CS266282B1 - Spósob rádioimunochamického stanovenia antigénov s rožnou štruktúrou - Google Patents

Abstract

Spósob rádiod munochemiekého stanově­ řila je vhodný na zisťovanie velmi nízkých koncentracii antigénov s rožnou štruktúrou v krvnom sére, moči, mlieku, připadne v extraktech zo vzoriek tkaniv alebo krinív. Podstatou je unifikovaný postup rádioimunoehenii <·Ί:όΙιο stanovenia antigénov s rožnou štruktúrou, kde k roztoku špecifickej protilátky, jej antigénu značenému jódem 125 a neznámoj vzorko, resp. standardu sa přidává kozia protilátka proti králičiemu imuno- •j 1 úhu i inu ímobi L i z ováná na módifikovane j mikrokryštálickej celulóze vždy v rovnakom množstvo a na rovnakú dobu. Tento postup možno využit na citlivé rádioimunocheinickó stanoveni? fubovolného antigénu; separačný systém sa vyznačuje velmi dobrou stabilitou v roztoku, nízkou hodnotou nespecifickéj vazby ako aj nízkou sedimentačnou rýchlosťou » použitých cčistíc.

Description

Vynález sa týká spósobu rádioimunochemického stanovenia antigénov s rožnou štruktúrou.

Rádio.1 munoanalýza (RTA) ako vysoko citlivá analytická metoda si od svojho zavedenia Yalovowou a Ihu son(»m v toku I9‘,9 (N^Lui <* 184, 1 648 ( I 9 5 9 ) ) našla široké up 1 a t non i e pr i analýze velkého počtu zlúčenin.

Metoda RJA je založená na schopnosti protilátky a specifického antigenu tvořit’· reverzibilný komplex antiqén-prot i lá tka. Póle žitou súčastou celého rádioiinunochemickélio stanovenia je spósob sopaiúcie volného a viazanéhc· antigenu. K najčastojšie používaným metodám patří zrážanie polyctylénglykolom, síranom amonným a inými organickými zlúčeninami, adsorpcia volného antigenu na aktí.vnom uhlí, príp. využitie tzv. druhej protilátky (zvieracej protilátky proti králiciemu imunoglobulínu) v kombinácii s polyetylénglykolom. Nevýhodou poslednej z uvedených metod je zvyčajne poměrně zložitý postup optimalizácie separačného systému vždy iba pro jeden druh antigenu, nevyhnutnosť přídavku gamaglobulínu alebo normálneho králičieho séra do reakčnej zmesi a potřeba chladených centrifug. Precipitačná pritilátka nie je stabilně! v roztoku,preto ju výrobcovia RIA~súprav musia dodávat v lyofilizovanom stave a až samotný odběratel' si musí precipitačně činidlo připravovat zmiešavaním niekolikých substancií.

Vedla uvedených separačných metód sa v poslednej době úspěšně presadzuje aj metoda pevnej fázy, t. j. protilátek zmobilizovaných na vhodnom type nosičov. Najvhodnejším sposobom imobilizácie je kovalentná vazba protilátky na polymérny nosič (Santos, I., Waerenborgh, F., Patricio, L.: J. of Radional. Nucl. Chem. 102, 143 ¢1986)). V systémoch, kde je aplikovaný vhodný typ pevnej fázy, sa spravidla zjednodušuje a skracuje celková doba rádioimunochemického stanovenia.

Sposobom podlá vynálezu sa zvieracia (s výhodou kozla) protilátka proti králiciemu imunoglobulínu imobiiizujc na nosič, připravený drvením mikrokryštalickej celulózy v keramickej nádobě s následnou homogenizáciou jej vodnej suspenzie v skienenom honiogenízátore a výberom najjemnejšej frakcie flotáciou; aktivovaný reakciou s 1,1'-karbonyIdiimidazolom. Pri vlastnom rádioimunochemickom stanovení sa zvieracia protilátka proti králiciemu imunoglobulínu, zmobilizovaná uvedeným sposobom, přidává vždy v rovnakom objeme a koncentrácii k roztoku, obsahujúcemu specifické protilátku, jej antigén značený jódom 125 a analyzovaná vzorku, resp. standard. Vzhladom k štruktúre použitého nosiča a metóde imobilizácie sa sposobom podlá vynálezu dosíahne rovnováhy imunochemickej reakcie specifická protilátka-nešpecifická protilátka za 1 hodinu pri 20 °C bez ohladu na to, či sa stanovuje antigén s nízkou alebo vysokou molekulovou hmotnosťou. Reakčné zmes nie je potrebne pocas inkubácie miešať ani třepal, pretože sedimentačně rýchlost použitého nosiča je dostatečné nízká. Po ukončení jednohodinovej inkubácie sa nosič s zmobilizovanou zvieracou protilátkou proti králiciemu imunoglobulínu, na ktorej je naviazaný komplex specifická protilátka-antigén, odstředí zmeria sa radioaktivita sedimentu a porovnáním s hodnotami získanými u štandardov so známými koncentráciami antigenu sa stanoví obsah daného antigenu v neznámej vzorke.

Výhodou stanovenia antigénov s rožnou strukturou sposobom podle vynálezu je predovšetkým výrazná univerzálnost’ metody, možnost' skrátenia a z j edodusen i a celoho postupu rěidioimunochemického stanovenia, vysoký stupeň reprodukovatelnosti výsledkov, velmi dobrá vizuálnost sedimentu, čo zabraňuje jeho případnému odsatiu a tým získaniu nesprávných výsledkov. K dalším výhodám spósobu podlá vynálezu patří možností stanovenia antigénov s rožnou štruktúrou jednotným postupem za použitia společného precipitačnoho činidla, ktoré je priamo připravené k použitiu a vyznačuje sa velmi dobrou stabilitou aj v roztoku - pri 4 °C si nezmenene vazobné vlastnosti uchovává po dobu minimálně 4 mesiacov, čo má z technologického hladiska velký význam, lebo sa takto eliminuje fáza lyofilizácie. Pri vlastnom RIA-stanovení nie je potřebné do reakčnej zmesi přidávat qamaglobulín, normálně králičie sérum alebo polyetylénglykol, čo umožňuje zredukovat počet pipetovacích kvokov. Na oddelenie volnej a viazanej frakcie postačuje krátká centrifugácia v nechladenej centrifuge.

CS z'6 6 28 2 Β l

Slanoveni c antigónov s i óznou ňf.ruktúrou spósobom podlá vynálezu vdaka svojej univerzál nosí i v konečnou! důsledku výrazné šetří pracovno kapacity, znižuje technická a materiálová nárocnosť optimal izďcie l-.il; si par ičného systému, ako aj celého rádioimunochemického stáno' ‘ ii. i I · i< Η· · I i (n« 11 I ·. 111 y p í í I·. I , nim i |u·,· I < Ji< < , ,ι I <y

P r í. k 1 a d I

Pád io i munoana 1 yza ty i o l ropného hormonu (TSH)

Nosíc na imohiI izáciu zvieracej protilátky proti králičiemu imunoglobulínu sa připraví drvením mikrokiyštalickej celulózy za sucha v keramickéj nádobě. Celulóza sa potom suspenduje v dost 11 ovanuj vodě a homogenizuje v sklenenom homogenizátore. Frakcia s velkosťou častíc 5 až 15 ^un, získaná flotáciou, sa potom oddělí a vysuší za mierne zvýšenej teploty. K 5 hmotnostným dielom takto upravenoj mikrokryštalickej celulózy sa pridajá 4 hmotnostně diely 1,1'-karbonyldiímidazolu v 40 objemových dieloch acetonu. Aktivácia prebieha 2 h pri teplote 20 °C. Po premylí acetónom a 0,05 M fosfátovým tlmivým roztokom pH 7,5 sa aktivovaná mikrokrystalická celulóza .suspenduje v 40 objemových dieloch fosfátového tlmivého roztoku pH 7,5 a ihned sa přidá 5 obje?mových dielov zvieracej (kozej) protilátky proti králičiemu imunoglobulmu. .1 mobi 1 izácia prebieha za tmy po dobu 24 hodin. Iniobilizovaná protilátka sa potom promyje fosfátovým tlmivým roztokom a nariedi v pomere 1:10. Takto připravené precipitačně činidlo io priamo připravené k použitiu.

K 200 _ful spor ifickci protilátky proti TSH sa přidá 200 μΐ standardu, resp. neznámej vzorky krvného séra. Po prodinkubácii 3 dni pri teplote 20 °C sa do reakčnej zmesi přidá 1.00 pl TSH značeného jódojn 125. Zmes sa nechá stáť 24 h pri teplote 20 °C. Potom následuje přidáni přec i pí lačného činidla po 500 μΐ na skámavku a inkubácia 1 hodinu pri 20 °C. Po kréitke j cen tr.i fugácii (5 až 10 minut pri 2 000 ot./min.) sa supernatant odstráni a zmeria sa radioaktivita sedimentu. TSH možno takto stanovil v koncentračnom rozsahu 0,6 až 40 mlU/1 s dosti» točnou citlivoslou /0,15 mIU/1) a nízkým variačným koeficientom (do 5,5 %) a nespecifickou vázbou (do 2,7 %) .

P r i I; 1 a d 2 kádi o i.munoanalýza alfafetoprotei nu (AFP)

100 (U l specificko) protilátky proti AFP, 100 μΐ tlmivého roztoku pH 7,5, 100 /11 125 1. AFP a 100 (til standardu (vzorky) sa nechá inkubovať 18 hodin pri teplote 20 °C. K reakčnej zmesi sa potom přidá 500 μΐ suspenzie imobilizovanej zvieracej protilátky proti králičiemu Lmunog1obuli nu, pripravenej postupem uvedeným v příklade 1. Po premiešaní a inkubácii i hodinu pri teplote 20 °C následuje krátká centrifugácia, odsatie supernatantu a moran io rád ioaktiv i t y šedi mentu.

Týmto postupem možno stanovil hodnoty AFP vo vzorkách krvného séra v rozsahu 6,25 až 400 ΓΗ/Μ1 s vysokou citlivoslou stanovenia (2 lU/ml) a velmi nízkou hodnotou nešpecifickej vazby (do 2,5 5 ) .

P r f k 1 a d 3

Rádioimunoanalýza ty rog lobu línu (Tg)

K 200 μΐ standardu (neznámej vzorky séra) sa přidá 100 ^1 špecifickej protilátky proti tyroglobulínu. Po predinkubácii 3 h pri 37 °C sa do reakčnej zmesi přidá 100 μΐ Tg značeného jódom 125 a zmes sa nechá stáť cez noc pri 20 °c. Potom sa do každej skúmavky přidá 500 (til precipitačného činidla, připraveného postupom uvedeným v příklade 1. Po inkubácii

266 282 HI

J. h pri 20 C a krátkej centri Iugáci i sa supernatant odsaje a zmeria sa radioaktivita sedimentu.

Uvedeným । <>;! upem možno s I a m </ i f hodnoty IyiogIohuI i mi v krvhont S''r<· v rozsahu 7 , 6 až ^r>(l (1 ^K|1 <; í · i I I i './os 1' on s t a i io u< -n i . t

P r i k I a d 4

Rád i o i munoa na I y l i ck<' u ta noven i o a Γ I a t ox í nov v mlieku

Do skúmavick sa pipctuje po H>0 μ} standardu Inu ¹ ového mJieka alebo neznámej vzorky), 1 ¹ 5 spccifickej protilátky proti aflatoxínu M ] a radioindikátora ( 1 - A FLA Bj ) . Zincs sa zamiosa a inkubuje cez noc pri 20 ³C. Do skúmaviek sa potom přidá po 500 μΐ prccipitačného činidla, připraveného postupom uvedeným v příklade 1 / s obsaho? 1 ?. TWEENU 80). Reakčná zmes sa nechá inkubovať i li pri 20 °C, skúmavky sa potom centrifugujú 10 minut pri 2 000 g, supernatant sa odsaje a zmeria sa radioaktivita sedimentu.

Týmto postupom možno stanovit hodnoty aflatoxínov v mlieku v rozsahu 0,062 5 až 2,0 (Ug/1 s citlivosťou stanovenia 0,05 A»g/1 a variačnýrn koeficientom do 5,9 5, s nespecifickou vazbou do 5,5

Příklad 5

Rádioi munoanalýza ochratoxinu A

Ku 100 μΐ chloroformového extraktu zo vzorky krmivá, potraviny alebo tkaniva sa přidá } 25

100 μ 1 roztoku radioindikátora ( 1-ochratoxin) a 100 ^ul specifické] protilátky proti ochratOKÍnu Λ. Zmes sa inkubuje I hodinu pri 45 Do každej skúmavky sa potom přidá po 500 μΐ precipitučného činidla a dalším postupom, rovnakým ako v piedchádzajúcich příkladech, možno stanovit hodnoty ochratoxínu A v extraktech z rastlinných .alebo živočišných vzoriek v rozsahu 10 až 320 mg/100 /ul s citlivosťou stanovenia 8 mg/100 ^iJ a variačnýrn koeficientom do 5,7 %.

Claims (2)

1. PŘEĎME T V Y N Á J. E Z U

   1. Sposob rádioitnunochemického stanovenia antigenov s rožnou strukturou vyznačujáci sa tým, že ku specifické i protilátko, inkubovanej vhodná dobu s roztokem jej antigénu značenému jódom 125 a neznámou vzorkou príp. standardom, sa přidává supsenzia imobilizovanej zvieracej (s výhodou kozej) protilátky proti králiciomu imunoglobulínu vždy v rovnakej koncentraci! a objeme bez ohTadu na stanovovaný druli antigénu, pričom po inkubácii 1 h pri 20 C sa vzniknutý imunochemický komplex odstředí, zmeria sa jeho radioaktivita, pomocou ktorej možno porovnáním s hodnotami standardov c> známe j koncentrácii st anovit množstvo daného antigénu v neznámej vzorke.
2. 2. Spósob podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že zvieracia protilátka proti králičiemu imunoglobulínu sa imobilizuje na povrchu modifikovanéj mikrokrystalickej celulózy s velkosťou častíc 5 až 15 (lim majácích velmi nízku sedimentaénú rýchlosť, aktivovanej 1,1 -karbonyldilmi dazolom.