CS262313B1

CS262313B1 - Method of isolation of ergot alkaloids from fermentation fluid

Info

Publication number: CS262313B1
Application number: CS858582A
Authority: CS
Inventors: Karel Rndr Benes
Original assignee: Benes Karel
Priority date: 1985-11-27
Filing date: 1985-11-27
Publication date: 1989-03-14
Also published as: CS858285A1

Abstract

Námelové alkaloidy vyráběné fermentačnim způsobem se z fermentační tekutiny naadsorbují na vhodný nepolární adsorbent, například na aktivní uhlí, a po odfiltrování objemné kapaliny se extrahuje organickým rozpouštědlem nebo vodným roztokem kyseliny. Až stonásobným zakoncentrováním alkaloidů na adsorbentu se uspoří značné množství rozpouštědel a tím se podstatně sníží náklady na izolaci námelových alkaloidů z fermentační tekutiny.Ergot alkaloids produced by fermentation are adsorbed from the fermentation liquid onto a suitable non-polar adsorbent, for example activated carbon, and after filtering off the bulky liquid, it is extracted with an organic solvent or an aqueous acid solution. By concentrating the alkaloids on the adsorbent up to a hundredfold, a significant amount of solvents is saved and thus the costs of isolating ergot alkaloids from the fermentation liquid are significantly reduced.

Description

Vynález se týká izolace námelových alkaloidů z fermentační tekutiny při výrobě námelových alkaloidů fermentačním způsobem, a to zejména nénví 1-'-vých alkaloidů klavinového typu (elymoklavinu, agroklavinu, chanoklavinu aj.), námelových alkaloidů typu jednoduchých amidů kyseliny lysergové (erginu, ergometrinu, hydroxyetylamidu kyseliny lysergové a jejich optických izomerů), námelových alkaloidů typu ergotoxinu, ergotaminu a dalších.The invention relates to the isolation of ergot alkaloids from the fermentation fluid in the manufacture of ergot alkaloids by fermentation, in particular not less than 1-clavine-type alkaloids (elymoclavin, agroclavin, chanoclavin, etc.), ergot, ergometrine, hydroxyethylamide of lysergic acid and their optical isomers), ergot alkaloids of ergotoxin type, ergotamine and others.

Fermentační tekutina obsahuje kromě žádané složky - námelového alkaloidu, který bývá obsažen obvykle v koncentraci 0,1 až 5 mg/ml, nejčastěji však 1 až 2 mg/ml, řadu dalších anorganických i organických sloučenin, které jsou v mnohonásobném přebytku. Tyto látky,které jsou bud součástí prostředí nebo živinami pro organismy produkující alkaloid, eventuálně jsou vedlejšími produkty organismů, znesnadňují izolaci žádaného alkaloidu.The fermentation fluid contains, besides the desired component - ergot alkaloid, which is usually present in a concentration of 0.1 to 5 mg / ml, but most often 1 to 2 mg / ml, a number of other inorganic and organic compounds, which are in multiple excess. These substances, which are either part of the environment or nutrients for the alkaloid-producing organisms or possibly are by-products of the organism, make it difficult to isolate the desired alkaloid.

Je to způsobeno jednak vlivem těchto sloučenin na povrchovou aktivitu roztoku, takže vznikají pěny při manipulaci nebo emulze při vytřepávání do organické fáze a dále způsobují to, že ani po změně pH do extrémních hodnot se částice alkaloidů neonizují, jak je tomu obvykle ve vodných roztocých alkaloidů.This is due both to the effect of these compounds on the surface activity of the solution, which results in foams upon handling or emulsion when shaken into the organic phase, and further causes alkaloid particles not to become ionized even after changing pH to extreme values, as usually in aqueous solution alkaloids. .

Doposud se izolace prováděla extrakcí vytřepáním do organického rozpouštědla, a to nejčastěji do etheru, toluenu, benzenu, etylacetátu, butylacetátu, chloroformu, dichlormetanu, dichlorethanu nebo do jejich směsi s etanolem, metanolem nebo butanolem. Před vlastní extrakci je zařazena filtrace pro odstranění pevných částí fermentační tekutiny, dále je obvykle nutno odstranit takzvané glukany, a to nejčastěji srážením acetonem nebo etanolem a odfiltrováním, a organický podíl odpařit na rotační vakuové odparce. Posledním úkonem před vlastní extrakcí je alkalizace fermentační tekutiny na pH 8 až 10 obvykle hydrogenuhličitanem sodným nebo vodným roztokem amoniaku nebo hydroxidu sodného. Po extrakci do organické fáze následuje extrakce do vodného roztoku organické nebo anorganické kyseliny, nejčastěji kyseliny citrónové, kyseliny vinné, kyseliny chlorovodíkové, kyseliny trihydrogenfosforečné nebo kyseliny sírové o hmotnostním zlomku 0,5 až 1 %. Potom následuje buč srážení alkaloidů vodným roztokem amoniaku nebo hydrogenuhličitanu sodného a jejich odfiltrování, respektive odstředění nebo zahuštění na odparek na rotační vakuové odparce, eventuálně těmto operacím předchází rozdělení jednotlivých alkaloidů extrakčně nebo chromatograficky.So far, the isolation has been carried out by shaking extraction into an organic solvent, most often into ether, toluene, benzene, ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, dichloromethane, dichloroethane or a mixture thereof with ethanol, methanol or butanol. Prior to extraction, filtration is performed to remove solids from the fermentation fluid, so-called glucans are usually removed, most commonly by precipitation with acetone or ethanol and filtered, and the organic fraction is evaporated on a rotary vacuum evaporator. The last step before the extraction is to basify the fermentation fluid to a pH of 8 to 10, usually with sodium bicarbonate or aqueous ammonia or sodium hydroxide. Extraction into the organic phase is followed by extraction into an aqueous solution of an organic or inorganic acid, most often citric acid, tartaric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid or sulfuric acid having a fraction of 0.5 to 1% by weight. This is followed by either precipitation of the alkaloids with an aqueous solution of ammonia or sodium bicarbonate and filtering or centrifuging or concentrating them to a residue on a rotary evaporator, possibly preceded by separation of the individual alkaloids by extraction or chromatography.

Podle německého patentového spisu DD 138 223 (čs. autorské osvědčení č. 217 423) se izolace námelových alkaloidů z kultivačních suspenzí provádí adsorpcí rozpuštěné Části alkaloidů na oxid hlinitý a po oddělení filtrátu a usušení vlhkého mycelia nebo směsi vlhké mycelium - adsorbent ve fluidní vrstvě se extrahuje organickými rozpouštědly nemístitelnými s vodou. Tento způsob je však náročný vzhledem k sušení, navíc je použitelný pouze na kultivační suspenzi z povrchové fermentace a nedá se aplikovat u tekutin z fermentace hloubkové (submerzní).According to German Patent Application DD 138 223 (US Patent No. 217 423), the isolation of ergot alkaloids from the culture suspensions is carried out by adsorption of the dissolved part of the alkaloids onto alumina and after separating the filtrate and drying the moist mycelium or wet mycelium adsorbent mixture in extracts with water-immiscible organic solvents. However, this method is demanding with respect to drying, moreover, it is only applicable to a culture suspension from surface fermentation and cannot be applied to deep (submerged) fermentation fluids.

Britský patentový spis BP 1 181 836 (1967) uvádí přípravu ergolenových kyselin a následnou izolaci těchto látek zachycením na silně kyselém iontomŠniči a vyeluování roztokem amoniaku. Podle francouzského patentového spisu FP 1 463 426 (1966) se provádí izolace ergolenových kyselin s různými substituenty v poloze 8, 9, respektive 10 adsorpcí na aktivním úhlí a následnou desorpcí směsí vody a alkoholu. Tyto dva patenty popisují izolaci kyselin, které strukturou patří do skupiny námelových alkaloidů, avšak neřeší izolaci alkaloidů klavinového typu, ani amidů nebo námelových alkaloidů peptidických.British Patent Specification BP 1 181 836 (1967) discloses the preparation of ergolenic acids and the subsequent isolation of these by trapping them on a strongly acidic ion exchanger and eluting with an ammonia solution. According to French Patent 1,463,426 (1966), the isolation of ergolenic acids with various substituents at the 8, 9 and 10 positions respectively is carried out by adsorption at the active angle and subsequent desorption of water-alcohol mixtures. These two patents describe the isolation of acids which belong to the ergot alkaloid family by structure, but do not address the isolation of clavin-type alkaloids or peptic ergot alkaloids.

Náklady na izolaci námelových alkaloidů z fermentační tekutiny jsou nepřímo úměrné koncentraci alkaloidů v tekutině. Praktické koncentrace jsou vždy několikanásobně nižší, než by vyžadoval optimální postup pro extrakci z jedné kapalné fáze do druhé.The cost of isolating ergot alkaloids from the fermentation fluid is inversely proportional to the concentration of alkaloids in the fluid. Practical concentrations are always several times lower than would be required for an optimal process for extraction from one liquid phase to another.

Uvedené nevýhody, a to zejména vysoké materiálové náklady, řeší způsob izolace námelových alkaloidů z fermentační tekutiny podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že se námelové alkaloidy obsažené ve fermentační tekutině naadsorbují na porézní nepolární materiál, zejména aktivní uhlí, silikagel modifikovaný pro chromatografií na obrácených fázích kovalentně vázanými uhlíkatými skupinami C-18 nebo C-8 nebo směs aktivního uhlí s mletou křemelinou v hmotnostním poměru 1:1 v množství 5 až 8 g na 1 g alkaloidů.These disadvantages, in particular the high material costs, are solved by a process for the isolation of ergot alkaloids from a fermentation fluid according to the invention, characterized in that the ergot alkaloids contained in the fermentation fluid are adsorbed onto a porous nonpolar material, in particular activated carbon. C-18 or C-8, or a mixture of activated carbon and ground kieselguhr in a weight ratio of 1: 1 in an amount of 5 to 8 g per g of alkaloids.

Výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se dosáhne až stonásobného zakonoentrování alkaloidů. Po filtraci, promytí vodou a vysušení filtračního koláče se alkaloidy vyextrahují do organického rozpouštědla nebo přímo do vodného roztoku organické nebo anorganické kyseliny. Dále se roztok námelového alkaloidu zpracuje obvyklým způsobem.The advantage of the process according to the invention is that up to 100 times the concentration of alkaloids is achieved. After filtration, washing with water and drying the filter cake, the alkaloids are extracted into an organic solvent or directly into an aqueous solution of an organic or inorganic acid. Next, the ergot alkaloid solution is treated in the usual manner.

Před adsorpcí je nutno filtrací dostranit pevné součásti a zalkalizovat fermentační tekutinu na hodnotu pH 8 až 10, zejména při použití modifikovaného silikagelu jako adsorbentu.Prior to adsorption, solids must be removed by filtration and the fermentation fluid must be basified to a pH of 8 to 10, especially when using modified silica gel as an adsorbent.

Pro extrakci z tuhého filtračního koláče je nejvýhodnější použít bud čtyřnásobného vytřepáván do organické fáze nemísitelné s vodou, a to 2 kg rozpouštědla na 1 kg filtračního koláče nebo postupné vymývání na koloně, respektive přímo na filtračním zařízení.For extraction from a solid filter cake, it is most advantageous to use either quadruple shaking into a water-immiscible organic phase, namely 2 kg of solvent per 1 kg of filter cake or successive elution on the column or directly on the filter device.

Navrhované řešení podstatně snižuje spotřebu organického rozpouštědla, a to o 50 % až 90 i, přičemž úspory jsou závislé na množství použitého adsorbentu, filtrační křemeliny, kvalitě filtrace, odsátí kapaliny z filtračního koláče a v neposlední řadě na obsahu námelového alkaloidu ve fermentační tekutině. Další výhodou způsobu podle vynálezu je mnohem menší pracnost, protože už v prvním kroku se odstraní velký objem kapaliny, a tím se dosáhne značných úspor na režijních i mzdových nákladech. Celkové dosažené úspory závisí na výběru optimálního postupu a činí minimálně 30 % až 50 % původních nákladů.The proposed solution significantly reduces the consumption of organic solvent by 50% to 90%, the savings being dependent on the amount of adsorbent used, the filter diatomaceous earth, the filtration quality, the suction of the filter cake and, last but not least, the ergot alkaloid content in the fermentation fluid. A further advantage of the process according to the invention is that it is much less laborious, since in the first step a large volume of liquid is removed, and thus considerable savings in both overhead and labor costs are achieved. The total savings achieved depend on the selection of the optimal procedure and is at least 30% to 50% of the original cost.

Způsob izolace námelových alkaloidů z fermentační tekutiny podle vynálezu byl ověřen na fermentační tekutině obsahující námelové alkaloidy klavinového typu, především elymoklavin a agroklavin ze submerzní a povrchové fermentace. Následující příklady provedení způsob izolace podle vynálezu znázorňují, nikoliv omezují.The process for the isolation of ergot alkaloids from the fermentation fluid of the invention has been verified on a fermentation fluid containing ergot alkaloids of the clavin type, in particular elymoclavin and agroclavin from submerged and surface fermentation. The following examples illustrate, but do not limit, the method of insulation according to the invention.

Příklad 1 litr přefiltrované fermentační tekutiny z povrchové fermentace obsahující 1,0 mg/ml námelových alkaloidů klavinového typu byl smíchán s 5,0 g aktivního uhlí a byl 30 minut míchán na elektromagnetickém míchadle. Pak byl zfiltrován přes vrstvu křemeliny a filtrační koláč o hmotnosti 60 g byl extrahován čtyřikrát šedesáti mililitry etylalkoholu denaturovaného chloroformem. Extrakce byla prováděna na mechanické třepačce vždy po dobu jedné hodiny.Example 1 liter of filtered fermentation broth from surface fermentation containing 1.0 mg / ml ergot alkaloids of the clavin type was mixed with 5.0 g of activated carbon and stirred for 30 minutes on an electromagnetic stirrer. It was then filtered through a pad of diatomaceous earth and the 60 g filter cake was extracted four times with sixty milliliters of chloroform-denatured ethyl alcohol. The extraction was carried out on a mechanical shaker for one hour each.

Po extrakci byl roztok zfiltrován přes skládaný filtr, filtrát byl analyzován a filtrační koláč byl znovu extrahován. Byly zjištěny tyto obsahy alkaloidů v extraktech:After extraction, the solution was filtered through a pleated filter, the filtrate was analyzed and the filter cake was extracted again. The following alkaloid contents were found in the extracts:

1. extrakt 371 mg1st extract 371 mg

2. extrakt 190 mg2nd extract 190 mg

3. extrakt 109 mg3. Extract 109 mg

4. extrakt 64,8 mg4. extract 64.8 mg

Celkem bylo vyextrahováno 734,8 mg alkaloidů ve čtyřech extrakcích, což je 73,5 % původního množství. Z logaritmické analýzy je však možno vypočítat, že celkové vyextrahovatelné množství bylo pouze 806,1 mg, takže výtěžek extrakce je minimálně 91 i. Ztráty kolem 20 % látky připadají na manipulaci s filtračním koláčem.A total of 734.8 mg alkaloids were extracted in four extractions, which is 73.5% of the original amount. However, it can be calculated from the logarithmic analysis that the total extractable amount was only 806.1 mg, so that the extraction yield is at least 91%. Losses of about 20% of the substance are due to filter cake handling.

Příklad 2Example 2

Dva litry přefiltrované fermentační tekutiny zalkalizované vodným roztokem amoniaku na pH 9,5 a obsahující 1,05 mg/ml elymoklavinu a 0,15 mg/ml agroklavinu byly smíchány s 15 g aktivního uhlí a po třiceti minutách míchání na elektromagnetickém míchadle bylo přidáno 15 g křemeliny. Směs byla zfiltrována a filtrační koláč byl promyt 100 ml vody a dobře odsát. Filtrační koláč o hmotnosti 65 g byl extrahován čtyřikrát 130 g etylacetátu. Extrakce byly prováděny vždy po dobu jedné hodiny na mechanické třepačce. Kapalina se s filtračním koláčem nesmíohala a dala se snadno slít. Analýzou jednotlivých frakcí byly zjištěny tyto obsahy elymoklavinu:Two liters of filtered fermentation fluid basified with aqueous ammonia solution to pH 9.5 and containing 1.05 mg / ml elymoclavin and 0.15 mg / ml agroclavin were mixed with 15 g activated carbon and after 30 minutes stirring on an electromagnetic stirrer 15 g was added diatomaceous earth. The mixture was filtered and the filter cake was washed with 100 mL of water and aspirated well. The 65 g filter cake was extracted four times with 130 g of ethyl acetate. Extractions were performed for one hour on a mechanical shaker. The liquid did not cope with the filter cake and was easy to decant. Analysis of the individual fractions revealed the following elymoclavin contents:

1. extrakt 1 100 mg1. extract 1 100 mg

2. extrakt 550 mg2. extract 550 mg

262313 4262313 4

3. extrakt 250 mg3. extract 250 mg

4. extrakt 95 mg.4. extract 95 mg.

Celkem bylo vyextrahováno 1 995 mg elymoklavinu, tj. 95 i :a bylo spotřebováno pouze 25 % etylaoetátu oproti starému postupu. Vyextrahovaná fermentační tekutina obsahovala méně než 0,01 mg/ml alkaloidů, takže účinnost adsorpce je lepší než 99 %.A total of 1 995 mg of elymoclavin, i.e. 95%, was extracted and only 25% of ethyl acetate was consumed compared to the old procedure. The extracted fermentation liquid contained less than 0.01 mg / ml alkaloids, so that the adsorption efficiency is better than 99%.

Příklad 3Example 3

Zfiltrovaná fermentační tekutina s celkovou koncentrací alkaloidů 1,4 g/1 byla zalkalizována roztokem hydroxidu sodného o koncentraci 1 mol/1 na pH 9. Jako sorbent byl použit modifikovaný silikagel pro ehromatografií na obrácených fázích Separon SIX C 18 o zrnění 0,06 mm. Byly použity plastikové kolony o objemu 1 ml, naplněné tímto sorbentem v množství 0,55 g.5; 10, respektive 20 ml fermentační tekutiny bylo injekční stříkačkou protlačeno přes tyto kolony a pak byla analyzována kapalinovou ehromatografií. Zbytkové množství alkaloidů v tekutině bylo vždy menší než 2 % původního obsahu. Nasorbované alkaloidy byly promyty 5 ml vody a přebytek kapaliny byl vytlačen vzduchem. Desorpce alkaloidů byla provedena 2 ml metylalkoholu. Po promytí vodou byly kolony připraveny k opětovnému použití.The filtered fermentation liquid with a total alkaloid concentration of 1.4 g / l was basified with 1 mol / l sodium hydroxide solution to pH 9. Modified silica gel for reverse phase ehromatography Separon SIX C 18 with a grain size of 0.06 mm was used as sorbent. A 1 ml plastic column packed with this sorbent in an amount of 0.55 g.5 was used; 10 and 20 ml of the fermentation fluid, respectively, were passed through these columns through a syringe and then analyzed by liquid ehromatography. The residual amount of alkaloids in the liquid was always less than 2% of the original content. The adsorbed alkaloids were washed with 5 ml of water and the excess liquid was expelled with air. The alkaloid desorption was carried out with 2 ml of methanol. After washing with water, the columns were ready for reuse.

Claims

Process for the isolation of ergot alkaloids from a fermentation liquid, characterized in that ergot alkaloids from a fermentation liquid are adsorbed at a pH of 8 to 10 at normal temperature to a porous non-polar adsorbent, in particular activated carbon, silica gel modified for reverse phase ehromatography or activated carbon mixture. with ground kieselguhr in a 1: 1 weight ratio to each other, and after filtering, washing with water and thoroughly aspirating the liquid phase or drying, the filter cake is extracted with a solvent selected from benzene, butyl acetate, chloroform, dichloromethane, diethyl ether, ethyl acetate, toluene, alcohols, 0.5 to 1% strong organic or inorganic acid solutions, or mixtures of water-soluble solvents with an acid solution, then worked up in the usual manner.

Severography, n. P., MOST