CS272329B1

CS272329B1 - Enzyme reactor for urea determination

Info

Publication number: CS272329B1
Application number: CS88439A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Doc Ing Csc Marek; Olga Rndr Csc Valentova; Petr Rndr Csc Solich
Original assignee: Marek Miroslav; Olga Rndr Csc Valentova; Solich Petr
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1991-01-15
Also published as: CS43988A1

Abstract

Enzymový reaktor Ja tvořan trubičkou nebo hadičkou, v níž je na částice porézního skla potaženého polyglycidylmethakrylátovým gólem imobilizovana ureasa kovalontní vazbou po přímé ohomioké reekol onzymu o reaktivními epnxyskupinaml polymeru,The enzyme reactor is formed by a tube or hose in which urease is immobilized on porous glass particles coated with polyglycidyl methacrylate gel by covalent bonding after direct reaction of the enzyme with reactive epoxy groups of the polymer,

Description

Vynález se týká enzymového reaktoru pro stanovení močoviny na bázi imobilizované ureasy.The invention relates to an enzyme reactor for the determination of urea based on immobilized urease.

Velké možnosti využití enzymů v analytické chemii jsou dány vysokou substrátovou a účinkovou specifitou enzymů a dále jejich schopností katalyzovat reakce při velmi nízkých koncentracích substrátů. Širšímu·uplatnění enzymových metod v běžné analytické praxi však do značné míry brání poměrně vysoká cena enzymů, a tím i enzymových stanovení. Tento problém je postupně řešen náhradou rozpustných enzymů imobilizovanými enzymy použitelnými pro velký počet analys.The great possibilities of using enzymes in analytical chemistry are given by the high substrate and effect specificity of enzymes and also by their ability to catalyze reactions at very low concentrations of substrates. However, the wider application of enzyme methods in common analytical practice is to a large extent hindered by the relatively high cost of enzymes, and thus of enzyme determinations. This problem is gradually solved by replacing soluble enzymes with immobilized enzymes useful for a large number of assays.

Vedle přesnosti a citlivosti jsou v mnoha oblastech analytické chemie, zvláště potom v klinické diagnostice, kladeny velké požadavky na rychlost analysy automatizace. Z tohoto hlediska je velmi atraktivní poměrně nová metoda průtokové injekční analysy. Tento analytický postup ve spojení s enzymovou katalysou umožňuje oddělit vlastní enzymovou reakci uskutečňovanou pomocí heterogenního biokatalyzátoru a následnou detekci vzniklých reakč- * nich produktů at již na bázi kolorimetrického elektrochemického nebo jiného způsobu stanovení. V tomto uspořádání je možno provádět diagnosticky velmi důležitá stanovení močoviny ve fyziologických tekutinách. Stanovení je založeno na rozkladu močoviny pomocí imobilizované ureasy a na následné detekci vzniklého amoniaku elektrochemicky pomocí skleněné pH elektrody selektivní na NH* inoty nebo jiné amonné elektrody.In addition to accuracy and sensitivity, many areas of analytical chemistry, especially in clinical diagnostics, place great demands on the speed of automation analysis. From this point of view, a relatively new method of flow injection analysis is very attractive. This analytical procedure in conjunction with enzyme catalysis makes it possible to separate the enzymatic reaction itself carried out by means of a heterogeneous biocatalyst and the subsequent detection of the reaction products formed, whether on the basis of a colorimetric electrochemical or other method of determination. In this arrangement, it is possible to perform diagnostically very important determinations of urea in physiological fluids. The determination is based on the decomposition of urea by immobilized urease and on the subsequent detection of the ammonia formed electrochemically by means of a glass pH electrode selective for NH * inots or other ammonium electrodes.

Nejdůležitějším faktorem determinujícím možnosti širšího uplatnění uvedeného enzymového rekatorového systému je stabilita imobilizované ureasy. Na stabilitu imobilizovaného enzymu má vliv celá řada faktorů, z nichž největší význam mají způsob imobilizace a podmínky provozu. Problematice imobilizace ureasy byla věnována značná pozornost. Byla vypracována celá řada technik především kovalentní vazby ureasy na různé nosiče (viz například Chibata I.: Immobilized Enzymes, Research and Development, Kodansha, Tokyo (1978), Wiseman A.: Handbook of Enzyme Biotechnology, Ellis Horwood, Chichester (1975)). Přes veškeré toto úsilí zůstává otázka reaktoru s imobilizovanou ureasou, který by vyhovoval jak z hlediska rigidity systému, hydrodynamických vlastností, dostatečné enzymové aktivity a především stability imobilizované ureasy, stále otevřená.The most important factor determining the possibilities of wider application of the said enzyme recator system is the stability of the immobilized urease. The stability of the immobilized enzyme is affected by a number of factors, the most important of which are the method of immobilization and the operating conditions. Considerable attention has been paid to the issue of urease immobilization. A number of techniques have been developed, in particular the covalent attachment of urease to various carriers (see, for example, Chibata I .: Immobilized Enzymes, Research and Development, Kodansha, Tokyo (1978), Wiseman A .: Handbook of Enzyme Biotechnology, Ellis Horwood, Chichester (1975)). . Despite all these efforts, the question of a reactor with immobilized urease, which would satisfy both in terms of system rigidity, hydrodynamic properties, sufficient enzyme activity and especially the stability of immobilized urease, remains open.

Uvedené nevýhody odstraňuje enzymový reaktor, obsahující částice porézního skla potaženého polyglycidylmethakrylátovým gelem pro stanovení močoviny na bázi imobilizované ureasy podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že je tvořen trubičkou nebo hadičkou, ve které je na částice porézního skla potaženého polyglycidylmethakrylátovým gelem imobilizována ureasa kovalentní vazbou po přímé chemické reakci enzymu s reaktivními epoxyskupinami polymeru. Enzymový reaktor lze používat ve spojení s následnou elektrochemickou detekcí vzniklého amoniaku nebo s jeho kolorimetrickým stanovením po smíchání reagujících komponent (fenolátů s chlornanem). 'The above-mentioned disadvantages are eliminated by an enzyme reactor comprising porous glass particles coated with a polyglycidyl methacrylate gel for the determination of urea based on immobilized urease according to the invention, which consists of a tube or tubing after direct chemical reaction of the enzyme with reactive epoxy groups of the polymer. The enzyme reactor can be used in conjunction with the subsequent electrochemical detection of the ammonia formed or with its colorimetric determination after mixing the reacting components (phenolates with hypochlorite). '

Výhodou enzymového reaktoru na stanovení močoviny podle vynálezu je vedle experimentální jednoduchosti jeho přípravy především vysoká stabilita umožňující provádět během dvou měsíců kolem tisíce analys, po kterých poklesne aktivita cca o 35 což umožňuje s ohledem na kapacitní rezervu imobilizované ureasy pokračující využívání rekatoru při dalších analysách.The advantage of the enzyme reactor for the determination of urea according to the invention is, in addition to the experimental simplicity of its preparation, high stability allowing to perform about a thousand analyzes in two months, after which the activity decreases by about 35, which allows

Vynález je dokumentován příkladem použití, aniž by se jím omezoval.The invention is documented by way of non-limiting example.

Příklad provedení g porézního skla potaženého polyglycidalmethakrylátem byl smíchán se 100 mg ureasy ve 40 ml 0,05 M fosfátového pufru pH 6,9, 20 ,umol Na-EDTA a 5 ,umol 2-merkaptoetanolu.Example g of a porous glass coated with polyglycidal methacrylate was mixed with 100 mg of urease in 40 ml of 0.05 M phosphate buffer pH 6.9, 20 .mu.mol Na-EDTA and 5 .mu.mol 2-mercaptoethanol.

Q ‘ 'Q ‘'

Směs byla třepána 16 h při 20 C. Po ukončení vazebné reakce byl nosič s navázaným enzymem promýván střídavě pufrem použitým pro vazebnou reakci a tímtéž pufrem obsahujícím 1 M NaCl. Aktivita připraveného preparátu imobilizované ureasy byla 1,95 nkat/mg vlhkého nosiče. Preparát byl skladován při 4 °C.The mixture was shaken for 16 h at 20 ° C. After completion of the coupling reaction, the enzyme-bound support was washed alternately with the buffer used for the coupling reaction and the same buffer containing 1 M NaCl. The activity of the prepared immobilized urease preparation was 1.95 nkat / mg wet support. The preparation was stored at 4 ° C.

••

CS 272329 Bl 2CS 272329 Bl 2

Připravený heterogenní biokatalyzátor byl použit ve formě enzymového reaktoru pro stanovení můčoviny v systému průtokové injekční analysy.The prepared heterogeneous biocatalyst was used in the form of an enzyme reactor for the determination of urea in a flow injection analysis system.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

An enzyme reactor comprising particles of porous glass coated with a polyglycidyl methacrylate gel for the determination of urea based on immobilized urease, characterized in that it consists of a tube or tube in which urease is reacted directly by reactive covalent bonding with urea reactive chemical reactive porous glass particles coated with polyglycidyl methacrylate gel. epoxy groups of the polymer.