CS267936B1 - živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze, psinke, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hepatitide vhodná predovšetkým na profylaxiu kožušinových zvierat a sposob jej pripravy - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká živej atenuovanej vakeiny proti parvoviróze, psinke, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hepatitide vhodnej predovšetkým na profylaxiu kožušinových zvierat a sposobu jej pripravy na buňkových kulturách. Vakcina je určená na ochranné a núdzové očkovanie vnímavých zvierat proti uvedeným ochoreniam. Vakcina je lyofilizovaná a vyznačuje„sa tým, že obsahuje v 1 ml najmenej 10* TKIĎ5Q částic parvovirusu psov, kmeňa CPVA-BN 80/82 CAPM V-290, 10·5 ΤΚΙΟ-θ částic virusu infekčnej laryngotracheitidy, kmeňa CAOV-2 H-5/85 MO CK40 CAPM V - - 320, adaptovaných na buňkové kultury a lyofilizačné médium. Virus infekčnej laryngotrachei tidy sa pomnožuje na stabilnej linii MDCK v rainimálnom esenciálnom médiu podfa Eaglea. Po ukončeni kultivácie ja virusové materiály zmiešajů s lyofiUzaíný· médiom a lyofilizujú.

Description

Vynález sa týká ž i ve j atenuovanej vakci ny proti parvoviróze, psi nke, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hepatitide, a sposobu jej přípravy na buňkových kulturách.

Popři všeobecne známých pSvodcoch virusových ochoreni psov ako sú běsnota, psinka a infekčná hepatitida, spolehlivo kontrolovaných efektivnymi atenuovanými vakcinami existuje celý rad virusov, ktoré sú pávodcami častých ochoreni zažívacích a dýchacích orgánov. K týmto v prvom řade patria; paravirus psov, p£vodca akútneho črevného ochorenia postihujúceho prevážne mláďata, virus infekčnej laryngotrachei tidy a virus parainfluenzy 2 psov, ktoré samostatné, alebo v súčinnosti s bakteriálnym zárodkom Bordetella bronchiseptica vyvolávají! hromadné ochorenia dýchacích orgánov /Kennel cough syndrome/. Appel v roku 1978 definoval patogenitu parvovirusu psov /CPV 2/ a označil ho ako povodců epizoocie črevného ochorenia ktoré sa objavilo prvýkrát v roku 1978 v Spojených štátoch.

Ochorenie vyvolané týmto virusom sa klinicky prejavuje nechutenstvem, malátnostou, zvracanim a hnačkou, ktorá móže byt krvavá. Zvieratá majú horúčku a pri hematologickom vyšetřeni sa spravidla zistuje znížený počet leukocytov. Srdcová forma ochorenia postihuje výhradně štenatá a je charakterizovaná rýchlym a velmi krátkým priebehom a následné úhynom. Ochorenie sposobuje výrazné straty v chovoch psov, pričom úhyn představuje 20 až 40 % z celkového počtu zvierat. Ochorenie postihuje všetky věkové kategorie zvierat, ale najraS štenatá, pričom nástup je prudký a priebeh velmi rýchly.

Psi adenovirus serotypu 2 /CADV-2/, izolovaný a identifikovaný DITSCHFIELDOM, 1962 je serologicky, antigénne, svojim trpizmom a klinickým prejavom ochorenia odlišný od virusu infekčnej hepatitidy psov /ICH/.

Ochorenie vyvolané týmito virusom má charakter infekčnej laryngotracheitídy, tracheobronchitidy, zápalu nosofaryngu a pluc, s klinickými prejavmi nádchy, spontánneho kašla zapříčiněného zúžením priechodnosti priedušiek, a plúcnej hyperventilácie doprevádzanej zváčšením bronchyátnych lymfatických uzlin. Patologicko anatomický obraz charakterizuje infiltrácia submukozy lymfocytami, plazma tickými buňkami a neutrofilmi, proliferativne intersticiálna pneumonia, nekrotizácia bronchov a bronchiolitis. Při infekcii virusom CAOV-2 sa zaistujú vnútrojadrové inklúzie lokalizované v epite l i a lnych buňkách nosovej a faryngeálnej sliznice

Specifická profylaxia uvedených virusových ochorení, ktoré predstavujú v chovoch psov vážný zdravotný problém je založená na pasívnej imunizácii podáním hyperimúnnych sér alebo imúnnych sérových globulinov, ale najčastejšie sa využiva aktívna imunizácia. p Vo svete bolí vyvinuté inaktivované a živé monovalentné a kombinované vakcíny /CANDUR p p P O

-P, MULTIMUN 7, NOBI VAC-SH, ENDURACELL 7 - NSR, GALAXY -VI - USA/ First Live canine parvovirus vaccine, Vet.Rec. 17,1984, 114 No.11 p.255; Stettner, W. - Schutzimpfungen beim Hund, Wiener. TierSrztliche Monatsschrift, 72, 1985, Heft 5 S.178-182., Langzeituntersuchung zur Immunogenit8t eines Kombinationipfstoffes fUr Hunde, Zygraich, N., - Charlier,?. - Florent,G., - Gill, HM.A., - a spol Kleintierpraxis 30, 1985, 45-49.

Aj keď v zastúpení jednotlivých virusových kmeňov vo vakcínach je značná roznorodost, všeobecne sa požaduje aby jedna vakcinačná dávka obsahovala minimálně 10²'⁵ až 10^3z°TKI05q z každého virusu.

Vzhladom na všeobecný výskyt parvovirózy psov a narastajúcí počet respiratorných ochoreni, pri vylúčeni účinku vírusov psinkového komplexu u masožravých kožušinových zvierat, postavili sme si za ciet získat, alebo izolovat odpovedajúci virusový kmen, s perspektivou použit ho na přípravu očkovacích látok. Jednotlivé izoláty vírusov ifekčnej la ryngotrachei ti dy a parvovirusu sme cestou chemických, šero logických a virologických metod identifikovali, klonovali, potvrdili ich puritu a elektrónopticky znázorni li. Po ukončeni etenuácie jednotlivých virucov na rázných druhoch buňkových kultůr a overeni ich naikodnotti na vni«evých zvieretách ··· vyvinuli živú kombinnovenú vakcinu proti uvedený· infekciá·.

Predaetoa vynálezu je teda živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze a obsehoa kaena CPVA-BN 80/82 CAPR V-290 v anožatve 10³ ΤΚΙ05θ, psinko · obsahom kmene CbV-F-BN 10/83 CAPR v-289 v Množstvo 10³ ΤΚΙ05θ, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hopatitide, ktorá sa vyznačuje tý·, že obsahuj· v 2 al kaen parvovirusu psov, CPVA-BN 80/82 CAPR V-290, v anožstve najasnoj 10³ TKlb$0, keen virusu psinky CDV-F-BN 10/83 CAPR V-289 v anožatve nojnonej 10³ TKIO5O a keen virusu infekčnej laryngotracheitidy CAOV-2 H-5/85 R0CK40 CAPM V-320 v anožstv· 10²'⁵ TKIĎjq Částic virusu. Vakcina obsahuj· tyofiUzečné Rádiu· množstvo 25 až 50 hmotnostných percent, ktorá sa skládá zo sacherózy, fosforočnanového pufru, glutamátu sodného alebo draselného, bovinného albuminu alebo iného zdroj· bielkovin e želatiny, alebo dextránu. Výroba vakciny sa vyznaCuje tým, že kultiváty parvovirusu psov a virusu psinky připravené znány· spásoboa sa zmieéajú s kultivátom virusu Infekčnej laryngotracheitidy CADV-2 H-5/85 RDCK40 získaný· pomnožonim na stabilnej linii RDCK. Virus infekčnej laryngotracheitidy se na uvedenej stabilně! linii množí pri teploto 37 °C po dobu 3 až 6 dni, kedy sa vytvoria výrazné cytopatické zněny a poton sa virusový nateriál zniela s lyofiUzočným nédion a lyofilitizujo.

Virus infekčnej laryngotracheitidy představuje virulentný kmen zahraničnej proveniencie získaný vo forme lyofilizátu infekčných tkaninových tekutin v 5. pasáži na buňkových kultůrach. Atenuácia virusu, homogenita virusovej populácie a stabilita imunobiologických vlastnosti sa dosiahla v 35. pasáži na b.l. MOCK. K priprave vakciny bol použitý virus v 40. pasáži na uvedenom druhu tkaniva atenuovaný a definovaný na našom práčovi sku.

Virusové kmene parvovirusu psov CPVA-BN 80/82 CAPM V-290, psinky CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 a infekčnej laryngotrachei tidy CADV-2 H-5/85 MOCK 40 CARM V-320, sú uložené v Československem zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstva v Brně, Hudcova 60.

Postup výroby vakciny:

Spásob výroby vakciny je založený na tom, že uvedené vakcinačné kmeny, neškodné pre všetky věkové kategorie psov a masožravých kožušinových zvierat pri (ubovotnej aplikácii, sa pomnožujů na definovaných buňkových substrátech narastenýeh na skle, plastickej hmotě, kultivovaných stacionářnym sposobom alebo v otáčaných ftašiach /rolleroch/, připadne na mikronosičoch.

Sp2sob infekcie buniek FE vakcinačným virusom parvovirózy psov:

i

Suspenzia buniek o hustotě 5 až 10.10 buniek . ml v rastovom médiu sa zmieša s vakcinačným virusom při multiplicite infekcie od 0,0001 do 0,001. Zmes virusu a buniek sa inkubuje při 36 až 38 °C počas 30 až 60 mitút. Potom sa zmes virusu a buniek nariedi v rastovom médiu, ktoré představuje minimálně esenciálně médium podta Eagla s pH 6,8 až 7,3 s pridavkom pletich až desiatich hmotnostných percent bovinného sére s vyznačenou kvalitou.

Rovnako je možné do bunkovej suspenzie v rastovom médiu přidat inokulum vakcinačného virusu o multiplicite infekcie 0,0001 až 0,001 a zmes virusu □ buniek vyliat do kultivačnej nádoby.

Takto připravená suspenzia buniek za účelom pripravy vakciny sa kultivuje na skle, plastickej hmotě, štacionárnym spúsobom, alebo v otáčaných ftašiach /rolleroch/, pri

CS 267936 B1 3 padne na mikronosičoch, při 36 až 38 °C počas 4 až 8 dni.

Možná je tiež intekcia prichytených buniek na kultívačom povrchu - po štvor až šesthodinovej inkubácii buniek linie FE pri 36 až 38 °C. Do pastového média sa přidá inkulum vakcinačného virusu oni multiplicite infekcie 0,0001 až 0,001. Imkubácia pokračuje pri 36 až 38 °C počas 4 až 8 dni. Množenie virusu je rovnako ako v bode A a B sprevádzané výraznými cytopatickými změnami.

Sposob infekcie buniek kuracich embryonálnych fibroblastov KEB a buniek linie VĚRO virusem psinky.

Buňkové kultury KEB alebo VĚRO sa infikujú vakcinačným kmeňom virusu psinky pri multiplicite Infekcie najmenej 0,005. Infikujú sa 24 až 48 hod. buňky narastené na kultivačnom povrchu tak, že sa vymeni rastové médium za udržovacie, do ktorého je přidané infekčné inokulum. Udržovacie médium je pře jednotlivý druh buniek rovnakého zloženia ako rastové, ale neobsahuje sérum a má upravený obsah hydrouhli či tanu sodného na 0,1 až 0,2 hmotnostných percent,

Alebo sa zmes virusu a buniek nechá inkubovat počas 60 až 120 min. pri 37 °C, potom sa suspenzia buniek nariedi v rastovom médiu tak, aby obsahovalo 4-8.10⁶ buniek . -1 ml . buniek.

Rovnako je možné infekčné inokulum přidat do suspenzie buniek v rastovom médiu a bez predchádzajúcej inkubácie naliat do kultivačnej nádoby. Za 24. až 48 hodin sa rastové médium vymeni, bez oplachu jednovrstvý buniek, za udržovacie a inkubácia pokračuje za rovnakých podmienok. Po zisteni prvých cytopatických zmien /obvykle za 72 až 96 hod./fa médium vymieňa v 24 hodinových intervaloch, přidá doň lyofilizačné médium a uchovává v zmrazenom stave až do přípravy kombinovanej vakciny před lyofi lizáciou, alebo sa kultivácia nechá prebiehat tak dlho, dokiat viac ako 50 percent jednovrstvý buniek je postihnutá virusšpecifickými změnami a virusová suspenzia sa zbiera len jednorázovo.

Sposob infekcie buniek MDCK vakcinačným virusom infekčnej laryngotracheitidy.

Buňkové kultury sa infikujú vakcinačným kmenom virusu infekčnej laryngotrachei tidy pri multiplicite infekcie 0,1 až 0,001. Infikujú sa 24 až 48 hodinové kultúry narastené na kultivačnom povrchu tak, že sa odstráni rastové médium a po 30 až 60 minútovej adsorbcii virusu na buňky pri 36 až 38 °C sa přidá udržovacie médium. Udržovacie médium je rovnakého zloženia ako rastové, ale neobsahuje sérum. Inkubácia pokračuje pri 36 až 38 °C počas 3 až 5 dni. Rovnako je možné infekčné inokulum přidat do suspenzie buniek v rastovom médiu a bez predchádzajůcej inkubácie naliat do kultivačnej nádoby. Za 24 až 48 hodin sa rastové médium vymeni, bez oplachu jednovrstvý buniek, za udržovacie a inkubácia pokračuje za rovnakých podmienok počas 3 až 5 dni. Kultivácia sa v obidvoch prípadoch nechá prebiehat tka dlho, dokial viac ako 80 percent jednevrstvy buniek je postihnutá vírusšpecifickýme změnami.

. Po ukončeni kultivácie sa infekčné tekutiny jednotlivých virusov zamiešajů s lyofilizačným médiom v pomere 50 až 75 hmotnostných percent virusu k 50 až 25 hmotnostných percent lyofilizačného média a uchovávajú pri -15 až -20 °C až do lyofilizácie, lyofilizačné médium je možné pri zachovaní rovnakých hmotnostných pomerov přidávat až tesne před komplet izáciou a lyofilizáciou vakciny. Na přípravu lyofilizovanej vakciny sa po4 -1 užijů infekčné tekutiny s obsahom minimálně 10 TKID__n. ml částic virusu CPVA-BN 80/82 4 3 '

CAMP V-290, 10 ΤΚΙΟ^θ častíc virusu CDV-F-BN 10/83 CAPH V-289 a 10 ΤΚΙΟ^θ částic virusu CADV-2 H-5/85 MDCK 40 CAMP V-320, bakteriologicky sterilné. Takto připravené virusové suspenzie zmiešané v pomere 0,5 dielu parvovirusu a 1 dielu virusu psinky a 1 dietu virusu infekčnej laryngotracheitidy s l yofili začným médiom, ktoré obsahuje sacharózu, fosforečnanový pufor, glutamát sodný, alebo draselný, bovinný albumin alebo iný zdroj bielkovin, dextrán alebo želatinu /BOVARNICK, M.R. - MILLER, J.C. - SNYDER, J.C., The influence of certain salts, aminoacidsm, sugars, and proteins on the stability of rickettsiae. J. Bacteriol., 59, 1950; 509-522/ sa vo forint.· homogeni zá tu rozplňujú do ampuliek alebo liekoviek, lyofilizujů, vzduchotěsně uzatvoria a uchovávajů pri chladničkovej teplote. Vakcina připravená podia uvedeného postupu obsahuje najmenej 10³ ΤΚ10_ςη 3 -1 25-1 'parvovirusu, 10 ΤΚΙΟ^θ . ml virusu psinky a 10 ' ΤΚΙ0$θ. ml virusu infekčnej laryngotracheitidy, čo představuje jednu 1·υη1ζ·ίηύ dávku.

Živé atenuova vakcina proti parvoviróze, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hepatitide sa mfcže s výhodou používat na profylaxiu chorňb lišok a pescov, s klinickými prejavmi nádchy, výtoku z oči, laryngotracheitidy, tracheobronchitidy a paralýzy žádných končatin doprevádzaných 30 až 50 percentným úhynom z celkového počtu zvierat, ako tomu bolo v rokov 1985 až 1987. Živá atenuovaná vakcina, připravená podlá přihlášky vynálezu zaistuje požadovanů ochranu proti všetkým aktuálnym virusovým infekciám pri uvedených kožušinových zvierat.

Za současného stavu poznatkov nemá ňalšie rozširovanie spektra účinnosti očkovacej látky opodstatnenie, pričom pridanie dalších antigénych komponent by výrazné zvýšilo předpokládaná cenu výrobku /vakdny/, a negativné ovplyvnilo ekonomicku vo velkochovech kožušinových zvierat.

Uvedené příklady predmet vynálezu nijak neobmedzujú ani nevyčerpávajú:

Přiklad 1

Suspenzia buniek FE, MDCK, VĚRO, připravené pomocou proteolytických fermentov a suspenzia kuřácích ambryonálnych buniek /KEB/, připravená pomocou proteolytických fermentov z 11 dňových kuřácích zárodkov v rastových médiách, ktoré obsahujú definované množstvo aminokyselin a vitaminov s prldavkom 5 hmotnostných percent séra pri kultůrach KEB a VĚRO a 10 hmotnostných percent sér· určeného pre tkaninové kultůry pri kulturách FE a MDCK sa kultivujú na skle, štacionárnym spósobom a v suspenzii.

Přiklad 2

Spdsob infekcie buňkových kultúr vakcinačným virusem parvovirusu psov:

Buňkové kultůry připravené a pěstované podlá bodu 1. sa infikujů vakcinačný virusem CPVA-BN 80/82 pri mu11iplicite infekcie najmenej 0,001 nasledovnými spósobmi:

a. Suspenzia buniek linie FE o hustotě 10.10 buniek . ml v rastovom médiu sa zmieša s vakcinačným virusem pri multiplicite infekcie 0,001. Zmes virusu a buniek sa inkubuje pri 37 °C počas 30 minůt. Potom sa zmes virusu a buniek nariedi v rastovom médiu, ktoré představuje minimálně esenčiálne médium podia Eaglea s pH 7,2 a přídavkem 10 hmotnostných percent bovinneho séra.

-1

b. Do suspenzie buniek liniek FE o hustotě 5x10 .ml v rastovom médiu sa přidá inokulum vakcinačného virusu o multiplicite infekcie 0,001, a infikovaná suspenzia sa ihned vyleje do kultivačnej nádoby. Takto připravená suspenzia buniek za účelom přípravy virusu do vakciny sa kultivuje v Rouxových fíašiach pri teplote 37 °C počas 6 dni.

c. Infekcia prichytených buniek na kultivačnom povrchu po šesíhodinovej kultivácii buniek FE pri 37 °C sa do rastového média přidá inokulum vakcinačného virusu pri multiplicite infekcie 0,001. Inkubácia pokračuje pri 37 °C počas 6 dni. Množenie virusu je rovnako ako v bode a/ a b/ sprevádzané výraznými cytopatickými změnami.

Vakcinačný virus sa produkuje v rastovom médiu na buňkových kultůrach FE pěstovaných podlá bodu 1 a infikovaných podlá bodu 2. Po vytvořeni rozsiahlych cytopatických

CS 267936 81 zmien atenovných mikroskopicky sa kultivácia ukonči a do kultivačného média s pomnoženým virusom sa přidá priamo do kultivačných nádob vhodné lyofilizačné médium v pomere 50 hmotnostných percent virusovej suspenzie a 50 hmotnostných percent lyofizačného média. Zmes sa uchovává v kulticačných nádobách v zmrazenom stave.

Přiklad 3

SpSsob infekcie buňkových kultůr vakcinačným virusom psinky:

Inokulum vakcinaíného virusu, v ktorom je virus stabilizovaný pridavkom 10 hmotnostných percent dimetyIsulfoxidu sa uchovává v zmrazenom stave pri -70 °c. Buňkové kultúry připravené a pěstované podlá bodu 1. sa infikujů vakcinačným virusom CDV-F-BN 10/83 pri multiplicite infekcie najmenej 0,005 nasledovnými sposobmi:

a. Infekcia narastenej jednovrstvý buniek KEB: z monovrstvy buniek sa po 24 hodinovom raste odstáni rastové médium a buňková kultura sa infikuje inokulom přidaným do udržovacieho média, ktorým sa nahradí rastové médium.

b. Suspenzia buniek VĚRO v rastovom médiu s hustotou asi 10? . ml buniek sa zmieša s inokulom vakcinačného virusu, a zmes inkubuje pri 37 °C počas 30 min. Po ukončeni sa infikovaná suspenzia buniek nariedi v rastovom médiu tak, aby obsahovala A.IO^.ml buniek v 1 ml a kultivuje sa pri 37 °C 48 hod. t.j. až do vytvorenia úplnej jednovrstvý buniek na kultivačnom povrchu. Potom následuje výměna rastového média za udržovacie.

-1

c. Oo bunkovej suspenzie KEB v rastovom médi· s hustotou 4.10 . ml sa přidá inokulum vakcinačného virusu. Suspenzia sa i hne3 vleje do kulivačnej nádoby a inkubuje sa pri 37 °C počas 24 hodin t.j. až do vytvorenia jednovrstvý buniek. Potom následuje výměna rastového média za udržovacie.

Vakcinačný virus sa produkuje v udržovacom médiu, ktoré je svojim základným zloženim rovnaké ako rastové médium s tým rozdielom, že neobsahuje sérum a koncentrácia hyrouhliči tanu sodného sa pohybuje do 0,30 hmotnostných percent. Virus z buňkových kultůr pěstovaných podta bodu 1. sa infikovaných podlá bodu 3 sa získává nasledovnými sposobmi : t

a. Udržovacie médium sa ponechá bez výměny na kultúrach až do vytvorenia rozsiahlych cytopatických zmien stanovených mikroskopicky. 0o udržovacieho média s virusom sa přidá priamo do kultivačných nádob vhodná lyoflllzaáná mádlům v pomere 2 dlely virusovej suspenzie a jeden dlel lyofiltzačnáho média. Zmes se Sálej uchovává v kultivačných nádobách v zmrazenom stave.

b. Po objaveni sa prvých priznakov Specifických cytopatických zmien sa udržovacie médium zleje a do kultivačných nádob naleje rovnaké množstve udržovacieho média. Postup sa opakuje v 24. hod. intervalech až do vytvorenia rozsiahleho cytopatického efektu, kedy sa konečné ošetrenie vykoná podlá bodu a. Do virusovej suspenzie ziskanej pri opakovaných výměnách udržovacieho média sa bezprostředné po zliatí přidá lyofilizačné médium a Sálej sa uchovává v zmrazenom stave.

Přiklad 4

Spósob infekcie buňkových kultůr vakcinačným virusom infekčnej laryngotracheitldy:

Buňkové kultúry připravené a pěstované podlá bodu 1. sa infikujů vakcinačným virusom CADV-2 H-5/85 MD CK40 pri multiplicite infekcie najmenej 0,01 nasledovnými spósobmi:

a. Infekcia narastenej jednovrstvý buniek MOCK: Z monovrstvy buniek sa po 48 hodinovom raste pri 37 °C odstráni rastové médium, ktoré představuje minimálně esenciálně médium podia Eaglea a buňková kultůra sa infikuje adsorbciou virusu na buňky po dobu 60 minut pri 37 °C. Potom sa přidá udržovacie médium, ktoré je rovnakého zloženia ako pastové, ale neobsahuje sérum. 5 — 1

b. Oo bunkovej suspenzie v rastovom médiu s hustotou 4.10 . ml sa přidá inokulum vakcinačnéh i virusu. Suspenzia sa ihned vleje do kultivačnej nádoby a inkubuje sa pri 37 °C počas 48 hodin t.j. až do vytvorenia jednovrstvý buniek. Potom následuje výměna rastového média za udržovacie, a inkubácia pokračuje pri 37 °C počas 2 dni. Množenie virusu je v obidvoch pripadoch sprevádzané výraznými cytopatickými změnami bunkovej jednovrstvý. Vakeiačni virus sa produkuje v rastovom médiu na buňkových kultúrach MOCK pěstovaných podlá bodu 1. a infikovaných podlá bodu 4. Po vytvořeni rozsiahlych cytopatických zmien sa kultivácia ukonči a do kultivačného média s pomnoženým virusom sa přidá priamo do kultivačných nádob vhodné lyofilizačné médium v pomere 2 diety virusovej suspenzie a jeden dial lyofilizačného média. Zmes sa áalej uchovává v kultivačných nádobách v zmraženo stave.

Přiklad 5

Priprava kombinovanej vakciny:

Na pripravu lyofilizovanej vakciny sa použijú infekčné tekutiny s obsahom minimál4-1 4—1 ne 10 TKI0₅₀ . ml částic virusu CPVA-BN 80/82, 10 ΤΚΙβ^θ . ml částic virusu COV-F-BN 10/83 a 10³ TKIDjq částic virusu CAOV-2 H-5/85 M0CK40 bakteriologicky sterilně. Takto připravené virusové suspenzie sa zmiešajů v pomere 0,5 dielu parvovirusu a 1 dlel virusu psinky a 1 diel virusu infekčnej laryngotracheitidy. Homogenizovaný virusový materiál s požadovaným obsahom infekčných jednotiek s_a adjustuje, lyofilizuje, vzduchotěsně uzatvori a uchovává pri chladničkovej teplote. Vakcina připravená podlá uvedeného postupu obsahuje v jednej aplikačnej dávke najmenej 3 3 2 5

TKIDjq parvovirusu psov, 10 TKIď₅q virusu psinky a 10 ' ΤΚΙΟ^θ virusu infekčnej laryngotracheitidy.

porovnanie účinnosti živej atenuovanej vakciny proti parvoviróze, psinke, infekčnej laryngotrachei tide a infekčnej hepatitide vhodnej predovšetkým na profylaxiu kožušinových zvierar s účinnosiou monova lentnej vakciny proti infekčnej laryngotracheitide a bivalentnej vakciny proti parvoviróze a psinke odskůšané na liškách zobrazuje obraz 1. Uvedené hodnoty zobrazené graficky vyjadruhú priemerné titre hemaglutinačne-inhibičných protilátek proti parvovirusu a virusu infekčnej laryngotracheitidy a virus neutralizačných protilátek /VN/ proti virusu psinky. Z předložených výsledkov je zřejmé, že po očkováni polyvatentnou vakcinou boli proti očakávaniu zistované hodnoty protilátek na rovnakej úrovni ako po aplikácii mono- resp. bivalentnej vakciny. Navodenie takejte imunitnej odpovede sa nepředpokládáte a nebolo doposial u masožravých kožušinových zvierat zistované.

Z výsledkov uvedených v tabulke 1 vidiet, že vakcinované ani kontrolně zvieratá nereagovali na infekciu terénnym kmeňom psieho parvovirusu zaznamenatetnou poruchou celkového zdravotného stavu. Tieto nálezy podporujů aj údaje zistené McAdaraghom a kol. Experimental infection of conventional dog* with e*n1n· parvovirus. Ao^J.Vot.R·»./ Vol. 43, No.4, 1982, p. 693-696. .Ό infekcii virulentným virusom psinky ostali zdravé všetky vakcinované zvieratá, kým obidve kontrolně lišky uhynuli za charakteristických priznakov pslnkového ochorenia. Pri úplnej chránenosti vakcinovaných zvierat na infekciu virusom infekčnej laryngotracheitidy, reagovali dve z piatich kontrol přechodným, ale zjavným ochorenim horných dýchacích ciest. Rovnako ostali zdravé všetky vakcinované zvieratá infikované virusom infekčnej hepatitidy, ktorý je póvodca encefalitidy lišok, čo je prejavom krížovej chráCS 267936 B1 nenosil zvierat očkovaných vírusom infekčnej laryngotracheitidy proti infekci! virusom infekčnej hepatitídy /u lišok encefalitidy/. Obidve nevakcinované kontroly reagovali na infekciu vývojem klinických priznakov charakteristických pře virusovú encefalitidu lišok. ,

zvieratA	INFEKCIA	POČET	VÝSLEDKY
VÍRUSOM	ZVIERAT	Kliň, zdravé	Kliň, choré	Úhyn
	CPV	5	5	0	0
Vakcinova-	CDV	5	5	0	0
né	CADV-2	5	5	0	0
	CADV-1	5	5	0	0
	CPV	5	5	0	0
Kontroly	CDV	2	0	0	2
	CADV-2	5	3	2	0
	CADV-1	2	0	2	0

Tab. č. 1

Claims (4)

1. Živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze s obsahom kmeňa CPVA-BN 80/82 CAPM V-290 v množstve 10³ ΤΚΙΟ^θ, psinke s obsahom kmeňa CDV-F-BN 10/83 10/83 CAPM V-289 v množstve 10³ TKIDj θ, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hepatitide vyznačujúca sa tým, že obsahuje v 2 ml kmen parvovirusu psov CPVA-BN 80/82 CAPM V-290, v množstve najmenej 10³ TKID__n, kmen virusu psinky CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 v množ3 ⁵⁰ .

štve najmenej 10 TKID__n a kmen virusu infekčnej laryngotracheitidy CADV-2 H-5/85 2 .5

MDCK40 CAPM V-320 v množstve 10 ' ΤΚΙΟ^θ čestic virusu, a lyofilizačné médium.

2. Živá atenuovaná vakcina pódia bodu 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje lyofilizačné médium v množstve 25 až 50 hmotnostných percent vztiahnuté na hmotnost celej vakciny.

3. Živá atenuovaná vakcina podia bodu 1 až 3 vyznačujúca sa tým, že lyofilizačné médium obsahuje sachrózu, fosforečnaňový pufor, glutamát sodný alebo draselný, bovinný albumin alebo iný zdroj bielkovín a želatinu alebo dextrin.

4. Spósob výroby vakciny podta bodu 1 kultiváciou parvovirusu CPVA-BN 80/82 CAPM V-290 a virusu psinky č. CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 známým sposobom a vyznačujúci sa tým, že sa kultiváty parvovirusu a virusu psinky zmíešajú s kultivátora virusu infekčnej laryngotracheitidy CADV-2 H-5/85 MDCK40 CAPM V-320 ziskaný· poanožení· η» stabílnej linii budiek MDCK po 30 až 60 minútovej inťekcii 24 až 48 hodinovej monovrstvy v minimálnom esenciálnom médiu pódia Eaglea pri teplote 36 až 38 °C po dobu 3 až 6 dni, až do vytvorenia cytopatických zmíen a potom sa virusový materiál zmieša s lyofilizačnýra médiom na obsah minimálně 10 ' ΤΚΙ0₅θ .ml , a táto zmes sa lyofilizuje.

S. Sposob výroby ..«tiny podia bodu 4 vyznačujúci sa tým, že sa lyofil1 za čni médium přidává k viru»·.»· suspenziám bezprostředné po 1ch získáni a zmes sa uchovává až do lyofilizác1» . zmrazenom stave, alebo sa lyofilizuje okamžité.