CS271593B1

CS271593B1 - Method of mammals' embryos cryopreservation

Info

Publication number: CS271593B1
Application number: CS885758A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Ing Csc Landa; Pavel Ing Csc Liehman; Olga Tepla
Original assignee: Vladimir Ing Csc Landa; Pavel Ing Csc Liehman; Olga Tepla
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1990-10-12
Also published as: CS575888A1

Abstract

The solution concerns a method of cryoconservation of mammal embryos and of products of microsurgical and genetic manipulations at embryonic level by direct instilment into liquid nitrogen, which is possible thanks to the dehydration of embryos before refrigeration by a short-term stay in an equilibration and then in a vitrification medium. In the vitrification medium, the embryos and products of various types of manipulations are instilled into liquid nitrogen. The micro-drops with frozen embryos of volume of 5 to 20 μl are stored according to current needs. The embryos are defrosted by transferring the droplets with embryos from the liquid nitrogen to the droplet of manipulation medium with 0.5 to 1.0 M saccharose solution. After dissolution of the droplet, the embryos are transferred for 3 to 10 minutes to a new droplet of a medium with saccharose and then are washed in manipulation or cultivation medium and prepared for further use.

Description

Vynález se týká způsobu kryokonzervace embryí savců a různých produktů mikrochirurgických a genetických manipulací (PMGM) na embryích jejich přímým nakapáním do kapalného dusíku.The invention relates to a method for cryopreservation of mammalian embryos and various products of microsurgical and genetic manipulation (PMGM) on embryos by direct dropping them into liquid nitrogen.

Techniky v oblasti řízené reprodukce a experimentální embryologie umožňují získávat preimplantační embrya od všech běžně využívaných laboratorních a hospodářsky významných* savců, řady zoofonních eavců a člověka a současně řeší práci se získanými embryi mimo mateřský organismus (např. izolaci z výplachu, selekci různého typu, mikrochirurgické a genetické zásahy do embryí na buněčné (subbuněčné) genové úrovni a jiné) se zachováním možnosti přenést tato embrya do vhodných příjemců, a umožnit tak dokončení započatého vývoje. Řízené hormonální stimulace ovariálních cyklů umožňují získávat 2 až 20krát více embryí než ve spontánních cyklech, což umožňuje rozsáhlejší využití genetického a reprodukčního potenciálu vybraných samic. Zcela nové možnosti pro celou uvedenou oblast představuje úspěšné zmrazení a uložení intaktních nebo geneticky manipulovaných savčích embryí v bankách. Reverzibilní zastavení vývoje představuje jedinečné možnosti nejen pro základní a aplikovaný výzkum, ale nachází rozsáhlé uplatnění v zemědělské praxi, jako jsou např. banky genofondu, efektivní využití vybraných zvířat, transport zmrazených embryí místo živých zvířat, řízené zásahy do genetické výbavy jedinců.Controlled reproductive and experimental embryology techniques allow pre-implantation embryos to be obtained from all commonly used laboratory and economically important mammals, a number of zoophones and humans, while addressing the work with acquired embryos outside the parent organism (eg, lavage isolation, different type selection, microsurgical and genetic interventions in embryos at the cellular (subcellular) gene level and others), while maintaining the possibility of transferring these embryos to appropriate recipients, thus allowing the completion of the development that has begun. Controlled hormonal stimulation of the ovarian cycles allows to obtain 2 to 20 times more embryos than in spontaneous cycles, allowing greater use of the genetic and reproductive potential of selected females. Successful freezing and storage of intact or genetically manipulated mammalian embryos in banks is a whole new possibility for the whole area. Reversible cessation of development is a unique opportunity not only for basic and applied research, but also finds widespread use in agricultural practice, such as gene pool banks, efficient use of selected animals, transport of frozen embryos instead of live animals, controlled interventions in individual genetic equipment.

Techniky umožňující úspěšnou kryokonzervaci embryí se značně liší v principech i v jednotlivých částech vlastních technik: tj. v přípravě embryí před zmrazením, v cyklu zmrazení - uchování - rozmražení a ve způsobu ošetření embryí po rozmražení (Heytnan et al., Contracept-Fertil-Sex 15: 579, 1987; Kaseip et al., Ann Med. Vet 131: 515, 1987; Mobraaten, J In Vitro Fert Emryo Transfer 3: 28, 1986; Petters et al., Theriogenology 27: 507, 1987; Prather et al., Theriogenology 28: 195, 1987; Rall et al., J Reprod Fertil 70: 293, 1984; SchieWe et al., Cryobiology 24: 238, 1987; Takeda et al., Theriogenology 27: 285, 1987; Trounson et al., Fertil Steril 48: 843, 1987; Yoahiki et al., Exp Anim (Tokyo) 36: 379, 1987). NejrozSířenější jsou techniky založené na částečné dehydrataci embryí pomocí pomalého zmrazování rychlostí 0,2 až 0,5 °C za minutu, při indukci tvorby ledu v extracelulárním médiu v teplotě kolem -7 °C do teplot nižších než -25 °C, nejčastěji -30 až -40 °C, přenesení embryí z těchto teplot do kapalného dusíku a jejich uchování v tomto prostředí a na rychlém rozmražení 200 až 2 000 °C za minutu, které zabraňuje rekrystalizaci intraceluldrně zmrzlé vody a tím i zničení nebo poškození embryí. Příprava embryí ke zmrazení je založená na jedno nebo vícestupňovém, nejčastěji 2 až 3 stupňovém přidání kryoprotektivní látky, např. dimethylsulfoxid, glycerol, propandiol, do zmrazovacího média a ekvilibraci embryí ve finální koncentraci kryoprotektiva, nejčastěji 1 až 2 molární po dobu 10 až 20 minut. Ošetření po rozmražení je založeno na postupném snížení koncentrace kryoprotektiva nejčastěji ve 2 až 6 krocích, v rozmezí 10 až 15 minut; v poslední době je úspěšně využíváno jednostupňové vymytí kryoprotektiv přenesením embryí do roztoku 0,5 až 1,5 M sacharozy po dobu 10 až 20 minut před promytím v manipulačním médiu. Ve všech používaných postupech jsou embrya zmrazována v různých typech obalů, např. plastikové dutinky různých typů, nádobky pro konzervaci buněk a tkání v kapalném dusíku, skleněné dutinky a atnpule.Techniques for successful cryopreservation of embryos vary widely in principles and in individual parts of the techniques themselves: ie, pre-freezing, embryo-preservation-thawing, and post-thaw embryo treatments (Heytnan et al., Contracept-Fertil-Sex 15: 579, 1987; Kaseip et al., Ann Med. Vet 131: 515, 1987; Mobraaten, J. In Vitro Fert Emryo Transfer 3: 28, 1986; Petters et al., Theriogenology 27: 507, 1987; Prather et al. Rall et al., J. Reprod Fertil 70: 293, 1984; SchieWe et al., Cryobiology 24: 238, 1987; Takeda et al., Theriogenology 27: 285, 1987; Trounson et al. , Fertil Steril 48: 843,1987; Yoahiki et al., Exp Anim (Tokyo) 36: 379,1987. The most widespread are techniques based on partial dehydration of embryos by slow freezing at 0.2 to 0.5 ° C per minute, inducing ice formation in extracellular medium at temperatures around -7 ° C to temperatures below -25 ° C, most commonly -30 up to -40 ° C, transferring the embryos from these temperatures to liquid nitrogen and storing them in this environment, and thawing rapidly at 200 to 2000 ° C per minute, which prevents recrystallization of the intracellularly frozen water and thereby destruction or damage of the embryos. The preparation of embryos for freezing is based on one or more stages, most often 2-3 steps, of adding a cryoprotective agent, eg dimethylsulfoxide, glycerol, propanediol, to the freezing medium and equilibrating the embryos at the final cryoprotectant concentration, usually 1 to 2 molar for 10 to 20 minutes . The treatment after thawing is based on a gradual decrease in cryoprotectant concentration, most often in 2 to 6 steps, in the range of 10 to 15 minutes; Recently, one-step cryoprotective washout has been successfully employed by transferring embryos into a solution of 0.5-1.5 M sucrose for 10-20 minutes prior to washing in handling medium. In all methods used, embryos are frozen in various types of containers, eg plastic tubes of different types, containers for preserving cells and tissues in liquid nitrogen, glass tubes and atpulps.

Zásadní nevýhodou uvedených technik je nutnost používat nákladná programovatelná zařízení. Mezi další nevýhody patří časová náročnost např. příprava a zmrazení trvá 1 až 3 hodiny, pracnost podmíněná mnohonásobnou manipulaci 8 embryi, prodloužený pobyt embryí v nepříznivých podmínkách a nutnost dovážet vhodné obaly ke zmrazování. Uvedené techniky nezaručují vyšěí než 80 % viabilitu rozmražených embryí.A major disadvantage of these techniques is the need to use expensive programmable devices. Other disadvantages include time-consuming eg preparation and freezing takes 1 to 3 hours, labor intensity due to multiple manipulation of 8 embryos, prolonged stay of embryos in unfavorable conditions and necessity to import suitable containers for freezing. These techniques do not guarantee greater than 80% viability of thawed embryos.

V posledních letech se rozvíjejí kryokonzervační techniky založené na přímém ponoření obalů obsahujících embrya, např. různé typy dutinek z plastu, do kapalného duCS 271593 Bl siku (Bielanski, Cryo-Lettere 8: 293, 1987; Friedler et al. Fertil Steril 48: 306, 1987; Hsu et al. Jpn J Anim Reprod 32: 106, 1986; Massip et al. Cryo-Letters 7: 270, 1986; Massip et al. Theriogenology 27: 69, 1987; Miyamoto and iBhibashi, J Reprod Fertil 78; 471, 1986; Rall Cryobiology 23: 548, 1986; Rall and Fahy, Nátuře 313: 575, 1985; Scheffen et al, Cryo-Lettera 7; 260, 1986; Szell and Schelton, J Reprod Fertil 78: 699, 1986). Při použití těchto technik je předpokladem úspěšné kryokonzervacc vysoký stupeň dehydratace embryí již před začátkem zmruzování. Potřebného stupně dehydratace je dosahováno především převedením embryí do zařazovacích vitrifikačních médií s vysokou koncentrací jedné kryoprotektivní látky, např. 30 až 50 % roztoku glycerolu nebo 30 až 40 % roztoku dimethylsulfoxidu, nebo několika kryoprotektivních látek, např. 25 % roztok glycerolu a 25 % roztok propandiolu nebo 20 % roztok dimethylsulfoxidu, 15 % roztok acetamidu, 10 % roztok propylenglykolu a 6 % polyethylenglykolu. Vitrifikační média odnímají embryím vodu a zabraňují tvorbě intracelulárního ledu. Embrya zmrazená vitrifikačními technikami vyžadují rozmražení rychlostí 500 až 2000 °C za minutu. Příprava embryí před zmrazením probíhá při teplotě kolem 0 °C a představuje jedno nebo dvoustupňové přidání kryoprotektivních látek. Po rozmražení jsou kryoprotektivní látky odstraňovány jedno- nebo dvoustpňovým použitím manipulačního média s 0,5 až 1,0 M roztokem sacharózy. Ve většině případů byla embrya zmrazována v plastikových dutinkách o obsahu 0,25 ml, které jsou ve většině států používány ke zařazování ineeminačních dávek u skotu. Dutinky jsou plněny tak, že kapka vitrifikačního média s embryi je od vymývacího média se sacharozou oddělena vzduchovou bublinkou. Po rozmražení je nutné obě média protřepáním spojit & umožnit tak vymytí kryoprotektiv. Přes značné zjednodušení zůstává použití této techniky omezeno na dvoubuněčná a osmibuněčná embrya, moruly a blastocysty myší a na moruly skotu. Viabilita rozmražených embryí myší se pohybuje v rozmezí 70 až 80 % a viabilita embryí skotu nepřesahuje 50 %.In recent years, cryopreservation techniques have been developed based on the direct immersion of embryo-containing containers, such as various types of plastic tubes, into liquid duCS 271593 B1 siku (Bielanski, Cryo-Lettere 8: 293, 1987; Friedler et al. Fertil Steril 48: 306) 1987, Hsu et al., Jpn J Anim Reprod 32: 106, 1986; Massip et al. Cryo-Letters 7: 270, 1986; Massip et al. Theriogenology 27: 69, 1987; Miyamoto and iBhibashi, J Reprod Fertil 78; 471, 1986; Rall Cryobiology 23: 548, 1986; Rall and Fahy, Nature 313: 575, 1985; Scheffen et al., Cryo-Letter 7; 260, 1986; Szell and Schelton, J Reprod Fertil 78: 699, 1986). Using these techniques, a prerequisite for successful cryopreservation is a high degree of embryo dehydration even before the commencement of compaction. The necessary degree of dehydration is achieved primarily by transferring embryos into inclusion vitrification media with a high concentration of one cryoprotective agent, eg 30-50% glycerol solution or 30-40% dimethylsulfoxide solution, or several cryoprotectants, eg 25% glycerol solution and 25% solution propanediol or 20% dimethylsulfoxide solution, 15% acetamide solution, 10% propylene glycol solution and 6% polyethylene glycol. Vitrification media remove water from embryos and prevent the formation of intracellular ice. Embryos frozen by vitrification techniques require thawing at a rate of 500 to 2000 ° C per minute. The preparation of the embryos prior to freezing takes place at a temperature of about 0 ° C and represents a one or two-step addition of cryoprotectants. After thawing, cryoprotectants are removed by one or two steps using a 0.5-1.0 M sucrose solution handling medium. In most cases, the embryos were frozen in 0.25 ml plastic tubes, which are used in most countries to classify ineemination doses in cattle. The tubes are filled so that a drop of vitrification medium with embryos is separated from the sucrose wash medium by an air bubble. After thawing, the two media must be shaken together to allow the cryoprotectants to wash out. Despite considerable simplification, the use of this technique remains limited to two-cell and eight-cell embryos, mouse mules and blastocysts, and bovine mules. The viability of thawed mouse embryos ranges from 70 to 80% and the viability of bovine embryos does not exceed 50%.

Nevýhodou dosavadních vitrifikáČních technik je toxicita používaných vitrifikačních médií vyžadující přidávání kryoprotektiv při teplotách kolem 0 °C, realtivně nízká viabilita embryí po rozmražení, možnost úspěšného použití pouze u některých vývojových stádií a druhů, např. myší, skotu a používání dovážených dutinek a jejich komplikované plnění.The disadvantages of existing vitrification techniques are the toxicity of the used vitrification media requiring the addition of cryoprotectants at temperatures around 0 ° C, the relatively low viability of the embryos after thawing, the possibility of successful use only in certain developmental stages and species such as mice, cattle and imported tubes and their complicated filling .

Nevýhody dosud používaných technik kryokonzervace odstraňuje způsob kryokonzervace podle vynálezu spočívající v tom, že embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací se z manipulačního média nejméně na 2 minuty přenesou do ekvilibračního média, obsahujícího 5 až 30 % obj. glycerolu, z tohoto média se přenesou na 15 až 60 sekund do vitrifikačního média, potom se β 5 až 20 ^ul vitrifikačního média nasají do kalibrované kapiláry pro manipulaci s embryi, nakápnou do nádoby naplněné kapalným dusíkem a v transparentních kapkách vzniklých tímto způsobem jsou embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací uchovávány v kapalném dusíku, ze kterého se před použitím kapky vyjmou a přenesou do vymývacího média obsahujícího 0,2 až 1,0 M roztok sacharózy, načež po roztátí kapek se embrya a produkty mikromanipulací a genetických manipulací přenesou na 3 až 10 minut do čerstvé kapky stejného média, potom se propláchnou v médiu bez sacharózy a připraví к dalšímu použití.Disadvantages of the cryopreservation techniques used hitherto are eliminated by the method of cryopreservation according to the invention, in which embryos and products of micromanipulation and genetic manipulation are transferred from the handling medium for at least 2 minutes to an equilibration medium containing 5 to 30% by volume of glycerol, 15 to 60 seconds into the vitrification medium, then β 5 to 20 µl of the vitrification medium is aspirated into a calibrated capillary for handling embryos, dropped into a container filled with liquid nitrogen and embryos and micromanipulation and genetic manipulation products are stored in liquid nitrogen from which the droplets are removed and transferred to a wash medium containing 0.2 to 1.0 M sucrose solution prior to use, after which the embryos and micromanipulation and genetic manipulation products are transferred to a fresh drop of the same medium for 3 to 10 minutes after thawing the droplets ia, then rinsed in a sucrose-free medium and prepared for reuse.

Produkty mikromanipulací a genetických manipulací (dále jen PMGM) jsou nakapány v mikrokapkách nejlépe 5 až 20 yul vitrifikačního média přímo do kapalného dusíku. Postup zmrazování je následující:The products of micromanipulation and genetic manipulation (hereinafter referred to as PMGM) are dropped in microdroplets, preferably 5 to 20 µl of vitrification medium directly into liquid nitrogen. The freezing procedure is as follows:

1) intaktní embrya a R4GM jsou z manipulačního média přenesena na 2 až 10 minut do kapky ekvilibraČního média s obsahem 5 až 30 nejlépe 10 % obj. glycerolu. Jako manipulační a ekvilibrační médium může být použito jakékoliv médium běžně používané pro práci se savčími embryi.1) intact embryos and R4GM are transferred from the handling medium for 2 to 10 minutes to a drop of equilibration medium containing 5 to 30, preferably 10% by volume glycerol. Any medium commonly used to work with mammalian embryos may be used as the handling and equilibration medium.

CS 271593 BlCS 271593 Bl

Doba pobytu v ekvilibračním médiu by neměla být kratší než 2 minuty _t prodloužený pobyt v ekvilibračním médiu do 30 minut nemá vliv na výsledky zmrazování.The residence time in the equilibration medium should not be less than 2 minutes _t extended stay in the equilibration medium up to 30 minutes does not affect the freezing results.

2) V minimálním množství ekvilibračního média jsou embrya a PMGM přenesena na 15 až 60 sekund do kapky vitrifikačního média připraveného z 15 až 35, nejlépa 30 % obj. glycerolu, 25 až 60 %, nejlépe 50 % obj. 2 M roztoku sacharozy v redestilované vodě a až do 40 %, nejlépe 20 % obj. krevního séra, s výhodou telecího či hovězího. Patnáctisekundový pobyt ve vitrifikačním médiu zajišťuje dostatečnou dehydrataci umožňující úspěšné zmrazení. Delší pobyt ve vitrifikačním médiu než 2 minuty tnůže negativně ovlivnit výsledek zmrazování.2) In a minimum amount of equilibration medium, embryos and PMGM are transferred for 15 to 60 seconds into a drop of vitrification medium prepared from 15 to 35, preferably 30% by volume glycerol, 25 to 60%, preferably 50% by volume 2M sucrose solution in redistilled water and up to 40%, preferably 20% by volume of blood serum, preferably veal or beef. A 15-second stay in the vitrification medium ensures sufficient dehydration to allow successful freezing. A longer stay in the vitrification medium than 2 minutes may negatively affect the freezing result.

3) Do kalibrované kapiláry je nataženo poloviční množství, tj. 5 až 20 ^ul vitrifikačního média a druhá polovina je natažena do kapiláry epolu ee zmrazovanýtni embryi. Médium z kapiláry je nakápnuto z výšky nejlépe 5 až 7 cm dc Petriho miaky o průměru 60 mm nebo jiné vhodné nádoby naplněné kapalným dusíkem. Manipulační kapiláry lze vytáhnout ze skleněných trubiček o průměru 1 mm a opatřit je tlačkumi z plastikových hadiček odpovídajících rozměrů. Kapiláry jsou kalibrovány tak, aby po vytlačení média z kapiláry došlo к oddělení kapky bez zbytku média v kapiláře a bez kóntaminace kapky vzduchovými bublinkami. Nejvýhodnější se ukázaly kapky o objemu 10 /Ul.3) Half of the calibrated capillary is withdrawn, i.e. 5 to 20 µl of the vitrification medium, and the other half is stretched into the capillary of the epole and the frozen embryo. The capillary medium is dropped from a height of preferably 5 to 7 cm dc of a 60 mm diameter petri dish or other suitable container filled with liquid nitrogen. Handling capillaries can be pulled out of 1 mm diameter glass tubes and provided with punches from plastic tubing of the appropriate size. The capillaries are calibrated so that, after the medium is expelled from the capillary, the droplet separates without the remainder of the medium in the capillary and without the air-bubble contamination of the drop. The 10 µl droplets proved to be the most advantageous.

4) Takto vzniklé transparentní kapky obsahující embrya jsou pomocí pinzety zchlazené v kapalném dusíku přeneseny do označených nádob, ve kterých jsou uchovávány. Během uchovávání a jakékoliv manipulace jsou kapky udržovány v kapalném dusíku.4) The resulting transparent droplets containing the embryos are transferred by means of tweezers cooled in liquid nitrogen to the labeled containers in which they are stored. During storage and any handling, the drops are kept in liquid nitrogen.

5) Kapky určené к rozmražení jsou zchlazenou pinzetou vyjmuty z kapalného dusíku a vloženy do vymývacího média s obsahem 0,2 až 1,0 nejlépe 0,5 M roztoku sacharozy. Po rozehřátí kapky jsou embrya přenesena do nové kapky média se stejnou koncentrací sacharozy a po 3 až 10 minutách jsou embrya nebo B4GM přenesena do média bez sacharozy, promyta a připravena к dalšímu použití, např. pro přenos do recipientu, kultivace in vitro atd. Příprava embryí a PMGM před zmrazováním a vymytí kryoprotektiv po rozmražení probíhalo při teplotě 20 °C.5) The drops to be thawed are removed from the liquid nitrogen with cooled tweezers and placed in a washing medium containing 0.2 to 1.0 preferably 0.5 M sucrose solution. After heating the drop, the embryos are transferred to a new drop of medium with the same sucrose concentration, and after 3 to 10 minutes, the embryos or B4GM are transferred to sucrose-free medium, washed and ready for further use, eg for transfer to recipient, in vitro culture etc. embryos and PMGM before freezing and washing of cryoprotectants after thawing was performed at 20 ° C.

Způsob kryokonzervace podle vynálezu je ze všech používaných způsobů kryokonzervace nejrychlejší, nejjednoduší a ekonomicky nejvýhodnější. Další zjednodušení uvedeného kryokonzervačního postupu mohou být pouze nevýznamného charakteru, bez většího praktického významu. Uvedený způsob kryokonzervace umožňuje opakovaně dosahovat 90 % a vyšší životaschopnosti embryí a TMGM po ukončení uchovávání v kapalném dusíku, což představuje maximální hranici v oblasti kryokonzervace. Použitelnost uvedeného kryokonzervačního způsobu pro embrya různých druhů bhvců, pro různá vývojová stadia, pro intaktní embrya i embrya zbavené ochranných obalů, tzv. zóny pellucidy, pro produkty různých typů mikrochirurgických a genetických manipulací a pro různé typy embryonálních buněk dokumentuje univerzálnost navrženého způsobu kry ок onzervac e.The cryopreservation method of the invention is the fastest, simplest and most economically advantageous of all cryopreservation methods used. Further simplifications of the cryopreservation procedure can be of only minor importance, without much practical significance. Said cryopreservation method makes it possible to repeatedly achieve 90% and higher viability of embryos and TMGM after storage in liquid nitrogen, which is the maximum limit in the cryopreservation area. The applicability of this cryopreservation method to embryos of different species of caddisflies, to different stages of development, to intact embryos and depleted embryos, the so-called pellucid zones, to products of various types of microsurgical and genetic manipulations and to different types of embryonic cells E.

Použití tohoto způsobu je doloženo následujícími příklady.The use of this method is illustrated by the following examples.

Příklad 1Example 1

Z 200 osmibuněčných embryí získaných od hybridních myší a kryokonzervováných přímým nakapáním do kapalného duaíku po 2 až 3 minutách v ekvilibračním médiu ve skupinách po 3 až 5, ve vitrifikačním médiu o složení 30 % obj. glycerolu, 50 % obj. 2 M roztoku sacharozy v redestilované vodě a 20 % obj. hovězího krevního séra, bylo po rozmražení získáno 194 (97 %) životaschopných embryí. Dosažené výsledky charakterizované vysokou opakovatelností a úrovní přežívání představují maximum dosažitelné při konzervaci embrií dokumentují vhodnost použitého kryokonzervačního způsobu a délky pobytu v ekvilibračním médiu.Of the 200 eight-cell embryos obtained from hybrid mice and cryopreserved by direct dripping into liquid rainbow after 2-3 minutes in equilibration medium in groups of 3-5, in vitrification medium of 30% by volume glycerol, 50% by volume 2M sucrose solution in redistilled water and 20% bovine serum by volume, 194 (97%) viable embryos were obtained after thawing. The results, characterized by high repeatability and survival levels, represent the maximum achievable in embryo conservation, demonstrating the suitability of the cryopreservation method used and the length of stay in the equilibration medium.

CS 271593 BlCS 271593 Bl

Příklad 2Example 2

Z 300 osmi až šestináctibuněčných embryí získaných od šesti vybraných inbredních myších kmenů a kryokonzervovaných po 10 minutách v ekvilibračním médiu přímým nakapáním do kapalného dusíku ve skupinách po 3 až 5> ve vitrifikačním médiu uvedeném v příkladu 1, bylo po rozmražení získáno 282 (94 %) životaschopných embryí. Dosažené vysoká opakovatelnost a maximální úroveň přežívání embryí dokumentují použitelnost způsobu kryokonzervace podle vynálezu, používajícího prodloužený pobyt v ekvilibračním médiu pro geneticky různorodá embrya.Of the 300 eight to sixteen cell embryos obtained from six selected inbred mouse strains and cryopreserved after 10 minutes in equilibration medium by direct dripping into liquid nitrogen in groups of 3-5 in the vitrification medium shown in Example 1, 282 (94%) was obtained after thawing. viable embryos. The high repeatability and maximum level of embryo survival achieved illustrates the applicability of the cryopreservation method of the invention using extended residence in equilibration media for genetically diverse embryos.

Příklad 3Example 3

Ze 100 osmibuněčných embryí zbavených nebuněčných obalů a kryokonzervovaných přímým nakapáním do kapalného dusíku po 30 sekundách ve vitrifikačním médiu, uvedeném v příkladu 1, bylo po rozmražení získáno 93 (93 %) intaktních a životaschopných embryí. Výsledky dokumentují možnost kryokonzervace embryí a produktů manipulací zbavených nebuněčných obalů způsobem podle vynálezu při využití zkráceného pobytu ve vitrifikačním médiu, přičemž viabilita vysoko přesahuje všechny dosud dosahované výsledky kryokonzervace embryí bez nebuněčných obalů.Of the 100 eight-cell embryos deprived of non-cellular shells and cryopreserved by direct dripping into liquid nitrogen after 30 seconds in the vitrification medium of Example 1, 93 (93%) of intact and viable embryos were obtained after thawing. The results illustrate the possibility of cryopreservation of embryos and products by manipulating the depleted non-cellular packaging by the method of the invention using a shortened stay in the vitrification medium, the viability far exceeds all achieved results of cryopreservation of embryos without cellular packaging.

Příklad 4Example 4

Viabilita myších čtyř a SeetináctibunČčných embryí, morul a blastocyst kryokonzervovaných přímým nakapáním do kapalného dusíku, ve vitrifikačním médiu obsahujícím 20. % obj. glycerolu, 76 % obj. 2 M roztoku sacharozy v redestilované vodě a 4 % obj. telecího krevního séra, dosahovala po rozmražení a vymytí v médiu s 1,0 M roztokem sacharozy 90 až 94 Výsledky dokumentují účinnost kryokonzervačního způsobu podle vynálezu, včetně možnosti využití vyšší koncentrace sacharozy při vymývání kryoprotektivní látky pro kryokonzervaci různých vývojových stádií.The viability of mouse four and seven-cell embryos, morules and blastocysts cryopreserved by direct dripping into liquid nitrogen, in vitrification medium containing 20% by volume glycerol, 76% by volume of 2M sucrose in redistilled water and 4% by volume of calf blood serum, thawing and washing in 1.0 M sucrose 90-94 medium The results document the efficacy of the cryopreservation method of the invention, including the possibility of utilizing a higher sucrose concentration in eluting the cryoprotective agent for cryopreservation of various developmental stages.

Příklad 5Example 5

Embrya myší vystavená různým typům manipulací - mikrochirurgické enukleaci, elektrofuzi blastomer embryí, mikroinjekcím do cytoplasty nebo játra, reagregaci na blastomer při konstrukci chimér a pertenogenetické aktivaci a kryokonzervována přímým nakapáním v 10 ^ul kapkách do kapalného dusíku po 2 až 3 minutách v ekvilibračním médiu a po 60 sekundách ve vitrifikačním médiu, uvedeném v příkladu 1, byla po rozmražení životaschopná a viabilita takto ošetřených a kryokonzervovaných embryí se pohybovala mezi 70 až 90 %. Výsledky dokumentují použitelnost způsobu kryokonzervace podle vynálezu pro různé typy mikrochirurgicky a geneticky manipulovaných embryí.Embryos of mice subjected to various types of manipulations - microsurgical enucleation, embryo blastomer electrofusion, cytoplastic or liver microinjection, blastomer re-aggregation in chimera construction and pertenogenetic activation, and cryopreserved by direct dripping in 10 µl drops in liquid nitrogen and 2-3 µl in liquid nitrogen for 2 to 3 minutes after 60 seconds in the vitrification medium shown in Example 1, it was viable after thawing and the viability of the treated and cryopreserved embryos ranged between 70-90%. The results document the applicability of the cryopreservation method of the invention to various types of microsurgical and genetically manipulated embryos.

Příklad 6Example 6

Embrya krys ve stadiu Čtyř a šestnáctibuněk a blastocysty a embrya skotu ve stádiu moruly a blastocysty kryokonzervovaná přímým ponořením do kapalného dusíku po 10 minutách v ekvilibračním médiu, uvedeném v příkladu 1 ve skupinách 1 až 2, byla po rozmražení životaschopná. Viabilita embryí krys dosahovala 70 až 90 % a embryí skotu 75 až 85 %. Výsledky dokumentují možnost použití způsobu kryokonzervace podle vynálezu pro různá vývojová stadia embryí různých druhů savců.Stage 4 and 16-cell rat embryos and blastocysts and bovine embryos of the morula and blastocysts cryopreserved by direct immersion in liquid nitrogen after 10 minutes in the equilibration medium shown in groups 1 to 2 of Example 1 were viable after thawing. The viability of the rat embryos was 70-90% and the bovine embryos 75-85%. The results illustrate the possibility of using the cryopreservation method of the invention for different stages of development of embryos of different mammalian species.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Method for cryopreservation of mammalian embryos, characterized in that embryos and micromanipulary and genetic manipulation products are transferred from the handling medium for at least 2 minutes to an equilibration medium containing 5 to 3% by volume of glycerol, from this medium to 15 to 60 seconds into the vitrification medium, then in 5 to 20 / U1 of the vitrification medium, they are aspirated into a calibrated capillary for handling the embryos, dropped into a container filled with liquid nitrogen, and in transparent drops resulting therefrom the embryos and micromanipulation and genetic manipulation products are stored in liquid nitrogen. which are removed before use and transferred to a wash medium containing a 0.2 to 1.0 M saoharose solution, after which the embryos and the products of micromanipulation and genetic manipulation are thawed into a fresh drop of the same medium for 3 to 10 minutes, after which rinse in saoharose-free and prep-free media known for reuse ·

2. The cryopreservation method according to claim 1, wherein the vitrification medium comprises 15 to 35 vol% glycerol, 25 to 80 vol% 2M sucrose solution in redistilled water and up to 40 vol% blood serum, e.g. or beef ·