CS263615B1

CS263615B1 - A method of processing blood plasma at its fraction

Info

Publication number: CS263615B1
Application number: CS863520A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Ing Csc Rybak; Jiri Ing Csc Coupek; Stanislav Rndr Ulrych; Cyril Rndr Csc Losticky; Oldrich Sedlmayer
Original assignee: Rybak Miroslav; Coupek Jiri; Ulrych Stanislav; Cyril Rndr Csc Losticky; Oldrich Sedlmayer
Priority date: 1986-05-15
Filing date: 1986-05-15
Publication date: 1989-04-14
Also published as: CS352086A1

Abstract

Řešení se týká způsobu zpracování lidské nebo zvířecí krevní plazmy nebo jejich frakcí na koncentráty antitrombinu III, proteinu C, koagulačních faktorů a dalších bílkovin, a to afinitní sorpcí na ekvilibrovaném polymernim nosiči s imobllizovaným heparinem a následující selektivní desorpci, přičemž sorpce z výchozí suroviny se provádí na makroporézním sférickém sorbentu na bázi kopolymerů hydroxyalkylakrylátů nebo hydroxyalkylmetakrylátů se 2 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku. Řešení všestranně zlepšuje a ekonomizuje společensky významnou výrobu derivátů krevní plazmy.The solution relates to a method of processing human or animal blood plasma or their fractions into concentrates of antithrombin III, protein C, coagulation factors and other proteins, namely by affinity sorption on an equilibrated polymer carrier with immobilized heparin and subsequent selective desorption, whereby sorption from the starting material is carried out on a macroporous spherical sorbent based on copolymers of hydroxyalkyl acrylates or hydroxyalkyl methacrylates with 2 to 4 carbon atoms in the alkyl residue. The solution comprehensively improves and economizes the socially significant production of blood plasma derivatives.

Description

Vynález se týká způsobu zpracování lidské nebo zvířecí krevní plasmy nebo jejich frakcí na koncentráty antitrombinu III, proteinu C, koagulačních faktorů a dalších bílkovin, afinitní sorpci na ekvilibrovaném polymerním nosiči s imobilizovaným heparinem a následující selektivní desorpcí. Tyto složky krevní plasmy v podobě více či méně čistých koncentrátů jsou důležité při laboratorní diagnostice hemokoagulačních poruch, slouží k přípravě preparátů pro klinickou aplikaci a slouží k přípravě antigenů za účelem produkce antisér, proto jejich separace a purifikace má značný význam.The invention relates to a process for processing human or animal blood plasma or fractions thereof into antithrombin III, protein C concentrates, coagulation factors and other proteins, affinity sorption on an equilibrated polymeric carrier with immobilized heparin and subsequent selective desorption. These blood plasma components in the form of more or less pure concentrates are important in the laboratory diagnosis of haemocoagulatory disorders, are used to prepare preparations for clinical application and are used to prepare antigens to produce antisera, therefore their separation and purification is of great importance.

Využití lidských krevních bílkovin: pro klinické účely je znesnadněno nebezpečím přenosu sérové hepatitidy, případně i choroby AIDS, pokud bílkovinu nelze zahřívat 10 h na teplotu 60 °C, dále pak komplikovaností a nízkou efektivnosti konvenčních preparačnlch metod. Řešení těchto problémů se nabízí v použití separačních postupů na bázi afinitní sorpce a desorpce. Tato cesta je jednoduchá, vysoce selektivní a hospodárná a umožňuje vycházet i z malých objemů a používat jén plasmy s negativním nálezem antigenů sérové hepatitidy, což redukuje nebezpečí přenosu viru na minimum. Vzhledem k poměrné stabilitě antitrombinu III v přítomnosti stabilizátorů je dána možnost, aby byl zahříván 10 h na teplotu 60 °C bez podstatné ztráty aktivity. Stupeň určité purifikace je však podmínkou. Separaci uvedených bílkovin lze zařadit před schéma běžné průmyslové frakcionace krevní plasmy, aniž by tím byl nějak porušen frakcionační postup a výtěžky albuminu auminoglobulinů.Utilization of human blood proteins: the risk of transmission of serum hepatitis, possibly AIDS, is complicated for clinical purposes if the protein cannot be heated to 60 ° C for 10 hours, as well as the complexity and low efficiency of conventional preparation methods. The solution of these problems is offered by using separation processes based on affinity sorption and desorption. This route is simple, highly selective and economical and allows to start from small volumes and use only plasma with negative findings of serum hepatitis antigens, minimizing the risk of virus transmission to a minimum. Due to the relative stability of antithrombin III in the presence of stabilizers, it is possible to heat to 60 ° C for 10 hours without significant loss of activity. However, the degree of purification is a condition. Separation of these proteins can be included before the conventional industrial plasma fractionation scheme without compromising the fractionation process and albumin aluminoglobulin yields.

Antitrombin III je inhibitor trombinu,koagulačních faktorů Xa, Xlla, Xla a dalších proteináz krevní plasmy a tělních tekutin. V krevním oběhu cirkuluje ve své neaktivní formě a je aktivován účinkem heparinu a látek heparinu podobných. Separovaný a koncentrovaný antitrombin III, at již ve své proformě nebo v podobě aktivního komplexu s heparinem, upravený do vhodné aplikační formy, může být léčebně a preventivně použit při substituci dědičného či získaného nedostatku antitrombinu III a při mnoha dalších indikacích. Antitrombin III je dále potřebný pro stanovení hladiny heparinu a proteinu C v krevní plasmě, při monitorování heparinu během mimotělního oběhu apod.Antithrombin III is an inhibitor of thrombin, coagulation factors Xa, XIa, XIa and other blood plasma and body fluid proteinases. It circulates in its inactive form in the bloodstream and is activated by the action of heparin and heparin-like substances. Separated and concentrated antithrombin III, whether in its pro-form or as an active complex with heparin, formulated in a suitable dosage form, can be used therapeutically and preventively to replace hereditary or acquired antithrombin III deficiency and many other indications. Furthermore, antithrombin III is required for the determination of heparin and protein C levels in blood plasma, for monitoring heparin during extracorporeal circulation and the like.

Protein C je jedna z plasmatických proteináz přítomná v plasmě v neaktivním stavu a aktivovaná trombinem za spoluúčasti endcteliálniho trombomodulinu. Jeho fyziologický význam spočívá v tom, že inaktivuje koagulační faktory V a VIII a aktivuje fibrinolýzu, čímž ovlivňuj proces krevní koagulace. Koncentráty proteinu C jsou potenciální antitrombotika s podobnou indikací jako antitrombin III (hyperkoagulačni stavy).Protein C is one of the plasma proteinases present in the plasma in an inactive state and activated by thrombin with the participation of endctelial thrombomodulin. Its physiological significance is that it inactivates coagulation factors V and VIII and activates fibrinolysis, thus affecting the blood coagulation process. Protein C concentrates are potential antithrombotics with a similar indication to antithrombin III (hypercoagulation states).

Je známa příprava antitrombinu III s použitím afinitní sorpce na polysacharidových nosičích. Tyto nosiče však mají řadu nedostatků, například náchylnost k bakteriální kontaminaci s následnou produkcí endotoxinů-pyrogenů, ke změně vlastností nosiče a zhoršení průchod nosti sloupce, dále špatnou odolnost proti fyzikálně-chemickým podmínkám, malou životnost apod.The preparation of antithrombin III using affinity sorption on polysaccharide carriers is known. However, these carriers have a number of drawbacks, such as susceptibility to bacterial contamination with subsequent production of endotoxin-pyrogens, alteration of carrier properties and deterioration of column throughput, poor resistance to physico-chemical conditions, poor durability, etc.

Bylo zjištěno, že sorbenty na bázi syntetických polymerů hydroxyalkylakrylátů a hydroxyalky lmetakry látů uvedené nedostatky odstraňují. Na.základě těchto nových poznatků byl vypracován způsob zpracování lidské nebo zvířecí krevní plasmy na koncentráty antitrombinu III, proteinu C, koagulačních faktorů a dalších bílkovin, afinitní sorpcí na ekvilibrovaném polymerním nosiči s imobilizovaným heparinem a následující selektivní - desorpcí, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se sorpce výchozí suroviny provádí na makroporézním sférickém sorbentu na bázi kopolymerů hydroxyalkylakrylátů a hydroxyalkylmetakrylátů se 2 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, obsahujícím imobilizovaný heparin.Sorbents based on synthetic polymers of hydroxyalkyl acrylates and hydroxyalkyl methacrylates have been found to overcome these drawbacks. Based on these new findings, a method of processing human or animal blood plasma into concentrates of antithrombin III, protein C, coagulation factors and other proteins has been developed, by affinity sorption on an equilibrated polymeric carrier with immobilized heparin and subsequent selective desorption according to the invention. wherein the sorption of the starting material is carried out on a macroporous spherical sorbent based on copolymers of hydroxyalkyl methacrylates and C2 -C4 hydroxyalkyl methacrylates in an alkyl moiety containing immobilized heparin.

Podle potřeby nebo podle možností lze sorpci výchozí suroviny na sorbent provádět bud na sloupci nebo vsádkově. Pro dosažení optimálního účinku je výhodné používat sorbent s velikostí částic od 50 do 300 ^im.If desired or possible, sorption of the starting material to the sorbent can be carried out either on a column or batchwise. For optimum performance, it is preferred to use a sorbent having a particle size of from 50 to 300 µm.

Výhodné fyzikálně-chemické vlastnosti sorbentů na bázi hydroxyalkylakrylátů a hydroxyalky lmetakry látů podstatně zlepšuji možnost komplexního zpracování lidské nebo zvířecí plasmy nebo plasmatických frakcí na žádané produkty. Odolnost sorbentu proti vysokým tlakům dovoluje pracovat rychle a standardně, s přesnou reprodukcí pracovních postupů a s možností automatizace celého procesu. Charakter nosiče umožňuje uskutečnit průtok tekutin tlakově, dodržovat časový limit operací a optimalizovat jednotlivé operace. Stálost a trvanlivost sorbentu použitého při způsobu podle vynálezu je nesrovnatelně vyšší než u kterýchkoliv dosud známých a pro tyto účely užívaných materiálů, což má i příznivé ekonomické důsledky. Životnost sorbentu při opakovaném používání (2 až 3 cykly týdně) je několik roků. Způsob podle vynálezu tedy podstatně zdokonaluje a ekonomizuje společensky důležitou výrobu významných derivátů krevní plasmy a zlepšuje tím i léčebnou a diagnostickou praxi.The advantageous physicochemical properties of the hydroxyalkyl acrylate and hydroxyalkyl sorbent sorbents substantially improve the possibility of complex processing of human or animal plasma or plasma fractions into the desired products. The high pressure resistance of the sorbent allows to work quickly and standardly, with the exact reproduction of work processes and with the possibility of automating the whole process. The character of the carrier enables the flow of fluids by pressure, keeping the time limit of operations and optimizing individual operations. The stability and durability of the sorbent used in the process according to the invention is incomparably higher than that of any of the materials known to date and used for this purpose, which also has favorable economic consequences. The life of the sorbent on repeated use (2 to 3 cycles per week) is several years. Thus, the method of the invention substantially improves and economizes the socially important production of significant blood plasma derivatives and thus improves therapeutic and diagnostic practice.

V následujících příkladech provedení je uvedeno několik možností zpracování krevní plasmy způsobem podle vynálezu. Tyto příklady však vynález pouze ilustrují, ale nijak neomezují na podmínky v nich uvedené.In the following examples, several possibilities of treating blood plasma by the method of the invention are set forth. However, these examples are merely illustrative of the invention but are not limited to the conditions set forth therein.

Příklad 1Example 1

Separace hrubé frakce plasmatických bílkovin s afinitou k heparinuSeparation of coarse fraction of plasma proteins with affinity for heparin

Sloupec (6x35 cm) se předem promyje pufrem, který obsahuje 0,005 mol/1 citrátu sodného a 0,1 mol/1 chloridu sodného; 8 až 10 1 lidské krevní plasmy (nebo tzv. K-plasmy) s hodnotou pH 6,0 až 6,4 se protlačuje peristaltickým čerpadlem rychlostí 50 až 60 ml/min. Sorbent s průměrnou velikostí zrna 100 až 200 ^m byl před naplněním do sloupce ponechán 24 h botnat ve vodě. Proteklá plasma, ochuzená o sorbovaný podíl, se zpracuje odděleně samostatnou frakcionací na imunoglobuliny a albumin. Na sloupci je za těchto podmínek zachyceno 80 až 90 % antitrombinu III. Sloupec sorbentu se potom promyje výchozím pufrem a sorbované bílkoviny se z vazby na sorbent eluují jako jediný podíl pomocí citrátového pufru (0,005 mol/1) pH 7,5, který obsahuje 2 mol/1 chloridu sodného. Získaná hrubá frakce obsahuje antitrombin III, protein C, plasminogen, koagulační faktory a další bílkoviny. Tato frakce se po dialýze . dále frakcionuje. Proces sorpce a eluce je kontrolován sledováním koncentrace bílkovin (^285¹·The column (6x35 cm) was prewashed with a buffer containing 0.005 mol / l sodium citrate and 0.1 mol / l sodium chloride; 8 to 10 L of human blood plasma (or so-called K-plasma) having a pH of 6.0 to 6.4 is forced through a peristaltic pump at a rate of 50 to 60 ml / min. The sorbent with an average grain size of 100 to 200 µm was swelled in water for 24 hours before loading into the column. The flowing plasma, depleted in the sorbed portion, is processed separately by separate fractionation into immunoglobulins and albumin. 80-90% of antithrombin III is captured on the column under these conditions. The sorbent column is then washed with the starting buffer and the sorbent proteins are eluted from the sorbent binding as a single portion using citrate buffer (0.005 mol / l) pH 7.5 containing 2 mol / l sodium chloride. The crude fraction obtained contains antithrombin III, protein C, plasminogen, coagulation factors and other proteins. This fraction was after dialysis. further fractionates. The sorption and elution process is controlled by monitoring protein concentration (^ 285 ¹ ·

Příklad 2Example 2

Příprava koncentrátu antitrombinu IIIPreparation of Antithrombin III Concentrate

Postupuje se jako v příkladu 1. Po sorpci a promytí sloupce se nejprve uvolní bílkoviny sorbované slabší vazbou, a to působením acetátového pufru (0,4 mol/1 ve vodě) s hodnotou pH 7,5. Z promývací tekutiny je získán protein C, plasminogen, koagulační faktory ev. další bílkoviny. Tato frakce se zpracuje odděleně. Po promytí sloupce nadbytkem acetátového pufru se ze sloupce eluuje zkoncentrovaný antitrombin III roztokem s vyšší iontovou silou, s výhodou citrátovým pufrem 0,005 mol/1 pH 7,5 s obsahem 2 mol/1 chloridu sodného. Eluát se odsolí a zahustí ultrafiltrací na obsah 0,1 až 0,3 i hmot. a po přidání natrium citrátu (0,6 mol/1) a úpravě pH na 7,5 se roztok zahřívá 10 h na 60 °C, aby se inaktivoval popřípadě přítomný virus sérové hepatitidy. Potom se roztok zbaví citrátu diafiltrací, zahustí na koncentraci cca 50 IU/ml, přidá se 1 % hmot. sorbitolu jako stabilizátoru a lyofilizuje se, čímž se získá preparát koncentrátu antitrombinu III určený pro klinickou aplikaci.The procedure is as in Example 1. After sorption and washing of the column, the proteins sorbed by weaker binding are first released by treatment with an acetate buffer (0.4 mol / l in water) having a pH of 7.5. Protein C, plasminogen, coagulation factors ev. other proteins. This fraction is treated separately. After washing the column with excess acetate buffer, concentrated antithrombin III is eluted from the column with a higher ionic strength solution, preferably 0.005 M citrate buffer pH 7.5 containing 2 M sodium chloride. The eluate is desalted and concentrated by ultrafiltration to a content of 0.1 to 0.3% by weight. and after adding sodium citrate (0.6 mol / l) and adjusting the pH to 7.5, the solution is heated at 60 ° C for 10 hours to inactivate any serum hepatitis virus present. Thereafter, the solution is dehydrated by diafiltration, concentrated to a concentration of about 50 IU / ml, and 1% w / w is added. sorbitol stabilizer and lyophilized to provide an antithrombin III concentrate formulation for clinical application.

Příklad 3Example 3

Příprava proteinu C a koncentrátu koagulačních faktorů vedle antitrombinu IIIPreparation of protein C and coagulation factor concentrate in addition to antithrombin III

Postupuje se jako v příkladu 1 a 2. Po sorpci a promytí sloupce výchozím pufrem se sorbované bílkoviny postupně eluují těmito pufry: ^{1 2} The procedure is as in Example 1 and 2. After the sorption and washing of the column with the starting buffer, the sorbed proteins are eluted sequentially with the following buffers: ^{1 2}

1. 0,22 mol/1 octanem sodným se odstraní balastní bílkoviny;1. Remove the ballast proteins with 0.22 mol / L sodium acetate;

2. 0,32 mol/1 octanem sodným se získá koncentrát proteinu C, který se potom zpracuje podle záměru použití;2. 0.32 mol / l sodium acetate provides a protein C concentrate which is then processed as intended;

3. 0,4 mol/1 octanem sodným se získá frakce bohatá na koagulační faktor X a plasminogen, která se zpracuje podle záměru použití; pH ve všech případech je 7,5.3. 0.4 mol / l sodium acetate gives a fraction rich in coagulation factor X and plasminogen, which is processed as intended; The pH in all cases is 7.5.

4. 2 mol/1 chloridem sodným v citrátovém pufru (0,005 mol/1, pH 7,5) se ze sloupce vytěsní antitrombin III.4. Antithrombin III is displaced from the column with 2 mol / l sodium chloride in citrate buffer (0.005 mol / l, pH 7.5).

Příklad 4 ' Příprava komplexu antitrombinu III s heparinemExample 4 Preparation of a complex of antithrombin III with heparin

Postupuje se jako v příkladu 1, 2 nebo 3, přičemž antitrombin III je eluován heparinem (0,005 moi/l citrátový pufr pH 7,5 obsahující 100 mg heparinu v litru). Podíl obsahující antitrombin III - heparinový komplex se pro klinickou aplikaci zpracuje podle příkladu 2. Přítomnost tohoto komplexu je prokazována na základě A₂₈g spektrofotometricky.The procedure is as in Example 1, 2 or 3, wherein the antithrombin III is eluted by heparin (0.005 moi / l citrate buffer pH 7.5 containing 100 mg heparin per liter). The fraction containing antithrombin III-heparin complex is processed for clinical application according to Example 2. The presence of this complex is detected on the basis of A ₂₈ g by spectrophotometry.

Příklad 5Example 5

Vsádkový způsob zpracování plasmyBatch method of plasma processing

Ve 21itrové skleněné nádobě se smíchá 1 000 ml lidské krevní plasmy s hodnotou pH 6,0 až 6,4 se 100 ml vlhkého sorbentu ekvilibrovaného stejně jako v příkladu 1 a míchá se 1 h.In a 21 liter glass vessel, 1000 mL of human blood plasma pH 6.0-6.4 was mixed with 100 mL of wet sorbent equilibrated as in Example 1 and stirred for 1 h.

Po usazení sorbentu se supernatant odtáhne nebo odstředí, načež se sorbent promývá a eluuje přidáváním elučních roztoků podle příkladů 1 až 4. Získané frakce se zpracují podle záměru použití. Používá se sorbent o zrnění 200 až 300 ^un.After settling the sorbent, the supernatant is withdrawn or centrifuged, after which the sorbent is washed and eluted by adding the elution solutions according to Examples 1-4. The fractions obtained are worked up according to the intended use. A sorbent having a grain size of 200 to 300 µm is used.

Příklad 6Example 6

Příprava antigenu antitrombinu III (vysoce purifikovaného antitrombinu III)Antithrombin III antigen preparation (highly purified antithrombin III)

Sorpce plasmatických bílkovin na sloupec s imobilizovaným heparinem je provedena podle příkladu 1. Odstranění volněji vázaných bílkovin je provedeno promývacím roztokem (0,8 mol/1 natrium acetát pH 7,5). Antitrombin III je ze sloupce eluován citrátovým pufrem 0,005 mol/1, pH 7,5 s přídavkem 2 mol/1 chloridu sodného. Získaný eluát je odsolen a koncentrován na 1/50 objemu výchozí plasmy. Další purifikace je provedena molekulární filtrací. Jako antigenu je použito podílů s maximální specifickou aktivitou antitrombinu III. Získá se produkt vhodný k produkci monospecifických polyklonálních i monoklonálních protilátek. Oba typy protilátek slouží v diagnostice.The sorption of plasma proteins onto the immobilized heparin column is carried out according to Example 1. The removal of the freely bound proteins is performed with a washing solution (0.8 mol / l sodium acetate pH 7.5). Antithrombin III is eluted from the column with 0.005 M citrate buffer, pH 7.5 with the addition of 2 M sodium chloride. The eluate obtained is desalted and concentrated to 1/50 of the starting plasma volume. Further purification is performed by molecular filtration. Aliquots with the maximum specific activity of antithrombin III are used as the antigen. A product suitable for the production of monospecific polyclonal and monoclonal antibodies is obtained. Both types of antibodies are used in diagnostics.

Regenerace sorbentuSorbent regeneration

Regenerace sorbentu se provádí citrátovým pufrem (0,005 mol/1) pH 7,5 s obsahem 2 mol/1 chloridu sodného. Tento pufr je pak vymyt vodou a sloupec je naplněn citrátovým pufrem (0,005 mol/1) pH 6,0 až 6,5, čímž je sloupec připraven k dalšímu použití. Pokud není sloupec delší dobu používán je uchováván v citrátovém pufru (0,005 mol/1) pH 6,0 až 6,5 obsahujícím bakteriostatikum. Před použitím sloupce je nutné tento pufr nahradit pufrem výchozím.The sorbent regeneration is carried out with citrate buffer (0.005 mol / l) pH 7.5 containing 2 mol / l sodium chloride. This buffer is then washed with water and the column is filled with citrate buffer (0.005 mol / l) pH 6.0 to 6.5, whereby the column is ready for further use. If the column is not used for a long time, it is stored in citrate buffer (0.005 mol / l) pH 6.0-6.5 containing bacteriostatic. This column must be replaced with the starting buffer before using the column.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

A method of processing human or animal blood plasma or fractions thereof into antithrombin concentrates. III, protein C, coagulation factors and other proteins, by affinity sorption of the starting material on an equilibrated polymeric carrier with immobilized heparin and subsequent selective desorption, characterized in that the sorption of the starting material is carried out on a macroporous spherical sorbent based on hydroxyalkylacrylate or hydroxyalkyl methacrylate copolymers 4 carbon atoms in the alkyl radical.

2. Process according to claim 1, characterized in that the sorption of the proteins of the starting material to the sorbent is carried out on a column or batch.

3. The process according to claim 1, wherein a sorbent having a particle size of from 50 to 300 [mu] m is used.