v rozmezí 2x10 až 10 mol/1.It has been shown that iron compounds are not toxic to hybrids and myeloma cells up to -2 to a concentration of 1x10 mol / l and, in turn, allow hybridoma and myeloma cells to grow in culture medium in which no protein is present. Iron compounds capable of replacing transferrin include, for example, ferrous sulfate, ferric chloride, ferric citrate, and potassium 5 - 2 ferricyanide. Effective concentrations are in the range of 2x10 to 10 mol / l.

Hlavními výhodami způsobu kultivace podle vynálezu je podstatné snížení ceny kultivačního média, které se promítá i do ceny buňkami vylučované bílkoviny a snadná isolace bílkoviny produkované hybridomovými popřípadě myelomovými buňkami, protože buňkami vylučovaná bílkovina je jedinou bílkovinou nacházející se po kultivaci v kultivačním médiu.The main advantages of the cultivation method according to the invention are a substantial reduction in the cost of the culture medium, which is also reflected in the cost of cell secreted protein and easy isolation of the protein produced by hybridoma or myeloma cells, since cell secreted protein is the only protein found in culture medium.

Způsob kultivace hybridomů a myelomových buněk podle vynálezu je dokumentován v následujících příkladech.The method for culturing hybridomas and myeloma cells of the invention is documented in the following examples.

Příklad 1Example 1

Buňky hybridomu PLV-01 byly inokulovány v množství 50x10^ buněk/ml do 6 ml bezbílkovinného kultivačního média, které jako základní složky obsahovalo médium RPMI 1 640, L-glutamin (300 ^g/ml) , pyrohroznan sodný (110 ^ug/ml) , N-2-hydroethylpiperazin-N'‘-2-ethansulfonovou kyselinu (1,5x1ο*² mol/1), penicilín (100 jednotek/ml), streptomycin (100^ig/ml) a gentamycin (40 {Ug/ml). Bezbílkovinné kultivační médium pak obsahovalo jako suplement tyto přidané látky: ethanolamin (2x10 mol'l), kyselinu askorbovou (2x10 mol/1), hydrokortison (5x10 $ mol/1), síran kademnatý (CdSO^.8/3 H₉0, 5x10 ⁸ mol/1), chlorid kobaltnatý (CoCl₉.6 H„0, lxlO”⁸ mol/1), síran mědnatý, (CuSO..5 H?O, lxl0~⁸ mol/1), molybdenan amonný ( (NH^) 6Μο_?0₂₄ · 4 ^0, 5x10 mol/1), chlorid manganatý (MnCl2«4 ^0, 5x10 mol/1), síran nikelnatý (NiSO..6 Η,.Ο, 2,5x10 ¹⁰ mol/1), seleničitan sodný (Na„SeO~, 4x10 ⁸ mol/1), ^^-7 -10 křemičitan sodný (^28103, 2x10 mol/1), chlorid cínatý (SnCl2»2 H2⁰' 2,5x10 mol/1), vanadičnan amonný (NH^VO^i 2,5x10 $ mol/1), síran zinečnatý (ZnSO^.7 I^O, 1x10 ⁶ mol/1), a citronan železitý (5x10 mol/1).PLV-01 hybridoma cells were inoculated at 50x10 6 cells / ml into 6 ml protein-free culture medium containing RPMI 1640, L-glutamine (300 µg / ml), sodium pyruvate (110 µg / ml) as essential components. ), N-2-hydroxyethylpiperazine-N '- 2-ethanesulfonic acid (1.5 x 1 * ² mol / l), penicillin (100 units / ml), streptomycin (100 µg / ml) and gentamycin (40 {Ug / ml) ml). The protein-free culture medium then contained as a supplement the following added substances: ethanolamine (2x10 mol / l), ascorbic acid (2x10 mol / l), hydrocortisone (5x10 $ mol / l), cadmium sulphate (CdSO 4 .8 / 3 H ₉ 0, 5x10 ^-8 mol / 1), cobalt chloride (CoCl ₉ .6 H "0, lxlO" ⁸ mol / 1) sulfate, copper (CuSO..5 H? O, lxl0 ~ ⁸ mol / 1), ammonium molybdate (( NH4) 6Μο _? 0 ₂₄ · 4 ^ 0, 5x10 mol / l), manganese chloride (MnCl2 · 4 ^ 0, 5x10 mol / l), nickel sulphate (NiSO..6 Η, .Ο, 2,5x10 ¹⁰ mol (1), sodium selenite (Na2SO4, 4x10 ⁸ mol / l), ^^ 7 -10 sodium silicate (^ 28103, 2x10 mol / l), stannous chloride (SnCl2 »2 H2 ⁰ '2,5x10 mol) (1), ammonium vanadate (NH 4 OH? 2.5 x 10 ⁶ mol / l), zinc sulfate (ZnSO 4 .7 I 4 O, 1x10 ⁶ mol / l), and ferric citrate (5 x 10 mol / l).

Po 4 dnech kultivace v termostatu ve vlhčené atmosféře 5 % obj. oxidu uhličitého ve vzduchu při teplotě 37 °C a pH = 7,6 se buňky namnožily na l,58xl0⁸ buněk/ml. Počet buněk se tedy během kultivace přibližně ztřicetinásobil.After 4 days of cultivation in a thermostat in a humidified atmosphere of 5% by volume of carbon dioxide in air at 37 ° C and pH = 7.6, the cells were expanded to 1.58x10 ⁸ cells / ml. Thus, the number of cells was approximately thirty-fold during cultivation.

Příklad 2Example 2

Stejným způsobem jako v příkladu 1 byly kultivovány buňky myelomu FO a hybridomu CMH-02 v 1-ml objemech kultivačního média v jamkách plastikové kultivační destičky. Po jednom dnu kultivace za výše uvedených podmínek byl stanoven počet buněk v jamce a po dalších 24 hodinách byl stanoven počet buněk znovu. Tak byla stanovena střední doba zdvojení v exponenciální růstové fázi, která je pro myelom FO 15,6 hod. a pro hybridom CMH-02 14,6 hod.In the same manner as in Example 1, myeloma FO and CMH-02 hybridoma cells were cultured in 1-ml volumes of culture medium in wells of a plastic culture plate. After one day of culture under the above conditions, the number of cells in the well was determined and after another 24 hours the number of cells was determined again. Thus, the mean doubling time in the exponential growth phase was determined to be 15.6 hours for myeloma FO and 14.6 hours for CMH-02 hybridoma.

Příklad 3Example 3

Buňky hybridomu PLV-01 byly inokulovány v množství 10xl0³ buněk do 0,1 ml základních složek uvedených v příkladu 1. Jako suplement bylo do kultivačního média přidáno 2x10 mol/1 ferikyanidu draselného.PLV-01 hybridoma cells were inoculated in an amount of 10x10 ³ cells into 0.1 ml of the basic ingredients listed in Example 1. 2x10 mol / L of potassium fericyanide was added to the culture medium.

Po třech dnech kultivace při teplotě 37 °C a 4,5 % obj. oxidu uhličitého, ve vlhčené atmosféře, při pří média 7,4 se buňky namnožily na 42xl0³.After three days of cultivation at 37 ° C and 4.5% v / v carbon dioxide, in a humidified atmosphere at 7.4, the cells were expanded to 42x10 ³ .

Příklad 4Example 4

Buňky hybridomu PLV-01 byly inokulovány v množství 10xl0³ buněk do 0,1 ml základních složek uvedených v příkladu 1. Jako suplement bylo do kultivačního média přidáno 1x10 mol/1. síranu železnatého.PLV-01 hybridoma cells were inoculated in an amount of 10x10 ³ cells into 0.1 ml of the parent ingredients listed in Example 1. As a supplement, 1x10 mol / L was added to the culture medium. ferrous sulfate.

Po třech dnech kultivace při teplotě 37 °C a 4,5 % obj. oxidu uhličitého ve vlhčené 3 atmosféře při pH média 7,4 se buňky namnožily na 33x10 .After three days of cultivation at 37 ° C and 4.5% v / v carbon dioxide in a humidified 3 atmosphere at pH 7.4, cells were expanded to 33x10.

Příklad 5Example 5

Buňky hybridomu PGG-05 byly inokulovány v počtu 60x10 buněk do objemu 1 ml bezbílkovinného kultivačního média jako v příkladu 1. Kultivace probíhala za stejných podmínek jako v příkladu 1.PGG-05 hybridoma cells were inoculated at 60x10 5 cells to a volume of 1 ml of protein-free culture medium as in Example 1. Culturing was performed under the same conditions as in Example 1.

Pro srovnání byl tentýž hybridom v témže množství inokulován do základních složek, k nimž byl přidán transferin v koncentraci 5 mg/1 a insulin v koncentraci 10 mg/1.For comparison, the same hybridoma was inoculated in equal amounts into the base ingredients, to which transferrin at 5 mg / L and insulin at 10 mg / L were added.

Po 4 dnech kultivace byl stanoven počet buněk v obou kultivačních médiích a koncentrace monoklonální protilátky, vyjádřená v relativních jednotkách absorbance s použitím enzymoimunologického testu založeného na stanovení peroxidasové aktivity.After 4 days of culture, the number of cells in both culture media and the concentration of monoclonal antibody, expressed in relative absorbance units, were determined using an enzyme-based immunoassay based on peroxidase activity.

Při kultivaci podle vynálezu v přítomnosti citronanu železitého v bezbílkovinném kultivačním médiu stoupl počet buněk na 675x10^ /ml a koncentrace monoklonální protilátky vyjádřená v relativních jednotkách absorbance měla hodnotu Α^θ = 1,32. Ve srovnávacím pokusu při kultivaci v bílkovinném médiu s transferinem a insulinem stoupl počet buněk na 731xl0^/ml a koncentrace monoklonální protilátky vyjádřená v relativních jednotkách absorbance měla hodnotu A_4go = 1,26.When cultured according to the invention in the presence of ferric citrate in a protein-free culture medium, the number of cells increased to 675x10 6 / ml and the concentration of monoclonal antibody expressed in relative absorbance units had a value of Α θ = 1.32. In a comparative experiment in cultivation in protein medium with transferrin and insulin, the number of cells increased to 731x10 4 / ml and the concentration of monoclonal antibody expressed in relative absorbance units had an A ₅₀ value of 1.26.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A method for culturing hybridomas and myeloma cells on a synthetic culture medium comprising a basic constituent of inorganic salts, monosaccharides, amino acids, vitamins, pH buffering agents and a pH change indicator, and a supplement, characterized in that the cultivation is carried out on the constituents in the presence of 2x10 to 1x10 mol / l of a supplement consisting of at least one water-soluble iron compound such as ferric chloride, ferric citrate, ferrous sulphate or potassium fericyanide at a temperature of 4 to 40 ° C and a pH of culture medium of 6.0 to 8.0 over a culture containing? 1 to 10% by volume of carbon dioxide.

2. The method according to claim 1, wherein the cultivation is carried out in the presence of 0.001 to 2 mg / l of compounds of trace biogenic elements, for example selenium and zinc.

3. The method according to claim 1, wherein the cultivation is carried out in the presence of 1 to 100 mg / l of ascorbic acid.

4. The method according to claim 1, wherein the cultivation is carried out in the presence of 0.000 1 to 0.01 mg / ΐ of steroid substances, for example hydrocortisone.

5. The method according to claims 1 to 4, characterized in that the cultivation is carried out in the presence of 0.1 to 15 mg / l amines, for example ethanolamine.