CS273409B1

CS273409B1 - Flow cytometer with sample's hydrodynamical focusing

Info

Publication number: CS273409B1
Application number: CS784988A
Authority: CS
Inventors: Jaromir Rndr Csc Plasek
Original assignee: Jaromir Rndr Csc Plasek
Priority date: 1988-11-29
Filing date: 1988-11-29
Publication date: 1991-03-12
Also published as: CS784988A1

Abstract

The flow cytometer with hydrodynamic focusing of the sample consists of the flow cell, tank of carrier medium and sample, detection device and laser, while the inlet (6) of carrier medium with an adjustable valve (19) into the flow cytometer (8) is loosely dipped into the opened tank (4) of carrier medium; also the inlet (7) of the analyzed sample interferes by its one end into the flow cytometer (8) and its other end is loosely dipped in the opened tank (5) of the analysed sample, while the suction pump (16) is connected to the opening of the flow cytometer (8) by means of a tube (17).<IMAGE>

Description

(57) Proudový cytometr s hydrodynamickou fokusací vzorku, sestávající z průtokové kyvety, zásobníků nosného média a vzorku, detekčního zařízení a laseru, přičemž do otevřeného zásobníku (4) nosného média je volně zanořen přívod (6) nosného média s regulovatelným ventilem (19) do'kyvety (8), do které také zasahuje jedním koncem přívod (7) analyzovaného vzorku, jehož druhý konec je volně zanořen do otevřeného zásobníku (5) analyzovaného vzorku a k ústí kyvety (8) je trubičkou (17) připojeno sací čerpadlo (16).(57) A flow cytometer with hydrodynamic focusing of a sample, consisting of a flow cell, carrier and sample reservoirs, a detection device, and a laser, the carrier (6) of the carrier medium (6) with a controllable valve (19) into the cuvette (8), which also extends one end of the analyte sample inlet (7), the other end of which is freely immersed in the open sample analyzer container (5) and a suction pump (16) is connected via a tube (17). ).

27 3 27 3 409 409 (11) , (11), (13) (13) Bl Bl (51) (51) Int. Cl⁵ G 01 N 21/05Int. Cl ⁵ G 01 N 21/05

**

CS 273409 BlCS 273409 Bl

Vynález se týká proudového cytometru s hydrodynamickou fokusací vzorku pro analýzu suspenzí mikroskopických částic, prováděné metodou označovanou jako proudová cytometrie. Podstata této metody spočívá v tom, že analyzované částice jsou přinuceny procházet jednotlivě světelným paprskem, přičemž vysílají charakteristické, světelné impulsy. Tyto nesou informaci o velikosti jednotlivých částic a jejich fluorescenčních vlastnostech, které mohou být vázány jak s jejich chemickým složením, tak s existencí povrchových receptorů schopných specificky vázat určité fluorescenčně značené lígandy.The present invention relates to a flow cytometer with hydrodynamic focusing of a sample for the analysis of microscopic particle suspensions by a method known as current cytometry. The essence of this method is that the analyzed particles are forced to pass individually through a light beam, emitting characteristic light pulses. These carry information on the size of individual particles and their fluorescence properties, which can be bound both with their chemical composition and with the existence of surface receptors capable of specifically binding certain fluorescently labeled ligands.

Analyzovaná suspenze je tenkou tryskou zavedena do osy sloupce nosné kapaliny, která laminárně proudí zužující se průtokovou kyvetou. V zúženém ústí kyvety dochází k hydrodynamické fokusaci centrálního proudu, zpravidla na průměr 20 nm. Pří koncentraci částic v suspenzi rovnající se l.lO^ml^-^ činí potom jejich průměrná vzdálenost v hydrodynamicky fokusovaném proudu 3 mm. Takto je zajištěno, že analyzované částice procházejí odděleně fokusovaným laserovým paprskem. Dosud známé proudové cytometry využívají k vyvolání proudění nosného média a injekci vzorku do proudové kyvety tlaku stlačeného plynu. Ventilem se nastaví tlak plynu vytlačujícího nosnou kapalinu ze zásobníku na hodnotu 1 až 1,5 x x lO^Pa. Tlak plynu vytlačující vzorek ze zásobníku je nastaven na hodnotu o lO^Pa větší. Během měření musí být udržován konstantní rozdíl tlaků působících -na vzorek a nosnou kapalinu. K detekci pulsů rozptýleného záření a fluorescence slouží detektory. Amplitudy pulsů jsou zpracovány elektronickým blokem. U některých cytometrů je optické měření velikosti částic doplněno o konduktametrické stanovení jejich objemu, Coulterovou metodou.The analyzed suspension is introduced through a thin nozzle into the axis of the carrier liquid column, which flows laminarly through the tapering flow cell. In the tapered mouth of the cuvette, the central current is hydrodynamically focused, usually to a diameter of 20 nm. At a concentration of the particles in the suspension equal to 1.0 ml / ml ^, their average distance in the hydrodynamically focused stream is then 3 mm. This ensures that the analyzed particles pass separately through the focused laser beam. The prior art flow cytometers utilize compressed gas pressure to induce the flow of the carrier medium and inject the sample into the flow cell. The valve sets the pressure of the carrier liquid ejecting gas from the reservoir to a value of 1 to 1.5 x 10 -10 Pa. The gas pressure pushing the sample out of the reservoir is set to a value 10-10 Pa greater. During the measurement, the differential pressure applied to the sample and the carrier liquid must be kept constant. Detectors are used to detect pulses of scattered radiation and fluorescence. Pulse amplitudes are processed by an electronic block. In some cytometers, the optical measurement of particle size is supplemented by a conductuctimetric determination of their volume by the Coulter method.

Uvedené cytometry jsou konstrukčně značně náročné. Součástí cytometrů jsou dva zdroje stlačeného plynu, mezi kterými musí být udržován konstantní rozdíl. Zásobníky vzorků a nosné kapaliny musí být realizovány jako tlakové nádoby, utěsněné proti unikání stlačených plynů, působících pod tlakem 1 až l,5.10⁵Pa. Z tohoto důvodu je nutné utěsnit také hrdlo kyvety, kterým prochází přívod analyzovaného vzorku, což komplikuje konstrukci zařízení pro automatizovanou výměnu vzorků.These cytometers are structurally demanding. Cytometers are equipped with two sources of compressed gas, which must be kept constant difference. The sample container and the carrier liquid must be realized as a pressure vessel, sealed against escape of pressurized gases, operating under a pressure of 1 to L, 5.10 ⁵ Pa. For this reason, it is also necessary to seal the neck of the cuvette through which the sample inlet passes, which complicates the design of the automated sample exchange device.

Výše uvedené nevýhody podstatně snižuje proudový cytometr s hydrodynamickou fokusací vzorku, sestávající z průtokové kyvety, zásobníků nosného média vzorku, detekčního zařízení a laseru, podle vynálezu. Oeho podstata spočívá v tom, že do otevřeného zásobníku nosného média je volně zanořen přívod nosného média s regulovatelným ventilem do kyvety, do které zasahuje jedním koncem přívod analyzovaného vzorku, jehož druhý konec je volně zanořen do otevřeného zásobníku analyzovaného vzorku a k ústí kyvety je trubičkou připojeno sací čerpadlo. V trubičce spojující kyvetu s sacím čerpadlem a v kyvetě mohou být umístěny elektrody k měření objemu mikroskopických částic.The above disadvantages substantially reduce the flow cytometer with the hydrodynamic focusing of the sample, consisting of a flow cell, sample carrier media reservoirs, a detection device and a laser, according to the invention. The principle is that the open medium carrier is freely plunged into the cuvette with a supply valve with a controllable valve, into which one end of the sample inlet extends, the other end freely plunged into the open sample reservoir and connected to the mouth of the cuvette suction pump. Electrodes can be placed in the tube connecting the cuvette to the suction pump and in the cuvette to measure the volume of microscopic particles.

Hlavní výhody proudového cytometru podle vynálezu spočívají v konstrukční jednoduchosti. K vyvolání proudění vzorku a jeho hydrodynamické fokusaci se použije jediné sací čerpadlo. Hydrodynamická fokusace se snadno reguluje poměrem světlosti přívodů analyzovaného vzorku a přívodu nosného média. Konstrukce cytometru je dále zjednodušena provedením zásobníků nosného média a vzorku- ve formě otevřených nádob. Nasávání vzorku z otevřeného zásobníku je výhodné pro cytometry s automatizovanou výměnou vzorků.The main advantages of the current cytometer according to the invention are the simplicity of construction. A single suction pump is used to induce sample flow and hydrodynamic focusing. Hydrodynamic focusing is easily controlled by the ratio of the lightness of the inlets of the analyzed sample to the inlet of the carrier medium. The design of the cytometer is further simplified by providing containers of carrier medium and sample in the form of open containers. Sample aspiration from an open container is advantageous for cytometers with automated sample exchange.

Proudový cytometr je znázorněn na připojeném výkresu.The flow cytometer is shown in the attached drawing.

Do otevřeného zásobníku £ nosného média je vnořen přívod 6 nosného média kyvety iB, do které zasahuje jedním koncem přívod T_ analyzovaného vzorku. Druhý konec je volně zanořen do otevřené-.nádobky £ analyzovaného vzorku. Ústí kyvety £ je trubičkou 17 připojeno na sací čerpadlo 16. V trubičce 17 a v kyvetě £ jsou umístěny elektrody 18. Analyzované částice procházejí laserovým paprskem 9.· K detekci pulsů rozptýleného záření a fluorescence slouží detektory 12, 14. Amplitudy pulsů jsou zpracovány elektronickým blokem 15.An open carrier 6 of the cuvette 1B is inserted into the open carrier medium container 6, into which the inlet T of the sample to be analyzed reaches one end. The other end is freely immersed in the open container of the sample to be analyzed. The orifice of the cuvette 8 is connected to a suction pump 16 via a tube 17. Electrodes 18 are placed in the cuvette 17 and in the cuvette. block 15.

Analyzovaný vzorek je přívodem 1_ analyzovaného vzorku zaveden do osy přívodu £ nosného média, které laminárně proudí kyvetou B_. V zúženém ústí kyvety £ dochází k hydrodynamické fokusaci centrálního proudu. Při koncentraci částic analyzovaného vzorku l.lO^.ml^-^ činí potom jejich průměrná vzdálenost v hydrodynamicky fokusovaném proudu 3 mm. Analýzo%The sample to be analyzed is fed to the inlet axis 6 of the carrier medium through the inlet 7 of the sample to be analyzed, which flows laminarly through the cuvette B. In the narrowed orifice of the cuvette 6, the central current is hydrodynamically focused. When the particle concentration of the sample analyzed l.lO .ml ^ ^- ^ then make their average distance in a hydrodynamically focussed stream 3 mm. Analysis%

CS 273409 Bl váné částice procházejí odděleně fokusovaným laserovým paprskem 9, a vysílají fluorescenci 13 a rozptýlené světlo 10, které jsou analyzovány pomocí detektorů 12. 14.. Signály z fotodetektorů jsou vyhodnocovány elektronickou jednotkou 15..CS 273409 The blended particles pass through a separately focused laser beam 9, and emit fluorescence 13 and scattered light 10, which are analyzed by detectors 12. 14. The signals from the photodetectors are evaluated by the electronic unit 15.

Příkladem možného provedení proudového cytometru je proudová kyveta vrtaná v skleněném hranolu, jejíž přívod J_ analyzovaného vzorku má průměr 0,2 mm, ústí kyvety £ má průměr 2 mm, výška kuželové části kyvety £ je 8 mm, výška válcové části kyvety £ je 20 mm. Celková výška kyvety £ je 30 mm a její průměr je 10 mm. Ústí kyvety £ je připojeno k rotačnímu zubovému čerpadlu 16.An example of a possible embodiment of a current cytometer is a flow cell drilled in a glass prism, the sample inlet 7 of the sample having a diameter of 0.2 mm, the mouth of the cell 6 has a diameter of 2 mm, . The total height of the cuvette is 30 mm and its diameter is 10 mm. The mouth of the cuvette 6 is connected to a rotary gear pump 16.

Zařízení je určeno k měření koncentrace mikroskopických částic v suspenzích, k určování distribuce jejich velikostí a k měření distribuce intenzity jejich fluorescence, která vypovídá o jejich chemickém složení. Takto lze měřit například obsah nukleových kyselin v buňkách, rozlišovat různé typy krvinek a jejich koncentraci nebo měřit koncentraci receptorů na povrchu lymfocytů. Proudové cytometrie lzé využívat také k měření distribuce velikostí a studiu chemického složení anorganických mikroskopických částic.The device is designed to measure the concentration of microscopic particles in suspensions, to determine their particle size distribution and to measure the intensity distribution of their fluorescence, which indicates their chemical composition. Thus, for example, the nucleic acid content of cells can be measured, different types of blood cells and their concentration can be distinguished, or the concentration of receptors on the surface of lymphocytes can be measured. Current cytometry can also be used to measure the size distribution and study the chemical composition of inorganic microscopic particles.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A flow cytometer with a hydrodynamic focusing pattern comprising a flow cell, carrier media and sample containers, a detection device and a laser, characterized in that the carrier media (6) is freely immersed in the open carrier media (4) with a controllable valve (19) into the cuvette (8), which also extends at one end with an inlet (7) of the sample to be analyzed, the other end of which is freely plunged into the open sample container (5) and a tube (17) suction pump (16) connected.

2. A flow cytometer according to claim 1, characterized in that in the tube (17) and the cuvette (18); electrodes (18) are disposed.