CS267395B1

CS267395B1 - A method of preparing digalacturonic acid

Info

Publication number: CS267395B1
Application number: CS885612A
Authority: CS
Inventors: Kveta Ing Csc Heinrichova; Maria Rndr Dzurova
Original assignee: Heinrichova Kveta; Maria Rndr Dzurova
Priority date: 1988-08-15
Filing date: 1988-08-15
Publication date: 1990-02-12
Also published as: CS561288A1

Abstract

Riešenie sa týká spósobu pripravy kyseliny digalakturónovej, pri ktorom sa na pektan sodný pósobí imobilizovanou D-galakturonandigalakturonohydrolázou pri pH 6,8 až 7,2 a teplote 30 až 40 °C po dobu 15 až 20 hodin. Jediným produktom reakcie je kyselina digalaktorónová.The solution relates to a method for preparing digalacturonic acid, in which sodium pectate is treated with immobilized D-galacturonodigalacturonohydrolase at pH 6.8 to 7.2 and temperature 30 to 40 °C for 15 to 20 hours. The only product of the reaction is digalacturonic acid.

Description

Vynález sa týká spósobu přípravy kyseliny digalakturónovej účinkom imobilizovanej D-galakturonandigalakturonohydrolázy na pektan sodný.The invention relates to a process for the preparation of digalacturonic acid by the action of immobilized D-galacturonandigalacturohydrolase on sodium pectate.

Kyselina digalaktorónová sa doteraz priemyselne nevyrába a pieto nie je dostupná na svetovom trhu. Bola připravená v niekol’kých laboratóriách a to cestou parciálnej kyslej hydrolýzy: Rexová-Benková L Chem. Zvěsti 21, 58 (1970), alebo enzymovou hydrolýzou D-galakturonanu účinkom endo-D-galakturonanáz: Demain A. L„ Phaff H. J.: Arch. Biochem. Biophys. 51, 114 (1967), Hatanaka Ch., Ozawa J.: J. Agr. Chem, Soc. Japan 40, 421 (1968), Nagel C. W., Wilson T. M.: J. Chromatogr. 41, 110 (1968)7 Voragen A. G., Pilník W.: Ztsch. Lebensm. Untersuch, Forsuch. 142 370 (1970), Heinrichová K.: Biológia (Bratislava) 38, 335 (1983), Heinrichová K.: AO 209874 (1982). Ku přípravě oligogalakturónových kyselin sa použili i imobilizované endo-D-galakturonanázy: Van Houndenhoven E. A., De Vitt I. G., Visser J.: Carbohydr. Res. 34, 233 (1972), Bock W., Krause M., Goebel H., Anger H., Schwaller J., Fleming H. A., Gabert A.: Nahrung 22, 183 (1978), RexováBenková 17, Omelková J., Kubánek V.: AO 218198 (1983). Postup přípravy kyseliny digalakturónovej účinkom imobilizovanej D-galakturonandigalakturonohydrolázy doteraz nebol popísaný. Všetky doteraz popísané (hoře uvedené postupy) sa týkajú přípravy viac alebo rnenej heterogennej zmesi oligogalakturónových kyselin s rozdielným zastúpením kyseliny digalakturónovej. Spoločným rysom uvedených postupov je, že vedú k malým výťažkom kyseliny digalaktorónovej, popři výťažku ostatných oligogalakturónových kyselin. Izolácia kyseliny digalakturónovej zo zmesi oligogalakturónových kyselin má mnohé nevýhody, pracnost’, časovú náročnost’ a viacstupňové delenie na molekulových sitách a biogéloch.Digalactoronic acid is not yet produced industrially and five are not available on the world market. It was prepared in several laboratories by partial acid hydrolysis: Rexová-Benková L Chem. Rumors 21, 58 (1970), or by enzymatic hydrolysis of D-galacturonan by endo-D-galacturonanases: Demain A. L. „Phaff H. J .: Arch. Biochem. Biophys. 51, 114 (1967), Hatanaka Ch., Ozawa J .: J. Agr. Chem, Soc. Japan 40, 421 (1968), Nagel C. W., Wilson T. M .: J. Chromatogr. 41, 110 (1968) 7 Voragen A. G., Pilník W .: Ztsch. Lebensm. Search, research. 142 370 (1970), Heinrichová K .: Biology (Bratislava) 38, 335 (1983), Heinrichová K .: AO 209874 (1982). Immobilized endo-D-galacturonanases were also used to prepare oligogalacturonic acids: Van Houndenhoven E. A., De Vitt I. G., Visser J .: Carbohydr. Res. 34, 233 (1972), Bock W., Krause M., Goebel H., Anger H., Schwaller J., Fleming HA, Gabert A .: Nahrung 22, 183 (1978), RexováBenková 17, Omelková J., Kubánek V .: AO 218198 (1983). The process for the preparation of digalacturonic acid by the action of immobilized D-galacturonandigalacturohydrolase has not been described so far. All the processes described so far (above-mentioned) relate to the preparation of a more or less heterogeneous mixture of oligogalacturonic acids with different proportions of digalacturonic acid. A common feature of these processes is that they lead to low yields of digalactoronic acid, in addition to the yield of other oligogalacturonic acids. Isolation of digalacturonic acid from a mixture of oligogalacturonic acids has many disadvantages, laboriousness, time consuming and multistage separation on molecular sieves and biogels.

Tieto nedostatky odstraňuje sposob přípravy kyseliny digalakturónovej účinkom imobilizovanej D-galakturonandigalakturonohydrolázy, ktorého podstata spočívá v tom, že sa na pektan sodný pósobí imobilizovaným selektívne degradujúcim pektolytickým enzýmom - D-galakturonandigalakturonohydrolázou pri teplote 30 až 40 C a pH 6,8 až 7,2, pričom jediným produktom enzýmom katalyzovanej reakcie je kyselina digalakturónová, ktorá sa oddělí na kolóne Sephadexu G-10 a efluent sa odpaří, alebo vysuší mrazovou sublimáciou. Ďalšou výhodou tohoto postupu je kontinuálně a viacnásobné využitie preparátu imobilizovaného enzýmu v reakcii, čo oproti aplikácii roz.pustného enzýmu vedíe k značným úsporám na nákladech.These shortcomings are eliminated by the method of preparation of digalacturonic acid by the action of immobilized D-galacturonandigalacturohydrolase, the essence of which consists in the action of sodium pectate by the immobilized selectively degrading pectolytic enzyme - D-galacturonandigalacturohydrolase at a temperature of 30 to 40.2 wherein the only product of the enzyme catalyzed reaction is digalacturonic acid, which is separated on a Sephadex G-10 column and the effluent is evaporated or freeze-dried. Another advantage of this process is the continuous and multiple use of the immobilized enzyme preparation in the reaction, which leads to significant cost savings compared to the application of a soluble enzyme.

Kyselina digalakturónová je látka dóležitá z hl'adiska teoretického štúdia pektínových látok a pektolytických enzýmov a pre charakterizáciu v priemysle používaných pektináz. Je doteraz jediným substrátom na základe ktorého je možné identifikovat’ a stanovit’ aktivitu exo-D-galakturonáz v komplexe pektolytických enzýmov.Digalacturonic acid is an important substance for the theoretical study of pectin substances and pectolytic enzymes and for the characterization of pectinases used in industry. It is still the only substrate on the basis of which it is possible to identify and determine the activity of exo-D-galacturonases in the complex of pectolytic enzymes.

Spósob přípravy imobilizovanej D-galakturonandigalakturonohydrolázy je predmetom čs. autorského osvedčenia číslo 263 186 (Heinrichová 1986).The method of preparation of immobilized D-galacturonandigalacturohydrolase is the subject of MS. author's certificate number 263 186 (Heinrich 1986).

Příklad 1Example 1

100 ml 0,7 % roztoku pektanu sodného v 0,1 molu . I ' fosfátovom tlmivom roztoku pH 7,0 sa perkoluje temperovanou (30 °C) kolonou imobilizovanej D-galakturonandigalakturonohydrolázy. Prietok kolonou, 10 ml/h je udržiavaný peristaltickou pumpou. Úplná limitovaná konverzia substrátu prebehne za 20 hodin. Efluent z kolóny sa zahustí vákuovým odpařováním pri 40 °C, alebo vysuší mrazovou sublimáciou. Hydrolyzát sa nanesie na štipec Sephadexu G-10, kde sa oddělí kyselina digalakturónová od polymérneho zvyšku za súčasného odsolenia produktu. Frakcie s kyselinou digalakturónovou sa spoja a vysušia mrazovou sublimáciou.100 ml of a 0.7% solution of sodium pectate in 0.1 mol. I 'phosphate buffer pH 7.0 is percolated with a tempered (30 ° C) column of immobilized D-galacturonedigalacturohydrolase. The flow rate through the column, 10 ml / h, is maintained by a peristaltic pump. Complete limited substrate conversion will occur in 20 hours. The column effluent is concentrated by vacuum evaporation at 40 ° C or freeze-dried. The hydrolyzate is applied to a Sephadex G-10 pin, where the digalacturonic acid is separated from the polymer residue while desalting the product. The digalacturonic acid fractions are combined and freeze-dried.

Výťažok kyseliny digalakturónovej je 54 %.The yield of digalacturonic acid is 54%.

Příklad 2Example 2

Suspenzia kovalentnou vazbou imobilizovanej D-galakturonandigalakturonohydrolázy v tlmivom roztoku o pH 6,8 až 7,2 sa naplní do kolóny, ktorou preteká 0,75 % roztok pektanu sodného (prietok 20 ml/h) do vtedy kým sa nedosiahne 54 % konverzia substrátu. Enzýmom katalyzovaná reakcia pri 40 °C. Efluent z kolóny sa odpaří mrazovou sublimáciou a spracuje ďalej podl’a příkladu 1.A suspension of covalently bonded immobilized D-galacturonedigalacturohydrolase in pH 6.8 to 7.2 buffer is loaded onto a column through which a 0.75% sodium pectate solution (flow rate 20 ml / h) is flowed until 54% substrate conversion is achieved. Enzyme catalyzed reaction at 40 ° C. The column effluent was evaporated by freeze sublimation and worked up further according to Example 1.

Příklad 3 ml 1 %-ného roztoku pektanu sodného v 0,05 mólu. I ’ tlmivom roztoku pH 6,8 sa inkubuje so suspenziou D-galakturonandigalakturonohydrolázy kovalentne viazanej na nosič polyakrylamidového typu. Enzýmom katalyzovaná reakcia prebieha za miešania v temperovanej nádobě s dvojitým plášťom pri 35 °C. Reakcia sa ukončí odsátím imobilizovaného enzýmu skleněnou fritou. Ďalšie spracovanie hydrolyzátu podl’a příkladu 1.Example 3 ml of a 1% solution of sodium pectate in 0.05 mol. The pH 6.8 buffer is incubated with a suspension of D-galacturonedigalacturohydrolase covalently bound to a polyacrylamide-type support. The enzyme-catalyzed reaction takes place with stirring in a tempered double jacketed vessel at 35 ° C. The reaction is terminated by aspirating the immobilized enzyme with a glass frit. Further processing of the hydrolyzate according to Example 1.

Schopnosť imobilizovaného enzýmu katalyzovať zmienenú degradáciu pektanu sodného je závislá od obsahu D-galakturonandigalakturonohydrolázy na nosiči a relatívnej aktivitě preparátu ako i od reakčných podmienok uvedených v príkladoch 1 až 3. Preparáty použité v príkladoch 1 až 3 pri štiepení glykozidických vázieb pektanu sodného vykazovali 23 až 30 % z aktivity volného enzýmu. Okrem uvedeného výťažok kyseliny digalakturónovej je závislý i od obsahu neutrálnych sacharidov v reťazci polygalakturonanu. V naších pokusoch použitý pektan sodný obsahoval 1,8 % ramnózy a preto 54 %-ný výťažok kyseliny digalakturónovej představuje úplnú limitovaná degradáciu polyméru.The ability of the immobilized enzyme to catalyze said degradation of sodium pectan depends on the content of D-galacturonandigalacturohydrolase on the support and the relative activity of the preparation as well as the reaction conditions given in Examples 1 to 3. The preparations used in Examples 1 to 3 cleaved % of free enzyme activity. In addition, the yield of digalacturonic acid depends on the content of neutral carbohydrates in the polygalacturonan chain. The sodium pectan used in our experiments contained 1.8% rhamnose and therefore a 54% yield of digalacturonic acid represents a complete limited degradation of the polymer.

Claims

Process for the preparation of digalacturonic acid, characterized in that the sodium octane is treated with immobilized D-galacturonandigalacturon hydrolase at pH 6.8 to 7.2 and a temperature of 30 to 40 ° C for 10 to 20 hours to give digalacturonic acid.