CS276528B6

CS276528B6 - Inactivated vaccine against viral agents of reproductive disorders in sows and method of its preparation

Info

Publication number: CS276528B6
Application number: CS146790A
Authority: CS
Inventors: Vojtech Mvdr Csc Madr
Original assignee: Vyzk Ustav Vet Lekarstvi
Priority date: 1990-03-27
Filing date: 1990-03-27
Publication date: 1992-06-17
Also published as: CS9001467A2

Abstract

Řešení se týká inaktivované vakcíny proti reprodukčním poruchám u prasnic, charakterizovaných tzv. SMEDI syndromem. Vakcína sestává ze dvou virových složek: parvoviru prasat a enteroviru prasat. Typ enteroviru je volen tak, aby byla zabezpečena imunita proti převalujícímu typu. Vakcína se připravuje tak, že se oba virové antigeny pomnožují izolovaně na primárních buněčných kulturách prasečích ledvin. Pomnožené virové suspenze se klarifikují odstředěním a titrují se na přítomnost viru. K inaktivaci virů se s výhodou používá formalin. Suspenze inaktivovaných antigenů v udržova- ■ cím médiu se mísí s lipoidním adjuvans v poměru: 1 obj. díl inaktivovaného parvoviru, 1 obj. díl inaktivovaného enteroviru a 1 obj. díl lipoidního adjuvans.The solution concerns an inactivated vaccine against reproductive disorders in sows, characterized by the so-called SMEDI syndrome. The vaccine consists of two viral components: porcine parvovirus and porcine enterovirus. The type of enterovirus is chosen to ensure immunity against the prevailing type. The vaccine is prepared by multiplying both viral antigens in isolation on primary cell cultures of porcine kidneys. The multiplied viral suspensions are clarified by centrifugation and titrated for the presence of the virus. Formalin is preferably used to inactivate viruses. The suspension of inactivated antigens in maintenance medium is mixed with a lipoid adjuvant in the ratio: 1 vol. part of inactivated parvovirus, 1 vol. part of inactivated enterovirus and 1 vol. part of lipoid adjuvant.

Description

Předmětem vynálezu Je bivalentní inaktivovaná vakcína proti významným virovým původcům reprodukčních poruch u prasnic, parvoviru a enteroviru, a způsob její přípravy.The present invention provides a bivalent inactivated vaccine against major viral agents of reproductive disorders in sows, parvovirus and enterovirus, and a process for its preparation.

Vakcína Je určena k imunoprofylaxi prasnic proti parvoviru a enteroviru, které Jsou příčinami reprodukčních poruch, charakterizovaných tzv. SMEDI syndromem. Hlavními příznaky syndromu Jsou potraty, odúmrť a mumifikace plodů, rození málo životných selat a následná snížená plodnost. Obranou proti uvedeným infekcím Jsou především humorální protilátky, jejichž tvorbu lze navodit parenterální inokulací inaktivovaných virů, stimulovaných . vhodnými adjuvantii.The vaccine is intended for the immunoprophylaxis of sows against parvovirus and enterovirus, which are the causes of reproductive disorders, characterized by the so-called SMEDI syndrome. The main symptoms of the syndrome are miscarriages, death and mummification of fetuses, the birth of few piglets, and subsequent reduced fertility. The defense against these infections are mainly humoral antibodies, the production of which can be induced by parenteral inoculation of inactivated viruses stimulated. suitable adjuvants.

Imunizace proti parvoviru byla dosud řešena vývojem různých druhů vakcín. Nedostatkem těchto vakcín Je, že zabezpečují ochranu pouze proti Jednomu z původců.Immunization against parvovirus has so far been addressed by the development of various types of vaccines. The disadvantage of these vaccines is that they provide protection only against one of the agents.

Serologickým a virologickým vyšetřením v chovech se zvýšeným výskytem mrtvě rozených selat bylo prokázáno značné rozšíření prasečího enteroviru typu 6.Serological and virological examination in farms with an increased incidence of stillborn piglets has shown a significant spread of porcine enterovirus type 6.

Na základě epizootologických rozborů bylo zjištěno, že se oba viry v chovech prasat vyskytují paralelně a klinické projevy mohou být vyvolány souběžným účinkem obou původců. Vývoj bivalentní vakcíný proti parvoviru a enteroviru, který je cílem vynálezu, je proto motivován snahou o zabezpečení imunoprofylaxe proti SMEDI syndromu v plné šíři.Based on epidemiological analyzes, it was found that both viruses occur in parallel in pig farms and clinical manifestations can be caused by the simultaneous action of both agents. The development of a bivalent parvovirus and enterovirus vaccine which is the object of the invention is therefore motivated by the need to provide full-scale immunoprophylaxis against SMEDI syndrome.

Zárukou splnění uvedeného požadavku je inaktivovaná vakcína proti virovým původcům reprodukčních poruch u prasnic, charakterizovaných SMEDI syndromem, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že inaktivovaná vakcína sestává ze stejných objemových dílů suspenze inaktivovaného parvoviru prasat v udržovacím médiu, suspenze inaktivovaného enteroviru prasat typu 6 v udržovacím médiu a lipoidního adjuvans, obsahujícího ve 100 objemových dílech 5 obj. dílů lipofilního neionogenního tenzidu ze skupiny polyoxyethylenesterů nebo polyoxyethylensorbitanesterů kyseliny laurové, palmitové, stearové nebo olejové, s výhodou polyoxyethýlensorbitanmonooleátu, 45 obj. dílů parafinového oleje a 50 obj. dílů fyziologického roztoku.The inactivated vaccine against viral agents of reproductive disorders in sows characterized by SMEDI syndrome according to the invention guarantees that the inactivated vaccine consists of equal volumes of inactivated swine parvovirus suspension in maintenance medium, inactivated swine enterovirus type 6 suspension. in a maintenance medium and a lipoid adjuvant comprising in 100 parts by volume 5 parts by volume of a lipophilic nonionic surfactant from the group of polyoxyethylene esters or polyoxyethylene sorbitan esters of lauric, palmitic, stearic or oleic acid, preferably polyoxyethylene sorbitan monooleate, 45 parts by volume of paraffin oil and 50 parts by volume of paraffin oil. .

Podstata způsobu přípravy této bivalentní vakcíny, který Je rovněž předmětem vynálezu, spočívá v tom, že se uvedené virové antigeny pomnožují každý zvlášť na primárních buněčných kulturách epitelu prasečích ledvin, známým způsobem klařifikují, inaktivují formalinem a po smísení emulgují v lipoidním adjuvans.The process for the preparation of this bivalent vaccine, which is also the subject of the invention, consists in that said viral antigens are propagated separately on primary cell cultures of porcine kidney epithelium, classified in a known manner, inactivated with formalin and emulsified in lipoid adjuvant after mixing.

Charakteristika použitých virových kmenů: ·Characteristics of virus strains used: ·

Parvovirus 42/82 P byl izolován z placenty prasnice poražené v raném stadiu březosti z chovu s endemickým výskytem reprodukčních poruch. Identifikace viru byla provedena serologicky srovnáním se sbírkovým kmenem parvoviru prasat. Kmenový virus je udržován ve zmrazeném stavu při -70 °C.Parvovirus 42/82 P was isolated from the placenta of a sow slaughtered in early pregnancy from a holding with endemic reproductive disorders. Virus identification was performed serologically by comparison with a porcine parvovirus collection strain. The strain virus is kept frozen at -70 ° C.

Enterovirus 42/82 E byl izolován z fétu prasnice poražené v raném stadiu březosti z chovu s endemickým výskytem reprodukčních poruch. Virus byl serologicky typizován Jako 6. typ prasečího enteroviru. K typizaci byla použita sada typových sér připravených imunizací králíků sbírkovými kmeny prasečích enterovirů. Kmenový virus je udržován ve zmraženém stavu při -70 °C.Enterovirus 42/82 E was isolated from a fetus of a sow slaughtered in the early stages of pregnancy from a holding with an endemic incidence of reproductive disorders. The virus was serologically typed as type 6 porcine enterovirus. A set of type sera prepared by immunizing rabbits with collection strains of porcine enteroviruses was used for typing. The strain virus is kept frozen at -70 ° C.

Množení parvoviru .Reproduction of parvovirus.

Virus je množen na rozrůstajících se primárních kulturách prasečích ledvin. Buňky získané trypsinací fragmentů prasečích ledvin Jsou suspendovány v živném médiu a nasazeny v denzitě 10$ v 1 ccm do kultivačních nádob. Inkubace probíhá v termostatu při +37 °C. Za 24 h jsou kultury kontrolovány pod mikroskopem a pokud jsou na stěně nádob zjišťovány drobné ostrůvky nově narostlých buněk, je kultura vhodná k infekci parvovirem.The virus is propagated on growing primary cultures of pig kidneys. Cells obtained by trypsinization of porcine kidney fragments are suspended in nutrient medium and seeded at a density of 10 at 1 cc in culture dishes. Incubation takes place in a thermostat at +37 ° C. After 24 hours, the cultures are inspected under a microscope, and if small islands of newly grown cells are detected on the wall of the vessels, the culture is suitable for parvovirus infection.

Virus je přímo aplikován do média rozrostlých buněčných kultur v 5%ním objemu kultivačního média. Virus se množí pozvolna, největší koncentrace dosahuje cca po 5 denní inkubaci, kdy se paušálně sklízí. V průběhu inkubace se buněčná kultura postupně rozrůstá a souběžně se virus pomnožuje bez výrazného cytopatogenního efektu. Po skončení inkubace se kultura zmrazí při teplotě nižší než -20 °C. K uvolnění viru se doporučuje kultivační láhve * * . CS 276 528 B6 2The virus is applied directly to the grown cell culture medium in a 5% volume of culture medium. The virus multiplies slowly, reaching its highest concentration after about 5 days of incubation, when it is harvested at a flat rate. During the incubation, the cell culture gradually grows and at the same time the virus multiplies without a significant cytopathogenic effect. At the end of the incubation, the culture is frozen at a temperature below -20 ° C. Culture flasks * * are recommended for virus release. CS 276 528 B6 2

2x až 3x zmrazit a opět rozmrazit, načež se virová suspenze lehce odstředí. Koncentrace viru se stanoví hemaglutinačním testem s morčecími krvinkami. Specifita viru se ověřuje hemaglutiňačně inhibičním testem se sérem monospecificky pozitivním na parvovirus. Virus, který bude zpracován na vakcínu v průběhu 14 dnů lze ponechat v chladírně při +4 °C, při delším skladování se zmražuje na -20 °C.Freeze and thaw again 2 to 3 times, then centrifuge the virus suspension lightly. The virus concentration is determined by a guinea pig blood haemagglutination test. The specificity of the virus is verified by a haemagglutination inhibition test with serum monospecifically positive for parvovirus. The virus, which will be processed into a vaccine within 14 days, can be left in the refrigerator at + 4 ° C, frozen for longer storage at -20 ° C.

Množení enteroviruReproduction of enterovirus

Virus je pomnožován na kompletním porostu buněčné kultury epitelu prasečích ledvin. Buňky získané trypsinací tkáňových fragmentů jsou suspendovány do živného média a nasazeny v denzitě 10$ v 1 ccm do kultivačních nádob. Kultury jsou inkubovány při teplotě 37 °C až do dosažení kompletního porostu na stěně lahví, což bývá obvykle za 4 dny. Živné médium je slito a nahrazeno udržovacím médiem bez séra a kultury jsou připraveny k infekci virem.The virus is propagated on a complete growth of porcine kidney epithelial cell culture. Cells obtained by trypsinizing tissue fragments are suspended in nutrient medium and seeded at a density of 10 at 1 cc in culture dishes. The cultures are incubated at 37 ° C until complete growth is achieved on the bottle wall, which is usually 4 days. The nutrient medium is pooled and replaced with serum-free maintenance medium, and cultures are ready for virus infection.

Virus je inokulován přímo do udržovacího média v množství 2 až 3 % objemu kultivačního média v nádobě.The virus is inoculated directly into the maintenance medium in an amount of 2 to 3% by volume of the culture medium in the vessel.

Enterovirus se vyznačuje rychlým růstem doprovázeným typickým cytopatogenním efektem charakterizovaným zakulacováním buněk a jejich uvolňováním ze skla. Po úplném rozpadu buněčné kultury se lahve s narostlým virem jednou zmrazí na -20 °C a po rozmražení se mírným odstředěním vyčeří. Koncentrace viru v suspenzi je ověřována titrací na primárních buněčných kulturách prasečích ledvin ve zkumavkách. K přípravě vakcíny je vhodný virus o titru minimálně 10’5 ΤΟΠ^θ/Ο,Ι ccm.Enterovirus is characterized by rapid growth accompanied by a typical cytopathogenic effect characterized by the rounding of cells and their release from the glass. After complete disintegration of the cell culture, the flasks with grown virus are frozen once at -20 ° C and, after thawing, clarified by gentle centrifugation. The concentration of virus in the suspension is verified by titration on primary cell cultures of pig kidneys in test tubes. A virus with a titre of at least 10'5 ΤΟΠ ^ θ / Ο, Ι ccm is suitable for the preparation of the vaccine.

Specifita viru se ověřuje seroneutralizačním testem se specifickým sérem na prasečí enterovirus typu 6. Vytitrovaný virus s ověřenou sterilitou a specifitou je připraven k výrobě vakcíny. Virus lze skladovat 14 dnů při teplotě +2 °C, při delším skladování,se doporučuje zmrazit při -20 °C. ’The specificity of the virus is verified by a seroneutralization test with specific serum for porcine enterovirus type 6. The titrated virus with verified sterility and specificity is ready for vaccine production. The virus can be stored for 14 days at +2 ° C, for longer storage, it is recommended to freeze at -20 ° C. ’

Příprava vakcínyVaccine preparation

Inaktivace parvoviru a enteroviru probíhá odděleně. K virovým suspenzím se za stálého míchání pozvolna přidává při pokojové teplotě zředěný formalin (10 %), a to na 100 ml virové suspenze 1 ccm zředěného formalínu tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace formalínu 0,1 %. Inaktivace probíhá při pokojové teplotě 5 až 6 h. Potom se virová suspenze uloží do lednice při +2 °C.Inactivation of parvovirus and enterovirus is performed separately. Diluted formalin (10%) is slowly added to the virus suspensions with stirring at room temperature (100%) per 100 ml of virus suspension of 1 cc of diluted formalin to give a final formalin concentration of 0.1%. Inactivation takes place at room temperature for 5 to 6 hours. The virus suspension is then stored in a refrigerator at + 2 ° C.

Po 3 denní inkubaci při teplotě +2 °C se ověřuje, zda buněčné suspenze neobsahují rezidua živého viru. Inokulací buněčných kultur se ověřuje absence enteroviru a hemaglutinačním testem s morčecími krvinkami absence parvoviru.After 3 days of incubation at + 2 ° C, the cell suspensions are checked for live virus residues. Inoculation of cell cultures verifies the absence of enterovirus and the haemagglutination test with guinea pig blood cells verifies the absence of parvovirus.

K přípravě bivalentní vakcíny se míchá:To prepare the bivalent vaccine, mix:

díl inaktivovaného parvoviru díl inaktivovaného enteroviru díl lipoidního adjuvantiapart of inactivated parvovirus part of inactivated enterovirus part of lipoid adjuvant

Směsi se míchají při pokojové teplotě 4 až 6 h. Potom.se vakcína uloží do chladírny při teplotě +2 °C. Vakcína má vzhled homogenní šedobílé emulze, její konzistence se nemění ani po několikaměsíčním skladování.The mixtures are stirred at room temperature for 4 to 6 hours. The vaccine is then stored in a refrigerator at + 2 ° C. The vaccine has the appearance of a homogeneous gray-white emulsion, its consistency does not change even after several months of storage.

U vakcíny se provádí tyto zkoušky:The following tests are performed on the vaccine:

Zkouška sterility . .Sterility test. .

Vakcína se naočkuje na plotny krevního agaru a do tekutého živného média. Po přiměřené délce inkubace se nesmí vyskytnout bakteriální a plísňové kontaminace.The vaccine is inoculated onto blood agar plates and liquid nutrient medium. Bacterial and fungal contamination must not occur after a reasonable length of incubation.

Zkouška neškodnosti . Zkouška neškodnosti se provádí na dvou odstavených selatech. Selata se očkují dávkou a 3 ccm intramuskulárně. Po naočkování se selata klinicky sledují 10 dní. Během pozorovací doby nesmí dojít ke zvýšení teploty a ke zhoršení zdravotního stavu.Harmlessness test. The safety test is performed on two weaned piglets. Piglets are vaccinated with a dose and 3 cc intramuscularly. After inoculation, the piglets are monitored clinically for 10 days. During the observation period, there must be no increase in temperature or deterioration of health.

Zkouška účinnosti ' *»Efficiency test '* »

CS 276 528 B6CS 276 528 B6

Doporučuje se provádět na skupině 4 až 6 králíků. Králíci jsou imunizováni a 1 ml a po 14 dnech revakcinováni stejnou dávkou. Za 10 dní po revakcinaci se odebere krev pro serologické vyšetření specifických protilátek. Imunita proti enteroviru je dostačující pokud seroneutralizační titr dosáhne minimální hodnoty 1 : 128. Imunita proti parvoviru je dostačující pokud u poloviny imunizovaných králíků dosáhne hemaglutinačně inhibiční titr minimální hodnoty 1 : 32.It is recommended to perform on a group of 4 to 6 rabbits. Rabbits are immunized with 1 ml and revaccinated after 14 days with the same dose. Blood is collected 10 days after revaccination for serological examination of specific antibodies. Immunity to enterovirus is sufficient if the seroneutralization titre reaches a minimum of 1:12. Immunity to parvovirus is sufficient if half of the immunized rabbits reach a minimum of 1:32 in the haemagglutination inhibition titre.

Pozn. Tvorba protilátek proti parvoviru prasat u králíků je relativně nižší než proti enteroviru.Note The production of antibodies against porcine parvovirus in rabbits is relatively lower than against enterovirus.

Délka exspirace vakcíny je 8 měsíců od data výroby, za předpokladu, že byla uložena při teplotě +2 až 4 °C.The expiration date of the vaccine is 8 months from the date of manufacture, provided that it has been stored at +2 to 4 ° C.

Claims

PATENT CLAIMS

An inactivated vaccine against viral agents of reproductive disorders in sows characterized by SMEDI syndrome, characterized in that it consists of equal volumes of a suspension of inactivated porcine parvovirus in maintenance medium, a suspension of inactivated porcine enterovirus type 6 in maintenance medium and a lipoid adjuvant comprising in 100 5 parts by volume of lipophilic nonionic surfactants from the group of polyoxyethylene esters or polyoxyethylene sorbitan estenes of lauric, palmitic, stearic or oleic acid, preferably polyoxyethylene sorbitan monooleate, 45 parts by volume of paraffin oil and 50 parts by volume of physiological saline. ‘

A method for preparing a vaccine according to claim 1, characterized in that said viral antigens are each propagated separately on primary cell cultures of porcine kidney epithelium, clarified in a known manner, inactivated with formalin and emulsified in a lipoid adjuvant after mixing.