CS276340B6 - Způsob přípravy králičích antimeningokokových sér zejména k určení sérqjogických.1skupin metodou sklíčkové aglutinace - Google Patents

Abstract

Antimeningokoková véna imunizací králíků národních referenčních séra jsou připraza použití mezikmenů mikroorganismů Neisseria meningitidis sérologických skupin A, B, 0, D, X, Y, Z, W135 a 29E. Imunizace se provádí 8 dávkami živého kmene v přesně určených intervalech po dobu 35 dnů. Po 42. dnu se z králičí krve oddělí sérum, které se testuje na přítomnost specifických a nespecifických protilátek. V sérech získaných způsobem podle vynálezu každé serologické skupiny nebyly přítomny nespecifické aglutinace a specifické aglutinace byly v ředěních 1:16 až 1:64 v intenzitě ++.

Description

Vynález řeší způsob přípravy králičích antimeningokokových sér k určení sérologických skupin metodou sklíčkové aglutinace.

V současné době se připravují různá séra k určování sérologických skupin kmenů mikroorganismů Neisseria meningitidis, izolovaných z klinického materiálu. Způsob přípravy sér i postup imunizace je výrobci utajován. Některé séra, která byla zejména zahraničními výrobci označena jako kvalitní séra se ukázala po ověřování prakticky nepoužitelná, protože nebyla jednotná a kvalitní. Navíc se zatím nepodařilo uspokojivě zajistit výrobu všech potřebných sér, a to i v jejich požadovaném množství.

Na základě vývoje současné epidemiologické situace lze očekávat vzestup výskytu meningokokové meningitidy, celkově velmi závažného onemocnění s vysokou úmrtností, protože je dnešní celosvětová situace hodnocena odborníky jako závažná a zvláště u nás jako predepidemická. Za současné situace jsou antimeningokoková séra dostupná jen málo laboratořím, čímž je určen jen malý počet kmenů Neisseria meningitidis izolovaných od pacientů. Tímto je ztíženo určení původce nemoci. Čím později se identifikuje původce nemoci a později se nasadí účinná léčba, tím je pravděpodobnost vyléčení horší.

Uvedené nevýhody řeší způsob přípravy králičích antimeningokokových sér k určení sérologických skupin metodou sklíčkové aglutinace podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se mezinárodními referenčními kmeny mikroorganismů Neisseria meningitidis sérologických skupin A, B, C, D, X, Y, Z, W135 a 29E imunizují králíci suspenzí živého kmene Neisseria meningitidis ve fyziologickém roztoku.

Způsob podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že se imunizace králíků provádí dvoufázově v 8 vzestupných dávkách v přesně určených intervalech po dobu 35 dnů, přičemž se první tři dávky aplikují intraperitoneálně a ostatní dávky intravenozně. Potom se 42. den kardiální punkcí odebere veškerá králičí krev a z ní získané sérum se testuje na přítomnost specifických a nespecifických protilátek. Séra musí obsahovat specifické protilátky v ředění nejméně 1:16 až 1:64 (intenzita aglutinace ++), aniž by ovšem obsahovala nespecifické protilátky v tomto ředění.

V referenční laboratoři pro výzkum meningokokových nákaz byl autorkami vynálezu vyvinut originální způsob přípravy antimeningokokových sér imunizací králíků, za použití mezinárodních standardních kmenů mikroorganismu Neisseria meningitidis a jejich kvalita byla porovnávána s některými zahraničními séry. Při všech testech způsob přípravy sér podle vynálezu plně vyhovoval ve všech požadavcích a dosavadní séra předčil svou kvalitou, protože některá současná séra skupiny B neaglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny B a některá séra skupiny A aglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny A jen velmi slabě (intenzita aglutinace +). Antimeningokoková séra připravená podle vynálezu vykazovala v ředění 1:16 až 1:64 pouze specifické aglutinace v intenzitě ++ až +++ a nevykazovala nespecifické aglutinace. Intenzita aglutinace je hodnocena v souladu s předpisy S.Z.O. a označena symboly + až +++ podle velikosti aglutinátů, jejich ohraničenosti a projasnění okolní tekutiny.

Největší přínos způsobu podle vynálezu spočívá v rychlé přípravě všech požadovaných antimeningokokových sér v dostatečném množství a kvalitě pro terénní mikrobiologické laboratoře, kde vzrůstá požadavek na co nejpřesnější a rychlé určování sérologických skupin mikroorganismů Neisseria meningitidis izolovaných z klinického materiálu nemocných. Zavedení způsobu přípravy sér do výroby by ušetřilo devizové prostředky vynakládané na dovoz sér, která někdy bývají nekvalitní, - · ..

V současnosti, kdy není určováno tolik kmenů N. meningitidis, kolik se očekává v budoucnosti při nárůstu jejich izolací, jsou díky nedostatku antimeningokokových sér v praxi identifikovány sérologické skupiny jen u části kmenů N. meningitidis. To zdaleka henf příznivý stav a proto byl vyvinut způsob přípravy antimeningokokových sér podle vynálezu, k_terým lze plně_pokrýt vzrůstající poptávku po kvalitních antimeningokokových sérech a v dostatečném množství z vlastních zdrojů. Zásobení terénních mikrobiologických laboratoří kvaCS 276 340 B6 2 litními antimeningokokovými séry je nezbytné pro sledování dalšího vývoje výskytu meningokokové meningitidy, která má u nás v posledních letech stoupající trend. Znalost převládající sérologické skupiny u kmenů mikroorganismů Neisseria meningitidis izolovaných od nemocných, má přímý dopad na eventuelní .rychlé očkování populace vhodnou meningokokovou vakcinou.

Novost způsobu přípravy antimeningokokových sér podle vynálezu spočívá v krátkodobosti imunizačního schéma, výše imunizačních dávek a používání živého kmene mikroorganismu k imunizaci. Tímto je zajištěno dosažení antimeningokokových sér s dostatečně vysokými titry specifických protilátek a s minimálními nespecifickými reakcemi.

Následující příklad provedení způsobu podle vynálezu pouze dokládá, ale neomezuje.

K imunizaci živých šedých králíků (činčila, 2 až 3 kg, před imunizací vždy 2 až 3 týdny v karanténě) se použily živé kmeny mikroorganismu Neisseria meningitidis, suspendo' Q váné ve fyziologickém roztoku v densitě 10 CFll/1 ml (CFU = colony forming unit = jeden mikroorganismus tvořící jednu kolonii). Kmeny Neisseria meningitidis byly získány z mezinárodní sbírky S.Z.O. Institutu Pasteur ve Francii (dr. 3. Y. Rieu) a jsou uloženy také ve Státní sbírce kultur Institutu hygieny a epidemiologie v Praze (Dr. 3. Šourek). Suspenze mikroorganismu se připravovaly z čerstvých kultur Neisseria meningitidis (18 h), kultivovaných na pevném agarovém médiu (Mueller-Hinton), u nichž byly zkontrolovány antigenní . i biochemické vlastnosti. Suspenze k imunizaci se připravily najednou, rozdělily se do příslušných imunizačních dávek a udržovaly se po celou dobu imunizace v -20 °C. Těsně před imunizací se příslušná dávka nechá rozmrazit a ihned po rozmražení se imunizuje. Zároveň byla zkoušena životnost mikroorganismu (tj. po naočkování králíka toutéž injekční stříkačkou kápnout na kultivační médium). Antimeningokoková séra byla získána podle následujícího imunizačního schéma:

Pořadí dávky Den Dávka suspenze (ml) Aplikace

1.	1.	0,5 Ί
2.	9.	1,0	y intraperitoneálně
3.	15.	2,0
4.	20.	0,5 ”
5.	23.	0,75
6.	28.	' i,o	intravenozně
7.	30.	2,0
8.	35.	2,0^.
	42.	vykrvácení králíka kardiální punkcí

Týden po poslední imunizační dávce se králík vykrvácel kardiální punkcí, krev se zcentrifugovala (2 500 otáček/min, 15 min) a získané sérum se testovalo na přítomnost specifických a nespecifických protilátek referenčními kmeny mikroorganismu Neisseria meningitidis všech serologických skupin (v koncentrovaném séru a v ředění od 1:2 geometrickou řadou). Na základě tohoto testování se určilo ředění každého séra. Kvalitní sérum musí obsahovat specifické protilátky v ředění nejméně 1:16 až 1:64 (intenzita aglutinace ++), aniž by obsahovalo nespecifické protilátky. Séra, která nedosahují uvedený titr specifických protilátek, nebo mají nespecifické protilátky ve vysokém titru, jsou hodnocena jako nekvalitní. U antimeningokokových sér se neprovádí doimunizování králíka (po předběžném otestování séra), protože tímto ještě více stoupají hladiny nespecifických protilátek.

Při několikanásobném ověřování způsobu přípravy antimeningokokových sér podle vynálezu bylo zjištěno a potvrzeno, že séra získaná způsobem podle vynálezu vykazovala dostatečně vysokou hladinu specifických protilátek^ většinou až do ředění 1:64 je u nich aglutinace v intenzitě ++', jen u antisér skupiny B je titr nižší (1:16). Nespecifické protilátky ' se vyskytovaly jen zřídka a v nízkém titru. ~

CS 276 340 B6

Metodou sklíčkové aglutinace byla srovnávána antimeningokoková séra v pracovních ředěních, vyrobená způsobem podle vynálezu, se séry zahraničních firem, která jsou někdy v malém množství dodávána do některých laboratoří. V některých zahraničních soupravách byla nalezena séra skupiny B, která neaglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny B a séra skupiny A, která aglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny A jen velmi slabě (intenzita aglutinace + ).

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy králičích antimeningokokových sér k určení sérologických skupin mikroorganismů metodou sklíčkové aglutinace, vyznačující se tím, že se mezinárodními referenčními kmeny mikroorganismu Neisseria meningitidis sérologických skupin A, B, C, 0, X, Y, Z, W135 .a 29E imunizují králíci pomocí suspenzí živého kmene Neisseria meningitidis ve fyziologickém roztoku.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se imunizace králíků provádí dvoufázově v 8 vzestupných dávkách v intervalech po dobu 35 dnů, přičemž se první tři dávky aplikují intraperitoneálně a ostatní dávky intravenozně, potom se 42. den kardiální punkcí odebere veškerá krev a z ní získané sérum se testuje na přítomnost specifických a nespecifických protilátek, kdy sérum musí obsahovat specifické protilátky v ředění nejméně 1:16 až 1:64, aniž by obsahovalo nespecifické protilátky v tomto ředění.