CS268737B1 - Způsob kvantitativního luminometrického stanovení peroxidu vodíku a substrátu oxidáz - Google Patents

Abstract

ŘeSeni se týká způsobu kvantitativního luminometrického stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz. Tento způsob spočívá v injekci vzorku substrátu do kontinuelního proudu média. Stykem média s imobilizovaným enzymem odpovídajícím příslušnému substrátu vzniká při enzymatické oxidaci substrátu peroxid vodíku. Ten přichází dále do styku s imohilizovanou peroxidázou umístěnou v zorném poli luminometru. Médium obsahuje chemickou látku, která při reakci s peroxidem vodíku katalyzované peroxidázou vykazuje luminiscenci. Samotná kvantifikace se děje na základě srovnání mezi odezvami na neznámý stanovovaný vzorek substrátu a na známé množetví zkoumané látky. Tato stanovení je možno využít v oblasti biochemie, lékařské biochemie, fyziologie a farmag ceutického průmyslu.

Description

Vynález se týká způsobu kvantitativního luminometrického stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz.

Vytvoření analytických metod umožňujících kvantitativní stanovení biologicky významných látek s vysokou citlivostí je velkým problémem v biochemických laboratořích. Pro měření některých látek, které je možno působením oxidáz přeměnit na peroxid vodíku, je používáno luminiscence, při které je do kyvety luminometru napipetován příslušný stanovovaný substrát, jemu odpovídající oxidáza, peroxidáza a luminol příp. jiný akceptor elektronů. Oxidáza převede substrát na peroxid vodíku, který v přítomnosti peroxidázy reaguje s luminolem za vzniku luminiscence. Velikost luminiscence, registrované luminometrem, odpovídá původnímu množství stanovovaného substrátu. Metoda i její aplikace jsou podrobně popsány v knize M.A.Detuca /ed./, Methods in Enzymology, vol. 57, Bioluminiscence and Chemilumiscence (Academic Press New York, 1978/.

Tato metoda, přestože je vysoce citlivá, má své nevýhody. Nutnost přidání nového množství enzymů pro každé jednotlivé měření znamená vysokou spotřebu specifických enzymů. Měření samotné je pomalé a pracné. Tyto nevýhody odstraňuje způsob měření podle vynálezu. Jsou v něm uplatněny dva základní prvky novosti. Injekce měřených vzorků substrátů je prováděna přímo do kontinuálního proudu média, čímž odpadá přidávání jednotlivých enzymů ke každému vzorku a použité enzymy jsou navíc imobilizovány na vhodném nosiči, se kterým proudící médium přichází do styku.

Způsob kvantitativního stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz spočívá tedy v injekci vzorku substrátu do kontinuálního proudu média. Stykem média s imobilizovaným enzymem odpovídajícím příslušnému substrátu vzniká při enzymové oxidaci substrátu peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku prochází pak s médiem kolonkou s zmobilizovanou peroxidázou na nosiči, který je propustný pro světelné záření, např. drobné skleněné nebo plastové kuličky, stěny skleněné nebo plastové kapiláry apod.

Medium obsahuje chemickou látku např. luminol, isoluminol apod., která při reakci s peroxidem vodíku katalyzované peroxidázou slouží jako akceptor elektronů a při oxidaci vykazuje luminiscenci. Proto je zmobilizovaná peroxidáza umístěna přímo v zorném poli luminometru.

Světelný signál, vznikající při enzymatické redukci peroxidu vodíku, je přímo úměrný koncentraci peroxidu vodíku a tedy i původního vzorku substrátu pro použitou zmobilizovanou oxidazu. Samotná kvantifikace se děje na základě srovnání mezi odezvami na neznámý stanovovaný vzorek substrátu a na známé standardní množství zkoumané látky.

Princip tohoto způsobu stanovení je možno využít v oblasti biochemie, lékařské biochemie, fyziologického a farmaceutického výzkumu. Charakteristickým příkladem látek, které mohou být tímto způsobem stanoveny, jsou glukosa, cholin a cholesterol.

Příklad

Popsaný způsob byl použit ke stanovení množství acetylcholinu (ACh) v extraktech z mozkové tkáně. K tomuto účelu byla použita kombinace tří zmobilizovaných enzymů na třech za sebou následujících kolonách: acetylcholinestaráza /vytváří z acetylcholinu cholin/, cholinoxidáza /vytváří z cholinu peroxid vodíku/ a peroxidáza

CS 26Θ 737 Bl /katalýzuje interakci mezi peroxidem vodíku a luminolem, přítomným v proudícím médiu, a tím vznik luminiscence/. Do kontinuálního proudu média byly ve tříminutévých intervalech vstřikovány jednak vzorky známých množství ACh /500 pmol, 200 pmol, 100 pool atd./, jednak 250/ul množství tkáňových extraktů. OdpovSá luminómetru na standardní množství ACh se v průběhu pokusu neměnila. Porovnáním mezi odpovědí na známá množství ACh a na tkáňové extrakty bylo možno vypočítat koncentraci ACh v jednotlivých extraktech.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob kvantitativního luminometrického stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz v médiu obsahujícím chemickou látku, která při reakci s peroxidem vodíku, katalyzované peroxidázou, slouží jako akceptor elektronů a při oxidaci vykazuje luminiscenci, vyznačený tím, Že substrát oxidáz se injekuje do kontinuálního proudu média, se kterým se přivádí do styku s imobilisovaným enzymem, odpovídajícím příslušnému substrátu, převede se kvantitativně na peroxid vodíku, který dále prochází kolonkou umístěnou v zorném poli luminómetru a obsahující imobilizovanou peroxidázu, přičemž signály luminómetru odpovídají přímo úměrně množství příslušného substrátu případně peroxidu vodíku.