CS270307B1 - Způsob enzymového stanovení močoviny - Google Patents

Abstract

Způsob stanovení, sestávající z hydrolýzy močoviny imobilizovanou ureasou a z kolorimetrického stanoveni uvolněného amoniaku průtokovou injekční analýzou, epočívé v tom, če ae do nosného proudu fosfátového pufru aplikuje vsorek obsahující močovinu, nosný proud ss uvsde do kontaktu s Imobilizovanou ureasou umístěnou pevně na nosiči v enzymovém reaktoru a po průchodu ss nosný proud s uvolněným amoniakem postupně smísí s činidlem 1, obsahujícím V o,l až o,5 M sallcylanu sodného, 1 až 8 mM nltroprualdu sodného, o,2 až o,3 M hydroxidu alkalického kovu a lo až 4o obj. % methanolu, g as činidlem II obsahujícím o,ol až o,5 M chlornártu alkalického kovu, načež ae aměa zahřeje η» teplotu 29 až 60 ĎC a fotometricky ae stanoví absorbance při 7oo yum, z níž lze stanovit množství močoviny v analyzovaném vzorku

Description

Vynález se týká způsobu enzymového stanovení močoviny.

V analytické chemii a zvláště pak v klinické biochemii se čím dál více uplatňují postupy založené na enzymové katalýze. Při stanovení močoviny se používá ureasy, tl· enzymu, který hydrolyžuje močovinu na amoniak a oxid uhličitý. Průběh této enzymové reakce Jo možno sledovat na základě tvorby těchto komponent, přičemž se dává přednost stanovení amoniaku, reap, amonných iontů. NeJrozěířeněJěí Je kolorimetrická Bertholotova metoda založená na oxldatlvní kopulaci amoniaku o fenoly po reakci s chlornanem v alkalickém prostředí* Vedle kolorimetrické detekce amoniaku nalezly široké uplatnění také elektrochemické metody, at*Již ve spojení se skleněnou pH elektrodou, elektrodou selektivní na amonné lonty nebo amonnou elektrodou se vzduchovou mezerou či mířením amoniaku v plynné formě.

Při enzymovém stanovení močoviny se s ohledem na rozdílnost podmínek enzymové hydrolýzy močoviny a následného stanovení vzniklého amoniaku velmi často od sebe tyto dva stupně oddělují. Z tohoto hlediska Je velmi atraktivní použití průtokové injekční analýzy. Při tomto postupu se analyzovaný vzorek aplikuje přímo do nosného média obsahujícího aktivní ureasu a vytvořený amoniak Je detašován některou z uvedených metodik. Z důvodu snížení spotřeby enzymu, a tím' 1 výrazného zefektivnění analytického postupu. Je mnohem výhodnější použití ureasy v Imobilizované formě, která se v podobě tzv, „enzymové reaktorové elektrody používá ve spojení s elektrochemickou detekcí vzniklých produktů za vlastním „reaktorem , tj· za kolonkou čl kapilárou s imoblllzovanou ureasou. V tomto uspořádání však není možno dosáhnout větší frekvence nástřiků než 2o za hodinu, poněvadž pro každou analýzu Je potřebná určitá doba k ustanovení rovnováhy elektrochemického detektoru. .

Uvedenou nevýhodu odstraňuje způsob enzymového stanovení močoviny analýzou, skládající se z hydrolýzy močoviny imoblllzovanou ureasou a z kolorimetrického stanovení uvolněného amonlaku průtokovou Injekční analýzou, vyznačený tím, že se do nosného proudu fosfátového pufru aplikuje vzorek obsahující močovinu, nosný proud se uvede do kontaktu a Imoblllzovanou ureasou umístěnou pevně na nosiči v enzymovém reaktoru a po průchodu se nosný proud s uvolněným amoniakem postupně smísí s činidlem i, obsahujícím o,l až o,5 M aallcylanu sodného, 1 až β mM nltroprusidu sodného, o,2 až o,3 M hydroxidu alkalického kovu a lo až 4o $4 obj, methanolu, a a činidlem II obsahujícím ο,οΐ až o,6 M chlornanu alkalického kovu, načež se směs zahřeje na teplotu 25 až 6o °C a fotometrlcky se stanoví absorbance při 7oo yum, z níž lze stanovit množství močoviny v analyzovaném vzorku.

Výhodou enzymového stanovení močoviny podle vynálezu Je především rychlost analýzy, kdy při průtoku kolem 1 ml/s nosného média jo možno provádět 6o analýz za hodinu s lineární odezvou pro koncentraci močoviny 25 až 5oo mmol.djn v nástřiku 4o až 9o yuL

Vynález Jo dokumentován příklady, aniž by se Jimi omezoval.

Příklad 1

Stanovení močoviny v krevním séru

Vzorky krevního séra byly řoděny vodou v poměru 1 i So a aplikovány bos doprotelnaco do nosného produ o,2 M fosfátového pufru pH 6,9 systému průtokové injekční analýzy. Po průchodu média s aplikovaným vzorkem enzymovým reaktorem obsahujícím Imoblllzovanou ureasu byla reakčnf směs se. vzniklým amoniakem smíchána s činidlem I, obsahujícím 0,37 M sallcylan sodný, 4 mM nitroprusid sodný, o,25 M hydroxid sodný a 3o obj. %ní methanol ve vodě, a potom s činidlem II, obsahujícím o,o3 M chlornan sodný.' Raakční směs potom byla průchodem přes reakční cívku zahřáta na 5o °C a množství vytvořeného barvlva byle proměřeno v průtokové kyvetě. Hodnota ab.orb.nc. při 7oo nrn je přímo úměrná množství močoviny obsažená v apllkovanám vxorku v rozsahu koncentrací 25 až 5oo yumol.dm^-^ pyj frekvenci 6o analýz za hodinu byla reprodukovalolnost stanovení močoviny charakterizována hodnotou relativní směrodatně odchylky 1,1 %.

CS 27o3o7 Bl

Příklad 2

Stanovení močoviny v moči

Způsobem shodným Jako v příkladu 1 až na to, že činidlo II obsahovala o,o3 M chlornanu draselného, bylo prováděno stanovení obsahu močoviny ve vzorcích moči zředěných vodou 1 s 1 ooo až 1 t 2 ooo se «stejnou frekvencí nástřiků. Interferující obsah amonných lontů ve vzorcích moči byl odečten na základě shodného stanovení, aniž byl vzorek podroben účinku imobllizované ureasy v enzymovém reaktoru.

Claims (1)

1. Způsob enzymového stanovení močoviny analýzou, skládající se z hydrolýzy močoviny imobilizovanou ureasou a z kolorimetrického stanovaní uvolněného amoniaku průtokovou Injekční analýzou, vyznačený tím, že se do nosného'proudu fosfátového pufru aplikuje vzorek obsahující močovinu, nosný proud se uvede do kontaktu s imoblllzovanou ureasou umístěnou pevně na nosiči v enzymovém reaktoru a po průchodu se nosný proud a uvolněným amoniakem postupně smísí s činidlem I, obsahujícím o,l až o,5 M sallcylanu sodného, 1 až β mM nitroprusidu sodného, o,2 až o,3 M hydroxidu alkalického kovu a lo až 4o obj. % methanolu, a s činidlem Π obsahujícím o,ol až o,5 M chlornanu alkalického kovu, načež se směs zahřeje na teplotu 25 až 6o °C a fotometricky se stanoví absorbance při 7oo yum, z níž lze etanovit množství močoviny v analyzovaném vzorku.