CS269750B1

CS269750B1 - Method of proteins immobilization

Info

Publication number: CS269750B1
Application number: CS891903A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Doc Ing Csc Marek; Marie Ing Machackova; Zdenek Ing Csc Chvatal
Original assignee: Marek Miroslav; Marie Ing Machackova; Chvatal Zdenek
Priority date: 1989-03-28
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1990-05-14
Also published as: CS190389A1

Abstract

Způsob imobilizace proteinů, například; enzymů a protilátek pro přípravu hetsrogen-j nich biokatalyzátorů, imunochemická stáno- i vení a afinitní chromatografií na organické! i anorganické nosiče obsahující hydroxylo- ’ vé, amino- nebo sulfhydrylové skupiny, vyznačující se tím, te se nosič aktivuje I působením perfluorovaného oleflnu, napří9' klad perfluorpropenu nebo perfluorcyklobutenu nebo fluorovaného dienu nebo polyénu např. perfluor-1, 3-butadienu nebo per1 fluorhexatrienu nebo 3-chlpr-nonafluor- -1,5-hexadienu, popřípadě za přítomnosti fluoridu draselného á na takto aktivovaný nosič se proteiny váží kovalentnl vazbou vytvořenou nukleofilní adicí svých skupin například sulfhydrylových nebo hydroxylových nebo aminoskupin a perfluorovanou dvojnou vazbu přítomnou na povrchů aktivovaného nosiče.A method of immobilizing proteins, for example; enzymes and antibodies for the preparation of heterogeneous biocatalysts, immunochemical determinations and affinity chromatography on organic and inorganic supports containing hydroxyl, amino or sulfhydryl groups, characterized in that the support is activated by the action of a perfluorinated olefin, for example perfluoropropene or perfluorocyclobutene or a fluorinated diene or polyene, for example perfluoro-1,3-butadiene or perfluorohexatriene or 3-chloro-nonafluoro-1,5-hexadiene, optionally in the presence of potassium fluoride, and the proteins are bound to the thus activated support by a covalent bond formed by nucleophilic addition of their groups, for example sulfhydryl or hydroxyl or amino groups, and a perfluorinated double bond present on the surface of the activated support.

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace proteinů, například enzymů a protilátek pro přípravu heterogenních biokatalyzátorů, imunochemická stanovení na pevné fázi a afinitní chromatografii.The invention relates to a method of immobilizing proteins, for example enzymes and antibodies, for the preparation of heterogeneous biocatalysts, solid-phase immunochemical assays and affinity chromatography.

Pro přípravu imobilizovaných proteinů pro uvedené účely byla vypracována řada postupů, založených převážná na různých formách fixace bílkovin na vhodných nosičích. Problematika imobilizace enzymů obecné použitelná i pro jiné bílkoviny je podrobně popsána v mnoha monografiích a přehledných článcích, například Chibata I.: Imobilized Enzymes. Research and Development, Kodansha, Tokyo (1978), Goldstein L., Manecke G.: The chemistry at enzyme Immobilization, Applied Biochemistry and Bioengineering, Academic Press, New IFor the preparation of immobilized proteins for the above purposes, a number of procedures have been developed, based mainly on various forms of protein fixation on suitable carriers. The issue of enzyme immobilization, which is generally applicable to other proteins, is described in detail in many monographs and review articles, for example Chibata I.: Immobilized Enzymes. Research and Development, Kodansha, Tokyo (1978), Goldstein L., Manecke G.: The chemistry at enzyme Immobilization, Applied Biochemistry and Bioengineering, Academic Press, New I

York (1976), Wiseman A.: Handbock of enzyme biotechnology. Ellis Horwood, Chichester (1975), Káš J., Marek M., Valentová O.s Imobilizované enzymy. (Principy imobilizace, vlastnosti a použití imobilizovaných enzymů), Mikrobiální technologie, Academia Praha * (1988), Marek M., Káš 3.: Techniky imobilizace enzymů kovalentní vazbou, Chem. průmysl 34, 337 (1984). .York (1976), Wiseman A.: Handbock of enzyme biotechnology. Ellis Horwood, Chichester (1975), Káš J., Marek M., Valentová O.s Immobilized enzymes. (Principles of immobilization, properties and use of immobilized enzymes), Microbial technology, Academia Praha * (1988), Marek M., Káš 3.: Techniques of immobilization of enzymes by covalent bonding, Chem. průmysl 34, 337 (1984). .

Nejjednodušším způsobem imobilizace bílkovin je jejich sorpce na různé druhy nosičů. Sorpční síly, které drží bílkovinu na povrchu nosiče jsou však v mnoha případech poměrné slabé a imobilizace je proto mnohdy nedostatečná. Z těchto důvodů se velmi často kombinuje sorpce s následným překřížením bílkovin na povrchu nosiče pomocí bifunkčních činidel.The simplest way to immobilize proteins is their sorption onto various types of carriers. However, the sorption forces that hold the protein on the carrier surface are in many cases relatively weak and immobilization is therefore often insufficient. For these reasons, sorption is very often combined with subsequent cross-linking of the proteins on the carrier surface using bifunctional reagents.

Nejvíce propracovanou technikou imobilizace bílkovin je jejich navázání kovalentní vazbou na aktivovaný nosič obsahující reaktivní skupiny^ které vytvářejí kovalentní vázby s vhodnými skupinami imobilizované bílkoviny. K chemické vazbš enzymů nebo i jiných bílkovin na nerozpustné nosiče lze využít celé řady funkčních skupin obsažených v bílkovinné části molekuly enzymu, tj.t Λ- a č-aminoskupiny, áG,/)-karboxylové skupiny, sulfhydrylové skupiny cysteinu, aromatické kruhy tyrosinu a tryptofanu, imidazolové skupiny histidinu a hydroxylové skupiny šeřinu, threoninu a především tyrosinu.The most sophisticated technique for immobilizing proteins is their covalent binding to an activated carrier containing reactive groups^ which form covalent bonds with suitable groups of the immobilized protein. For the chemical binding of enzymes or other proteins to insoluble carriers, a whole range of functional groups contained in the protein part of the enzyme molecule can be used, i.e. Λ- and ξ-amino groups, αG,/)-carboxyl groups, sulfhydryl groups of cysteine, aromatic rings of tyrosine and tryptophan, imidazole groups of histidine and hydroxyl groups of serine, threonine and especially tyrosine.

K základním typům reakcí využívajících uvedených funkčních skupin k imobilizaci bílkovin patří tvorba amidové vazby, alkylační metoda, diazotační metoda, substituční reakce thiol - disulfid, tvorba Schiffových basí, využití reaktivních isonitrilů především ve spojení s Ugiho reakcí atd.The basic types of reactions using the above functional groups for protein immobilization include amide bond formation, alkylation method, diazotization method, thiol - disulfide substitution reactions, formation of Schiff bases, use of reactive isonitriles, especially in conjunction with the Ugi reaction, etc.

Výběr imobilizační techniky úzce souvisí s vlastnostmi použitého nosiče a s účelem, pro který má být ímobllizovaný enzym nebo jiná nevázaná bílkovina použita. Obecně proto nelze určitý způsob imobilizace označit jako nejvhodnější a jiné jako nevyhovující. Volba druhu nosiče i způsobu imobilizace je v rozhodující míře determinována způsobem apli- ^x kace, pro který jsou enzymy nebo jiné bílkoviny imobilizovány.The choice of immobilization technique is closely related to the properties of the carrier used and to the purpose for which the immobilized enzyme or other unbound protein is to be used. In general, therefore, a certain method of immobilization cannot be described as the most suitable and another as unsuitable. The choice of the type of carrier and the method of immobilization is determined to a decisive extent by the method of ^application for which the enzymes or other proteins are immobilized.

Další navržený způsob imobilizace proteinů, například enzymů a protilátek podle vynálezu spočívá v tom, že se nosič obsahující hydroxylové, amino- neboósulfhydrylové skupiny aktivuje působením perfluorovaných olefinů, například perfluorpropenu, perfluorbutadienu, perfluorcyklobutadienu, popřípadě za přítomnosti fluoridu draselného. Na takto aktivovaný nosič se potom neváže bílkovina kovalentní vazbou prostřednictvím svých skupin schopných nuklsofilní adice na perfluorovaný olefin navázaný na nosič.Another proposed method of immobilizing proteins, for example enzymes and antibodies according to the invention consists in activating a carrier containing hydroxyl, amino or sulfhydryl groups by the action of perfluorinated olefins, for example perfluoropropene, perfluorobutadiene, perfluorocyclobutadiene, optionally in the presence of potassium fluoride. The protein is then covalently bound to the carrier thus activated through its groups capable of nucleophilic addition to the perfluorinated olefin bound to the carrier.

Výhoda způsobu imobilizace enzymů, protilátek a jiných bílkovin podle vynálezu spočívá především v pevnosti vytvořené kovalentní vazby a v možnosti imobilizace bílkovin na nosiče, které nevykazují výrazné sorpční vlastnosti, například na vnitřní stěnu skleněných kapilár nebo trubiček a podobně.The advantage of the method of immobilizing enzymes, antibodies and other proteins according to the invention lies primarily in the strength of the covalent bond formed and in the possibility of immobilizing proteins on carriers that do not exhibit significant sorption properties, for example on the inner wall of glass capillaries or tubes and the like.

Vynález je dokumentován příklady, aniž by se jimi omezoval.The invention is documented by examples without being limited thereto.

CS 269 750 81EN 269 750 81

Příklad 1Example 1

K 1 g porézního skla umístěného v skleněné ampuli byly přidány 3 ml nasyceného roztoku bezvodého fluoridu draselného v acetonu a po odplynění na vakuové lince bylo přidáno 0,44 g hexafluor-l,3-butadienu. Ampule byla zatavena a ponechána intenzívně třepat 50 h. Po otevření a odpaření nezreagovaného dienu bylo modifikované sklo zdekantováno v acetonu a zbytky acetonu byly odstraněny na vakuové odparce.To 1 g of porous glass placed in a glass ampoule were added 3 ml of a saturated solution of anhydrous potassium fluoride in acetone and after degassing on a vacuum line 0.44 g of hexafluoro-1,3-butadiene was added. The ampoule was sealed and left to shake vigorously for 50 h. After opening and evaporation of the unreacted diene, the modified glass was decanted in acetone and the acetone residues were removed on a vacuum evaporator.

K 200 mg aktivovaného porézního skla bylo přidáno 10 mg -chymotrypsinu v 5 ml 0.1 M Tris-HCl pufru pH 7,8 obsahujícím 60 % dimethylsulfoxidu. Po 16 h třepání při 4 °C byl konjugát s imobilizovaným -chymotripsinem odsát, promyt střídavě tímto pufrem a 1 M NaCl v tomtéž pufru. Získaný konjugát vykazoval aktivitu 1 ^ukat na 1 g vlhkého nosiče (jako substrát byl použit methylester N-acetyl-L-phenylalaninu).To 200 mg of activated porous glass was added 10 mg of -chymotrypsin in 5 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer pH 7.8 containing 60% dimethyl sulfoxide. After 16 h of shaking at 4 °C, the conjugate with immobilized -chymotrypsin was aspirated, washed alternately with this buffer and 1 M NaCl in the same buffer. The obtained conjugate showed an activity of 1 ^ukat per 1 g of wet carrier (N-acetyl-L-phenylalanine methyl ester was used as substrate).

**

Příklad 2Example 2

Směs 3,8 g polysacharidu Sephadexu §-200, 4 g perfluorcyklobutanu a 0,3 g fluoridu draselného v 8 ml absolutního acetonitrilu byla zpracována shodným postupem jako v příkladu 1.A mixture of 3.8 g of polysaccharide Sephadex §-200, 4 g of perfluorocyclobutane and 0.3 g of potassium fluoride in 8 ml of absolute acetonitrile was processed according to the same procedure as in Example 1.

K 200 mg aktivovaného nosiče v 5 ml 0.1 M fosfátovém pufru pH 7,2 bylo přidáno 10 mg glukosooxidasy a 5 yul katalasy a směs byla třepána 16 h při 4 °C. Potom byla směs zfiltrována. Získaný heterogenní biokatalyzátor po důkladném promytí střídavě 0.1 M fosfátovým pufrem pH 7,2 a 1 M NaCl v tcmto pufru vykazoval glukosooxidasovou aktivitu 0,341 yukat/l g vlhkého konjugátu.To 200 mg of activated carrier in 5 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.2 was added 10 mg of glucose oxidase and 5 μl of catalase and the mixture was shaken for 16 h at 4 °C. Then the mixture was filtered. The obtained heterogeneous biocatalyst after thorough washing alternately with 0.1 M phosphate buffer pH 7.2 and 1 M NaCl in this buffer showed a glucose oxidase activity of 0.341 μl/l g of wet conjugate.

Příklad 3Example 3

Směs 1 g glycidylmethakrylátového polymeru nodifikovaného 1,6-diaminohexanem a 0,6 g perfluorhexatrilenu v 3 ml absolutního acetonitrilu byla zpracována shodným způsobem jako v příkladu 1.A mixture of 1 g of glycidyl methacrylate polymer modified with 1,6-diaminohexane and 0.6 g of perfluorohexatrilene in 3 ml of absolute acetonitrile was treated in the same manner as in Example 1.

K 200 mg aktivovaného nosiče v 5 ml 0,1 M fosfátovém pufru pH 7,2 bylo přidáno 5 yul katalasy a směs byla třepána 16 h při 4 °C. Shodným postupem jako v příkladu 2 byl získán konjugát vykazující katalasovou aktivitu 5 /Ukat/g vlhkého nosiče.To 200 mg of activated carrier in 5 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.2 was added 5 µl of catalase and the mixture was shaken for 16 h at 4°C. By the same procedure as in Example 2, a conjugate was obtained showing a catalase activity of 5 µkat/g of wet carrier.

J Příklad 4Example 4

Vnitřní stěna skleněných trubiček, respektive kapilár byla aktivována protékajícím i roztokem 3-chlor-nonafluor-l,5-hexadienu v acetonu nasyceném bezvodým fluoridem draselným. Po promytí acetonem s 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,2 byla na vnitřní stěnu imobilizována glukosooxidasa protékající trubičkou, respektive kapilárou v koncentraci 400 mg enzymu v 10 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,2. Po promytí shodným pufrem byly trubičky, respektive kapiláry s navázanou glukosooxidasou použity pro stanovení glukosy ve formě průtokové reakční elektrody ve spojení s kyslíkovým článkem Clarkova typu.The inner wall of the glass tubes or capillaries was activated by a flowing solution of 3-chloro-nonafluoro-1,5-hexadiene in acetone saturated with anhydrous potassium fluoride. After washing with acetone with 0.1 M phosphate buffer pH 7.2, glucose oxidase was immobilized on the inner wall flowing through the tube or capillary at a concentration of 400 mg of enzyme in 10 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.2. After washing with the same buffer, the tubes or capillaries with bound glucose oxidase were used for the determination of glucose in the form of a flow reaction electrode in connection with a Clark-type oxygen cell.

Claims

A method for immobilizing proteins, for example enzymes and antibodies for the preparation of heterogeneous biocatalysts, immunochemical determinations and affinity chromatography on organic and inorganic carriers containing hydroxyl amino or sulfihydryl groups, characterized in that the carrier is activated by the action of a perfluorinated olefin, for example perfluoropropene or perfluorocyclobutane or a fluorinated diene or polyene, for example perfluoro-1,3-butadiene or perfluorohexatriene or 3-chloro-nonafluoro-1,5-hexadiene, optionally in the presence of potassium fluoride, and enzymes are added to the thus activated carrier,

CS 269 750 B1 antibodies or other proteins are immobilized by a covalent bond formed by nucleophilic addition of their groups, for example sulfhydryl or hydroxyl or amino groups, to a perfluorinated double bond present on the surface of the activated support.