CS276333B6 - Způsob přípravy aktivovaných zabiječských buněk - Google Patents

Abstract

Řešení se týká oboru imunologie, medicíny (např, onkologie, interny átd.), farmakologie a biotechnologie. Řeší přípravu aktivovaných forem.cytotoxických buněk a produkci cytokinů. Účelem je příprava aktivovaných forem zabíječů pro specializované terapeutické využití v onkologii, klinické .? a experimentální imunologii, čehož se dosáhne přídavkem námelových alkaloidů nebo i jejich polosyntetických derivátů ke kultu- í rám lymfocytů in vitro a následnou kultiva- j cí po dobu 3 až 7 dnů. Kultivací jsou získány jednak aktivované zabíječské buňky a nebo produkce cytokinů vyvolávajících í zvýšenou proliferaci a cytotoxicitu lymfoidníCh buněk. Aplikací námelových alkaloidů ;■ in vivo je dosaženo identických výsledků.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy aktivovaných zábiječských buněk, tzn. buněk hrajících důležitou roli v protinádorové a protivirové imunitě.

Mechanismy imunitního rozpoznávání patří mezi významné oblasti zachování integrity organismu. Vedle specifických forem rozpoznávání pomocí receptorů, jejichž existence na buňkách B a T je poměrně známa, existuje rozpoznávání na úrovni nespecifické, které může mít imunní a neimunní povahu. Do této nespecifické imunity je zatím zařazována velmi heterogenní stopina buněk spontánní cytotoxicity (SC). Buňky, které jsou původními lymfoidními zástupci jsou nazývány přirozenými zábiječi (buňky UK, K) a nenesou membránový znak CD3 (mezinárodní klasifikace povrchových struktur leukocytů).

Do skupiny jsou řazeni další zástupci, kteří znovu uspořádávají specifický buněčný receptor buněk T, nesou CD3 znak a jejich rozpoznávání není závislé na hlavním histokompatibilním systému (MHO). Buňky'jsou tedy různého fenotypu a až na buňky CD3⁺, které patří k lymfocytům T, ne zcela známého původu.

Nepatří k dosud známým buněčným liniím T, B, i když vznikají ze společné kmenové buňky a nesou některé znaky společné s buňkami T a buňkami myelomonocytární řady. Spontánní cytotoxické buňky jsou schopny rozpoznávat širokou škálu buněčných cílů bez předchozí senzitizace a nepodléhají restrikci ve spojení s MHO I. a II. třídy. · Cílové buňky jsou lyžovány podobně jako specifickými cytotoxickými lymfocyty (CIL) konstitutivně produkovanými lytickými faktory za úěasti koloidní osmozy a spolu s dosud nepopsanými mechanismy, které vyžadují rovněž rozpoznávací procesy. Konečný efekt lyže spočívá v poškození cílové buňky tvorbou pórů v membráně (perforiny), případně fragmentaci DNK. Receptor buněk spontánní cytotoxicity (především buněk NK) je neznámé povahy a existují reálná data.i předpoklady, že jedním z možných mechanismů rozpoznávání, pro jehož uplatnění se nahromadilo větší množství převážně nepřímých důkazů, je interakce lektin-sacharid. Spolu se specifickými cytotoxickými lymfocyty, které rozpoznávají pomocí receptorů buněk T (superimunoglobulinová rodina), vytvářejí buňky SC důležitý Obranný systém v antiinfekční a protinádorové imunitě a hrají významnou roli v imunitě transplantační. Mimoto se podílejí na řadě regulačních procesů v hemopoeze a tím plní úlohu imunního dozoru, což je považováno za základní podmínku existence organismu. '

Aktivace buněk spontánní cytotoxicity patří mezi nejzávažnější problémy přípravy přirozeně aktivních látek a buněčných systémů, nejen z hlediska získání základních poznatků, ale rovněž z hlediska terapeutického. Mezi stěžejní aktivátory patří lymfokiny typu interferonů a interleukinů, které spolu s buňkami, které aktivují, jsou označovány za perspektivní v imunoterapii nádorů. Buňky popsané jako aktivovaní zábiječi (AK), lymfokiny aktivovaní zábiječi (buňky LAK), jsou připravovány a zkoumány z hlediska schopnosti lyžovat nejen citlivé, ale i resistentní buněčné cíle. Dnes tvoří základ nových léčebných procedur v případech maligního onemocnění nejrůznějšího druhu.

Nevýhodou dosavadního způsobu aktivace použitím lymfokinů (zejména ID-2 a interferonů) je jejich vysoká toxicita a z ní vyplývající potíže při aplikaci pacientům. Navíc, terapie je založena na použití rekombinantních preparátů (produkty bakterií), které obsahují současně bakteriální antigeny zvyšující protilátkovou odpověď pacientů, což vede ke snížení účinnosti léčby a nežádoucí tvorbě protilátek proti bakteriálním antigenům.

Uvedené nevýhody odstraňuje postup aktivace zabiječských buněk podle vynálezu. Spočívá v indukci cytotoxických buněk (NK, K, CIL) pomocí různých typů námelových alkaloidů, a to jak přírodních, tak i polosyntetických, jako jsou: peptidické námelové alkaloidy skupiny ergotaminu, ergotoxinu aergostinu, jednoduché deriváty kyseliny lysergové - ergometrin a ergin, klavinové alkaloidy - elymoklavin, agroklavin, chanoklavin a mono a difruktosid elymoklavinu, polosyntetické námelové alkaloidy - dihydrolysergol, 1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol, 1-methyl-10-alfa-methoxy-dihydrolysergol a jejich nikotinoyl a 5-brom-nikotinoyl estery, lisurid, tergurid, methylergometrin, /4a(S),10b(S)/-7-amino-3,4,4a,5,6,10b-hexahydro-2-hydroxymethyl-4-methyl-6-oxobenzo-f/chinolin(Ox-Elymoklavin), /4a(S)., 10b(S)/-7-amino-3,4,4a,5,6,10b-hexahydro~2,4-dimethyl~6-oxobenzo-/f/-chinolin(Ox-Agroklavin) a dále ox-dihydrolysergol a jeho 1-methyl, 10-alfa-methoxy a 1-methyl-10-alfa-methoxy

CS 276 333 B6 2 deriváty.

Použity mohou být i 9-10 dihydroderiváty přirozených námelových alkaloidů a jejich 2 halogenderiváty.

Základní struktury jsou uvedeny na obr. 1 až 3.

K testování.způsobu přípravy aktivovaných zábiječských buněk (AK) a přípravy buněk s aktivovanou syntézou cytokinů byly použity tyto imunologické metody:

1. Testování proliferační aktivity pomocí inkorporace ^H-thymidinu in vitro periferních mononukleárních buněk lidské krve PBMC.

2. Vliv supernatantů získaných z 5-ti denních kultui' stimulovaných námelovými alkaloidy na nestimulované buňky PEMC.

3. Cytotoxická aktivita buněk, získaných z 5-ti denních kultur s námelovými alkaloidy, stimulovaných. PBMC.

4. Účinek námelových alkaloidů podaných in vivó myším kmene Balb/c a nu/nu a in vitro sledování proliferační aktivity (spontánní a indukované PHA) a spontánní cytotoxicity slezinných lymfocytů dělených na Ficoll - Verografinu.

První metoda testování způsobu přípravy aktivovaných zabijeěských buněk spočívá v tom, že účinek námelových alkaloidů je sledován průběžně od 1. do 7. dne kultivace. Mikroskopicky se na kultuře projeví zvýšenou blastickou transformací a pomnožením buněk již po 3 dnech kultivace. Tento účinek se prohlubuje až do 7. dne kultivace. Kvantifikace tohoto jevu, tzn. aktivace zábiječských buněk,· se provádí měřením inkorporace ^H-thymidinu podle běžně používané metodologie.

Další metodou, která byla použita pro aktivaci zábiječských buněk bylo použití supernatantů z kultur stimulovaných námelovými alkaloidy 5 dní. Tyto supernatanty již v podstatě neobsahují volné námelové alkaloidy; jednak jsou navázány na receptorová místa buňky, jednak zmetábolizovány.

Přídavkem supernatantů dochází ke stejnému jevu, jako po přidání samotných alkaloidů, tzn. že k aktivaci dochází působením jiných látek - cytokinů (interleukiny, interferony), které jsou uvolňovány aktivovanými buňkami. '

Dalším z účinků námelových alkaloidů na kultury buněk periferní krve je zvýšení jejich cytotoxické aktivity i proti NK-rezistentním liniím, které se projeví tím, že po 5-ti denní kultivaci lymfocytů s námelovými alkaloidy dochází ke zvýšení zábiječské aktivity těchto buněk. Tento účinek je kvantifikován měřením koncentrace uvolněného ^¹Cr z cílových buněk podle standardní imunologické metody.

Ke stejnému účinku dochází také po přídavku supernatantů z kultur stimulovaných 5 dní v přítomnosti námelových alkaloidů.

K testování aktivity námelových alkaloidů in vivo byly použity myši kmene Balb/c (normální imunitní stav) a nu/nu (thymus deficientní) na základě in vitro pokusů, které ukázaly ovlivnění především T lymfocytů. Po intraperitoneálním podání roztoků námelových alkaloidů dochází ke zvýšení jak proliferační, tak cytotoxické aktivity. Z výsledků pokusů na nu/nu myších plyne, že námelové alkaloidy jsou schopny upravit defektní imunitní odpověči v oblasti T buněk.

Využití způsobu přípravy aktivovaných zábiječských buněk podle vynálezu se předpokládá především ve sféře experimentálního zaměření vedoucího k zjištění cesty aktivace buněk a možnosti detailnějšího studia molekulárních aspektů aktivace vlivem námelových alkaloidů (lze předpokládat, že k aktivaci dochází přes receptor endokrinní povahy). Tento postup by zajistil znalosti nutné k využívání různých forem alkaloidů in vivo a v terapeutické praxi.

Buňky LAK využívané pro léčbu nádorového onemocnění je nutné kombinovat s podáváním interleukinu-2 samotného, což nese velká rizika vedlejších, nežádoucích účinků (nausea, teplota, otoky atd.). I když se v posledním období přechází k dlouhodobější kultivaci

CS 276 333 B6 s IL-2 a podávání menších dávek IL-2 pacientům, nelze zcela vyloučit vedlejší, toxické účinky.

Příprava aktivovaných zabiječských buněk pomocí námelových alkaloidů s menšími vedlejšími účinky je žádoucí nejen vzhledem k ceně, ale i nutnému podpůrnému účinku interleukinů. '

Dosavadní výsledky získané in vivo poukazují na možnou terapii mnoha typů nádorového onemocnění a naznačují i směr, který se budě dále odvíjet využitím přirozených mechanismů imunity. Výzkum buněk se zabiječskou schopností pro jejich negativní úlohu je důležitý rovněž v imunologii transplantační.

Způsob přípravy aktivovaných zabiječských buněk působením námelových alkaloidů je doložen následujícími příklady provedení, aniž by tím byl předmět vynálezu jakkoli omezen.

Příklad 1 .

Lidská periferní krev se po ředění 1 : 1 v médiu RPMI 1 640, pH 7 až 7,2 dělí na směsi Ficoll - Verografinu (8 % Ficoll - Pharmacia v tkáňové s 35 % Vergografinem - Spofa 2,4 : 1) 40 min při 400 g. Mononukleární lymfocyty v interfázi jsou třikrát promyty v RPMI 1 640, pH 7 až 7,2 (10 min, 250 g) a potom zředěny v kultivačním médiu RPMI L-glutamin, PNG/STM a 5 % fetálního telecího séra na koncentraci 1.10$ buněk/ml.

Test se provádí v 96-jamkové destičce pro tkáňové kultury (NOTO). Ke 200 yul buněčné suspenze (v tripletech) se přidává 50 ýul roztoku námelových alkaloidů v RPMI pH 7,2 do konečné koncentrace 1 ^ug/ml a 10 /Ug/ml buněčné suspenze a po 5-ti dnech kultivace v CO₂ inkubátoru (při 37 °C, 5 % CO₂, 100® vlhkost) se přidá 50 ^ul roztoku ^H-thymidinu (2,5 _zuCi). Po 12-ti hodinách inkubace se vzorky sklízejí na harvestoru a měří se množstvím inkorporovaného thymidinu lymfocyty, které vyjadřuje stupen proliferační aktivity buněk vyjádřený v cpm. Stupeň zvýšení oproti kontrole je vyjádřen stimulačním indexem SI (SI = cpm vzorku/cpm kontroly). Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1 .

Zvýšení proliferační aktivity lymfocytů účinkem námelových alkaloidů

alkaloid	SI 10 /Ug/ml	SI 1 /Ug/ml	SI 0,5 ýug/ml
Elymoklavin	2,5 až 5,0	1,0 až 1,5	1,05 až 1,2
Blymoklavin fruktosid	2,0 až 3,0	1 ,0 až 1 ,2	0,96 až 1,1
Elymoklavin difruktosid	3,0 až 8,5	1,0 až 1 ,2	1,1 až 1,2
Ox-Blymoklavin	4,0 až 6,0	1,5 až 2,0	0,9 až 1,2 .
Dihydrolysergol .	1,5 až 2,0	2,0 až 5,0	1,2 až 1,4
10-alfa-metoxy-dihydrolysergol	1,5 až 2,0	1,5 až 3,o	1,3 až 1,5
Agroklavin	1,5 až 2,0	2,5 až 3,0	2,4 až 3,6
Ox-Agroklavin	3,0 až 4,0	1,5 až 2,5	3,1 až 5,6
Chanoklavin	1,0 až 1,5	1,5 až 2,5	3,1 až 5,6
Οχ-1O-alfa-metoxy-dihydrolysergol	6,5 až 3,6	1,4 až 1,2
1-Methyl-10-alfa-methoxy-dihydrolysergol	1,0 až 0,8	1,1 až 0,96	1,2 až 1,02
Ergokristin	0,5 až 0,6	0,8 až 1,7	1,0 až 1,02
Alfa-ergokryptin	0,3 až 0,6	0,4 až 0,9	0,5 až 1,06
Nicergolin	0,4 až 0,7	0,7 až 0,8	1,0 až 1,2
Ergocornin	0,2 až 0,35	0,7 až 0,8	1,5 až 1,7
Ergometrin	0,5 až 0,8	0,6 až 0,9	1,4 až 1,6
Beta-ergokryptin	0,2 až 0,6	0,4 až 1,2	1,1 až 1,4
Ergotamin	0,7 až 0,85	0,5 až 1,0	1 ,29 až 1,6

Příklad 2

Izolované mononukleární buňky lidské periferní krve byly resuspendovány v kultivačním médiu podle příkladu 1 a 3 až 7 dní kultivovány v přítomnosti námelových alkaloidů v CO₂

CS 276 333 B6 4 inkubátoru. Potom byla stimulována buněčná suspenze centrifugována 10 min/250 g a supernatant byl použit v testu proliferaee, viz příklad 1, s nestimulovanými lymfocyty lidské periferní krve. K 200 /U1 nestimulované buněčné suspenze bylo přidáno 50 yul neředěného supernatantu ze stimulovaných, lymfocytů. Po 3 až 5 dnech kultivace byla měřena inkorporace ^H-tymidinu. Supernatanty použité pro testování proliferace byly zkoušeny také v testu spontánní cytotoxicity proti NK-rezistentní nádorové linii (RÁJI) v 96-ti jamkové destičce pro tkáňové kultury (NOTO) v tripletech.

Schéma pokusu: Ke 100 ,ul suspenze nádorových buněk (koncentrace - 1x10^/ml) značených 90 min v CO₂ inkubátoru (Amersham) - 100 ^uCi/IO^ buněk bylo přidáno 100 ^ul suspenze lymfocytů připravených podle příkladu 1 v koncentraci 2 x 10^/ml a 50 /U1 supernatantu ze stimulovaných buněk. Po 4-hodinové inkubaci v C0„ inkubátoru bylo měřeno množství uvolněného ' Cr ve 100 /U1 kultivačního média a ze získaných výsledků vypočteno % cytotoxicity podle vzorce:

% cytotoxicity = £22_£Si^_22S-2E2^ · _{x 1O}o cpm max. - cpm spont.

cpm exp. - množství uvolněného ^'cr ze směsi lymfocytů a nádorových buněk cpm spont. - množství uvolněného ^Cr samotnými nádorovými buňkami Rl v cpm max.' - maximální uvolnění ^J Cr nádorovými buňkami po použití detergentů (2 % Triton x 100)

K posouzení účinnosti supernatantů ze stimulovaných lymfocytů na aktivaci spontánní cytotoxicity bylo použito % zvýšení cytotoxicity vypočítané podle vzorce:

% zvýš. ctx = x 100, % ctx K kde

V - cytotoxický účinek testovaného supernatantu, K - cytotoxický účinek kontrolní kultury.

Výsledky jsou zhrnuty v tabulce 2. ' Tabulka 2

Účinek supernatantů z lymfocytů stimulovaných námelovými alkaloidy na proliferační a cytotoxickou aktivitu

alkaloid	SI	% zvýšení cytotoxicity
Elymoklavin	4 až 8	80 až 100
Elymoklavin difruktosid	2 až 4	40 až 50
Dihydrolysergol	5 až 9	80 až 200 .
1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol	4 až 8	50 až 100

Z tabulky 2 je zřejmé, že supernatanty z lymfocytů stimulovaných námelovými alkaloidy Zvyšují proliferaci buněk se spontánní cytotoxicitou. Z toho vyplývá, že účinek je zprostředkován jedním nebo několika cytokiny produkovanými stimulovanými buňkami.

Příklad 3

Lymfocyty připravené podle příkladu 1 byly stimulovány roztoky námelových alkaloidů 5 až 7 dní v koncentraci 0,1 až 20 /Ul/ml buněčné suspenze. Buňky byly dvakrát promyty médiem RPMI 1 640 (10 min/250 g) a potom použity v cytotoxickém testu, viz příklad 2, jako efektorové buňky proti NK-rezistním cílovým liniím (RAJI, BAUDI - mají receptor pro interferon alfa 2).

Po 4 hodinové inkubaci v C0₂ inkubátoru bylo měřeno množství uvolněného ^y Cr.

CS 276 333 B6

Tabulka 3

Vliv stimulace námelovými alkaloidy na aktivitu cytotoxických buněk

alkaloid		% zvýšení cytotoxicity	c.	b.	RÁJI
10	/Ug/ml	1	/Ug/ml (	),5	/Ug/ml
Elymoklavin .	40	až	100	20	až	30
Elymoklavin difruktosid	40	až	60	20	až	30
Ox-elymoklavin '	20	až	25	30	až	40
Bysergol	9	až	10	1 1	až	20
Dihydrolysergol	80	až	90	10	až	20
1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol	40	až	90	30	až	55
Ox-1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol	50	až	95	10	až	20
Agroklavin	0	až	5	10	až	20
Ox-agroklavin	60	až	100	50	až	60
Chanoklavin	35	až	80 ,	20	až	40	30	až	50
Ergokristin	0			20	až	30	20	až	30
Ergocornin .	10	až	20	20	až	30	50	až	60
Nicergolin	20	až	30	30	až	40	50	až	60
Ergotamin '	30	až	40	60	až	70	60	až	70
Ergometrin	15	až	20	35	až	45	20	až	30
Beta-ergokryptin	0	až	5	30	až	40	30	až	40
Alfa-ergokryptin	0			10	až	20	5	až	10

Z tabulky vyplývá, že vš.echny testované námelové alkaloidy zvyšují schopnost lymfocytů zabíjet NK-rezistentní nádorové buňky RAJI a 1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol navíc i buňky DAUDI.

Příklad 4

Myším kmene Balb/c (s normální imunitní odpovědí) a nu/nu (s defektním vývojem týmu) byl jednorázově intraperitoneálně aplikován.roztok námelových alkaloidů v dávce 0,1 až 20 mg/kg živé váhy. Kontrolní skupina myší obou kmenů dostala stejný objem média, ve kterém byly jednotlivé látky rozpuštěny. Po 7 dnech byly myši usmrceny cervikální dislokací a slezinné buňky po homogenizaci rozděleny na Ficoll-Verografinu. Slezinné lymfocyty byly testovány na proliferační aktivitu, po 3 dnech podle příkladu 1 a spontánní cytotoxicitu podle příkladu 2.

Tabulka 4

Účinek in vivo aplikace roztoku, námelových alkaloidů na proliferační aktivitu (SI) a spontánní cytotoxicitu .(% ctx) slezinných lymfocytů myší kmene Balb/c

alkaloid	10 .ug/ml 1. dávka 2. dávka	% ctx CB-YAC1	1 ,ug/mi 1. dávka 2. dávka	% ctx CB-YAC1
Elymoklavin	6,5	2,47	24,0	4,75	2,27	37,0
Elymoklavin difruktosid Ox-elymoklavin	4,81	2,28	18,25	5,37	1,43	14,5
Bysergol ·	1,53	2,28	25,14	4,42	4,96	17,34
Dihydrolysergol .	4,45	6,85	28,16	2,25		-
1 O-alfa-methoxy-dihydrolysergol	2,8			1,67	2,10	20,86
Ox-1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol	5,50	5,70	21 ,62
Agroklavin	4,08	1 ,08		3,96	0,68	14,33
Ox-agroklavin	8,45 11,05+)	0,95 2,63+)	40,90 24,19+)	1,85	2,65	22,06
Chanoklavin	3,59	0,92	30,63
Beta-ergokryptin				7,15	5,49	22,74

	CS 276 333 B6	6
Ergotamin		1,33	2,09	25,23
Alfa-ergokryptin		4,33	2,79	21 ,42
Ergometrin		3,29	2,75	25,76
Ergocornin		6,31	1,93	11,68
Ergokristin		2,15	1,36	24,83
Kontrola	1,00 1,00 4,28	1 ,00	1 ,00	4,28

⁺) 0,5 /Ug/ml

Tabulka 5 '

Účinek námelových alkaloidů na proliferační aktivitu a spontánní cytotoxicitu slezinných lymfocytů u myší kmene nu/nu

alkaloid a dávka	spontánní proliferace SI	proliferace v přítomnosti PHA SI	% zvýšení cytotoxicity
Elymoklavin 10 mg/kg	2,0 až 2,5	3,4 až 4,5	90 až 100
Dihydrolysergol 1 mg/kg	2,5 až 3,0	6,0 až 7,0	80 až 100
10-alfa-methoxy-dihydrolysergol 1 nig/kg	2,4 až 2,8	4,0 až 5,0	90 až 110
Agroklavin 1 mg/kg	2,7 až 3,0	1,5 až 2,0	40 až 60

Z výsledků uvedených v tabulce 4 a 5 je zřejmé, že proliferační aktivita lymfocytů se zvyšuje po podání roztoků námelových alkaloidů myším in vivo. Z tabulky 5 navíc vyplývá, že námelové alkaloidy působí zejména na T buněčnou populaci (jak je vidět z výsledků proliferace v přítomnosti PHA) a jsou schopny do značné míry upravit defektní imunitní odpověď, v oblasti T lymfocytů.

Příklad 5

Izolované mononukleární buňky lidské periferní krve byly resuspendovány v kultivačním médiu podle příkladu 1 a 5 dní kultivovány v přítomnosti námelových alkaloidů a 20 až 100 lU/ml rIL-2 v COg inkubátoru. Stanovení proliferační aktivity bylo provedeno stejně jako v příkladu 1. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6.

Tabulka 6

Proliferační aktivita buněk PEL a KK (99 % čistoty) po současné stimulaci rIL-2 a námelovými alkaloidy (cpm)

I

alkaloid	PBL.	NK
Elymoklavin	40 500	130 200
Elymoklavin difruktosid	45 980	127 900
Chanoklavin	40 600	3 000
Ox-elymoklavin	54 400	120 100
Lysergol	59 200	148 850
Dihydrolysergol	38 200	142 520
10-alfa-methoxy-dihydrolysergol	. 59 700	161 220
Ox-10-alfa-methoxy-DH-lysergol ·	45 800	103 500
Agroklavin	47 700	121 700
Alfa-ergokryptin	51 300	166 400
Nicergolin	45 230	145 050
Kontrola + rIL-2	50 000	120 000

Z uvedeného příkladu 5 vyplývá, že námelové alkaloidy působí vesměs synergicky s rIL-2, mírně stimulačně působí především lysergol a jeho deriváty a dále alfa-ergokryptin a ni7 CS 276 '333 26 cergolin. V případě chanoklavinu dochází k signifikantnímu útlumu proliferační aktivity

NK buněk stimulovaných rIL-2.

Claims (6)

P A T B E I 0 V í NÁROKY

1. Způsob přípravy aktivovaných zabiječských buněk, jejichž aktivace je dosaženo zvýěením proliferační aktivity, vyznačující se tím, že se na kultury lymfocytů lidské periferní krve působí námelovými alkaloidy.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako přírodní námelové alkaloidy se použijí peptidické námelové alkaloidy skupiny ergotaminu, ergotoxinu a ergoxinu, jednoduché deriváty kyseliny lysergové - ergometrin a ergin, klavinové alkaloidy - elymoklavin, agroklavin, chanoklavin a mono a difruktosid elymoklavinu nebo jejich směsi.

3- Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako polosyntetické námelové alkaloidy se použijí dihydrolysergol, 1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol, 1-methyl-1O-alfa-methoxy-dihydrolysergol a jejich nikotinoyl a 5-brom-nikotinoyl estery, Lisurid, Tergurid, methylergometrin, /4a(S),10b(S)/-7-amino-3,4,4a,5,6,10b-hexahydro-2-hydroxyinethyl-4-methyl-6-oxobenzo-f/chinolin (Ox-Elymoklavin(,/4a(S),10b(S)/-7-amino-3,4,4a,5,6,1Ob-hexahydro-2,4-dimethyl-6-oxobenzo-/f/-chinolin (Ox-Agroklavin), dále ox-dihydrolysergol a jeho 1-methyl, 10-alfa-methoxy a 1-methyl-10-alfa-methoxy deriváty a dále 9 - 10 dihydroderiváty přirozených námelových alkaloidů a jejich 2 halogenderiváty nebo jejich směsi. .

4· Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se námelové alkaloidy přidávají do kultury ve formě roztoku v standardním médiu o pH 7 až 7,2 v koncentracích 0,1 až 20 ^ug/ml kultury.

5. Způsob přípravy aktivovaných zabiječských buněk, vyznačující se tím, že aktivace je dosaženo přídavkem supernatantu z 3 až 7 denních kultur lymfocytů stimulovaných námelovými alkaloidy, s výhodou elymoklavinem, dihydrolysergolem, 1O-alfa-methoxy-dihydrolysergolem a elymoklavin-difruktosidem.

6. Způsob přípravy aktivovaných zabiječských buněk s tím, že aktivace je dosaženo zvýšením cytotoxické aktivity proti NK-rezistentním cílovým buňkám, vyznačující se tím, že kultivace se provádí v přítomnosti námelových alkaloidů s výhodou elymoklavinu, elymoklavin-difruktosidu, dihydrolysergolu a 1O-alfa-methoxy-dihydrolysergolu.