CS277068B6

CS277068B6 - A method of isolating human hypophyseal prolactin

Info

Publication number: CS277068B6
Application number: CS897294A
Authority: CS
Inventors: Radovan Mudr Lomsky; Jaroslava Rndr Pribysova
Original assignee: Lomsky Radovan; Jaroslava Rndr Pribysova
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1992-11-18
Also published as: CS729489A3

Abstract

Řešení se týká způsobu isolace vysoce purifikovaného lidského hypofysárního prolaktinu o vysoké specifické aktivitě gelovou filtrací a chromatografií na iontoměničích. Podstata řešení spočívá v tom, že hypofysárni extrakt čistí gelovou filtrační chro- , matografií na polymerisovaném dextranu s frakcionačním rozmezím 4 000 - 150 000 daltonú, po niž následuje anexová chromatografie na eelulose se substituovanými diethylaminoethylovými iontovými skupinami za použití eluce s konvexním gradientem koncentrace NaCl, katexová chromatografie na zesilované agarose se substituovanými karboxymethylovými iontovými skupinami za použití eluce s lineárním gradientem koncentrace NaCl a konečně gelová filtrace na polymerisovaném dextranu s frakcionačním rozmezím 4 000 až 150 000 daltonú a velikostí částic 10 až 40 pm.The solution relates to a method for isolating highly purified human pituitary prolactin with high specific activity by gel filtration and ion exchange chromatography. The essence of the solution lies in the fact that the pituitary extract is purified by gel filtration chromatography on polymerized dextran with a fractionation range of 4,000 - 150,000 daltons, followed by anion exchange chromatography on cellulose with substituted diethylaminoethyl ion groups using elution with a convex NaCl concentration gradient, cation exchange chromatography on cross-linked agarose with substituted carboxymethyl ion groups using elution with a linear NaCl concentration gradient and finally gel filtration on polymerized dextran with a fractionation range of 4,000 to 150,000 daltons and a particle size of 10 to 40 pm.

Description

Vynález se týká způsobu isolace vysoce purifikováného lidského hypofysárního prolaktinu (hPRL) z hypofys o specifické aktivitě vyšší než u dosud známých metod isolace.The present invention relates to a method for isolating highly purified human pituitary prolactin (hPRL) from the pituitary gland with a specific activity higher than previously known isolation methods.

Dosud se hPRL isoloval z extraktů lidských hypofys bud kombinací gelové filtrace na polymerisovaném dextranu s frakcionačním rozmezím 4 000 až 150 000 daltonů a ionexových chromatografii postupně na celulose se substituovanými diethylaminoethylovými a potom karboxymethylovými iontovými skupinami za použití stupňovité eluce s diskontinuálně stoupajícími koncentracemi chloridu sodného (P. Hwang et al.. J. Clin. Endocrinol. Metab. 36: 1 110 až 1 118, 1973), nebo postupnými chromatografiemi, jež zahrnovaly gelovou filtraci na zesítované agarose, chromatografii s hydrofobni interakcí na agarose se substituovanými fenylovými skupinami, gelovou filtraci na polymerisovaném dextranu s frakcionačním rozmezím 4 000-150 000 daltonů a ionexovou chromatografii na agarose se substituovanými diethylaminoethylovými skupinami (P. Roos et al.. Biochim. Biophys. Acta 588: 368 až 379, 1979), nebo kombinaci chromatografie s hydrofobni interakcí na zesítované agarose se substituovanými fenylovými skupinami s následnou anexovou chromatografii na celulose se substituovanými diethylaminoethylovými iontovými skupinami za přítomnosti acetonitrilu (S. C. Hodgkinson a P. J. Lowry: Biochem. J. 199: 619 až 627, 1981). Preparáty, získané těmito technikami, jsou komerčně dostupné a jejich specifická aktivita v systému radioimunoanalysy (RIA) se pohybuje při vztažení na mezinárodní standard Světové zdravotnické organizace (WHO) IRP No. 75/504 na úrovni přibližně 30 mezinárodních jednotek na 1 mg isolované substance hPRL.To date, hPRL has been isolated from human pituitary extracts by a combination of gel filtration on polymerized dextran with a fractionation range of 4,000 to 150,000 daltons and ion exchange chromatography sequentially on cellulose with substituted diethylaminoethyl and then carboxymethyl ion groups using stepwise elution with discontinuous sodium chloride concentrations. Hwang et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 36: 1110-1118, 1973), or by sequential chromatography, which included gel filtration on cross-linked agarose, hydrophobic interaction chromatography on agarose with substituted phenyl groups, gel filtration on polymerized dextran with a fractionation range of 4,000-150,000 daltons and ion exchange chromatography on agarose with substituted diethylaminoethyl groups (P. Roos et al., Biochim. Biophys. Acta 588: 368-379, 1979), or a combination of hydrophobic interaction chromatography on crosslinked agarose with substituted phenyl groups with followed by anion exchange chromatography on cellulose with substituted diethylaminoethyl ion groups in the presence of acetonitrile (S. C. Hodgkinson and P. J. Lowry: Biochem. J. 199: 619-627, 1981). The preparations obtained by these techniques are commercially available and their specific activity in the radioimmunoassay system (RIA) is in relation to the international standard of the World Health Organization (WHO) IRP No. 75/504 at a level of approximately 30 international units per 1 mg of isolated hPRL substance.

Úkolem vynálezu bylo optimalisovat sled jednotlivých typů chromatografii a optimalisovat eluční podmínky při těchto chromatografiích tak, aby byl získán hPRL s nejvyšší možnou specifickou aktivitou, tj. specifickou aktivitou vyšší než u dosud známých metod isolace. Vysoká specifická aktivita hPRL, jež je podmíněna zejména odstraněním jiných kontaminujících proteinů a čistotou konečného preparátu hPRL, je totiž nezbytnou podmínkou pro přípravu vysoce specifických antisér pro diagnostickou radioimunoanalysu (RIA) a pro použití hPRL při značkování radioaktivním jodem 125-1 v systému RIA.The object of the invention was to optimize the sequence of individual types of chromatography and to optimize the elution conditions in these chromatographies so as to obtain hPRL with the highest possible specific activity, i.e. a specific activity higher than in the known isolation methods. The high specific activity of hPRL, which is mainly due to the removal of other contaminating proteins and the purity of the final hPRL preparation, is a necessary condition for the preparation of highly specific antisera for diagnostic radioimmunoassay (RIA) and for the use of hPRL in 125-1 iodine labeling in the RIA system.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že se při ionexových chromatografiích používá k eluci navázaného hPRL kontinuálních gradientů koncentrace elučního pufru místo dosud používaných diskontinuálních gradientů, takže se dosáhne podstatně lepšího oddělení materiálu s obsahem hPRL od nečistot, a že se na závěr purifikace připojí gelová filtrace na polymerovaném dextranu s velikostí částic 10 až 40 μm a s frakcionačním rozmezím 4 000 až 150 000 daltonů. Výhoda tohoto postupu spočívá v tom, že má isolovaný hPRL nejvyšší dosud známou specifickou aktivitr_u tj. nejvyšší obsah mezinárodních jednotek na jednotku hmotnosti.The invention is based on the fact that ion exchange chromatography uses elution buffer concentrations instead of the discontinuous gradients used to elute bound hPRL continuous gradients, so that substantially better separation of the hPRL-containing material from impurities is achieved and gel filtration is added at the end of purification. polymerized dextran with a particle size of 10 to 40 μm and a fractionation range of 4,000 to 150,000 daltons. The advantage of this method is that it has been isolated hPRL highest known specifically _for aktivitr i.e. the highest content of international units per unit weight.

Při isolacích byly jednotlivé purifikační kroky prováděny na různých typech chromatografického zařízení.In the isolations, the individual purification steps were performed on different types of chromatographic equipment.

Konkrétní provedení vynálezu začíná homogenisací 600 zmrazených lidských hypofys v 600 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,7. Homogenát se extrahuje v tomto pufru za stálého míchání po dobu 2 hodin. Po centrifugaci a slití supernatantu se získaný sediment homogenisuje a extrahuje za stejných podmínek ještě dvakrát. Spojené supernatanty se upraví na pH 6,3 pomocí 50% kyseliny octové a suspense se ponechá při 4 °C po dobu 16 hodin. Po centrifugaci se supernatant s vysokým obsahem lidského růstového hormonu (hGH) uschová jako zdroj pro isolaci terapeuticky použitelného hGH. Sediment s vysokým obsahem hPRL se rozsuspenduje v 500 ml vody a pH suspense se upraví na 10,5 pomocí 1M NaOH. Směs se míchá 16 hodin při 4 °C. Po centrifugaci se pH superenatantu upraví na 8,5 pomocí 5M HCI a přidá se postupně absolutní ethanol do konečné koncentrace 25%. Vzniklý precipitát se odstraní centrifugaci a vyhodí. K supernatantu se přidá postupně další absolutní ethanol do konečné koncentrace 85%. Směs se ponechá přes noc při 4 °C. Druhý den se suspense centrifuguje, supernatant se vyhodí a sediment se rozpustí ve 200 ml 100 mM NaOH a pH roztoku se upraví pomocí 1M HCI na pH 10,0. Nepatrný nerozpuštěný zbytek se oddělí centrifugaci a superenatant se nanese na sloupec polymerisovaného dextranu s frakcionačním rozmezím 4 000 až 150 000 daltonů, ekvilibrovaného v pufru 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Frakce s obsahem hPRL jsou slity a aplikovány na sloupec celulosy se substituovanými diethylaminoethylovými iontovými skupinami, ekvilibrované stejným pufrem jako předtím polymerisovaný dextran. Po promytí lože gelu asi 500 ml startovního pufru následuje eluce za použití konvexního gradientu koncentrace NaCl tak, že mísící nádobka obsahuje 1 000 ml pufru 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, a reservoár obsahuje 1 000 ml stejného pufru s obsahem 120 mM NaCl. Frakce s obsahem HPRL se spojí a naředí vodou tak, aby byla absorbance roztoku v kyvetách o šířce 1 cm při 280 nm menší než 0,5. pH se potom upraví zředěnou kyselinou octovou na 5,6. Vzorek se aplikuje na sloupec zesilované agarosy se substituovanými karboxymethylovými iontovými skupinami, ekvilibrované v 10 mM pufru octanu amonného, pH 5,6. Po promytí dvěma objemy startovního pufru následuje eluce za použití lineárního gradientu koncentrace NaCl tak, že mísící nádobka obsahuje 360 ml 10 mM pufru octanu amonného a reservoár obsahuje 360 ml stejného pufru s obsahem 500 mM NaCl. Oba pufry mají pH 5,6. Efluent z chromatografie je ihned upraven 1M Trisem na pH 8 až 9, frakce s obsahem hPRL se koncentrují ultrafiltrací za použití membrány s retenčním limitem 10 000 daltonů a vzorek se aplikuje na sloupec polymerisovaného dextranu o velikosti částic 10 až 40 μm s frakcionačním rozmezím 4 000 až 150 000 daltonů, ekvilibrováného ve 100 mM kyselém uhličitanu amonném. Střed vrcholu s obsahem hPRL se lyofilisuje. V průběhu všech chromatografií jsou frakce s obsahem hPRL identifikovány RIA systémem pro stanovení hPRL. hPRL isolovaný výše popsanou metodologií je zcela homogenní při analytických elektroforesách v polyakrylamidu v kyselém i v alkalickém prostředí a také při elektroforese v polyakrylamidu za přítomnosti sodiumdodecylsulfátu (SDS). Takto isolovaný hPRL má specifickou aktivitu 36 až 43 mezinárodních jednotek v 1 mg isolované substance, tj. nejvyšší dosud dosaženou specifickou aktivitu. .A particular embodiment of the invention begins by homogenizing 600 frozen human pituitary glands in 600 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 8.7. The homogenate is extracted in this buffer with stirring for 2 hours. After centrifugation and decantation of the supernatant, the sediment obtained is homogenized and extracted twice more under the same conditions. The combined supernatants were adjusted to pH 6.3 with 50% acetic acid and the suspension was left at 4 ° C for 16 hours. After centrifugation, the supernatant high in human growth hormone (hGH) is stored as a source for isolating therapeutically useful hGH. The high hPRL sediment was suspended in 500 ml of water and the pH of the suspension was adjusted to 10.5 with 1M NaOH. The mixture was stirred at 4 ° C for 16 hours. After centrifugation, the pH of the superenatant was adjusted to 8.5 with 5M HCl and absolute ethanol was gradually added to a final concentration of 25%. The precipitate formed is removed by centrifugation and discarded. Additional absolute ethanol is gradually added to the supernatant to a final concentration of 85%. The mixture was left overnight at 4 ° C. The next day, the suspension is centrifuged, the supernatant is discarded and the sediment is dissolved in 200 ml of 100 mM NaOH and the pH of the solution is adjusted to pH 10.0 with 1M HCl. A small undissolved residue was separated by centrifugation and the superenatant was applied to a column of polymerized dextran with a fractionation range of 4,000 to 150,000 daltons, equilibrated in 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5. The hPRL-containing fractions are pooled and applied to a cellulose column with substituted diethylaminoethyl ion groups, equilibrated with the same buffer as the previously polymerized dextran. After washing the gel bed with about 500 ml of starting buffer, elution is performed using a convex NaCl concentration gradient so that the mixing vessel contains 1,000 ml of 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, and the reservoir contains 1,000 ml of the same 120 mM buffer. NaCl. The HPRL-containing fractions are combined and diluted with water so that the absorbance of the solution in 1 cm wide cuvettes at 280 nm is less than 0.5. The pH is then adjusted to 5.6 with dilute acetic acid. The sample is applied to a column of cross-linked agarose with substituted carboxymethyl ion groups, equilibrated in 10 mM ammonium acetate buffer, pH 5.6. Washing with two volumes of starting buffer is followed by elution using a linear gradient of NaCl concentration so that the mixing vessel contains 360 ml of 10 mM ammonium acetate buffer and the reservoir contains 360 ml of the same buffer containing 500 mM NaCl. Both buffers have a pH of 5.6. The chromatographic effluent is immediately adjusted to pH 8-9 with 1M Tris, the hPRL fractions are concentrated by ultrafiltration using a membrane with a retention limit of 10,000 daltons and the sample is applied to a column of polymerized dextran with a particle size of 10-40 μm with a fractionation range of 4,000 up to 150,000 daltons, equilibrated in 100 mM ammonium bicarbonate. The center of the hPRL-containing peak is lyophilized. During all chromatographies, the hPRL-containing fractions are identified by the RIA system for the determination of hPRL. hPRL isolated by the methodology described above is completely homogeneous by analytical electrophoresis in polyacrylamide in both acidic and alkaline media and also by electrophoresis in polyacrylamide in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). The hPRL thus isolated has a specific activity of 36 to 43 international units in 1 mg of isolated substance, i.e. the highest specific activity achieved so far. .

Substance hPRL byla použita pro přípravu králičích antisér proti hPRL, pro značkování hPRL radiojodem 125-1 a pro konstrukci kalibrační křivky v systému RIA, určeném pro diagnostické stanovení hladin hPRL v krevním séru žen s nejrůznějšími typy gynekologicko-endokrinologických onemocnění.The hPRL substance was used to prepare rabbit antisera against hPRL, to label hPRL with 125-1 radioiodine, and to construct a calibration curve in an RIA system for the diagnostic determination of hPRL levels in the blood serum of women with various types of gynecological and endocrine diseases.

Claims

PATENT CLAIMS

Process for the isolation of human pituitary prolactin with high specific activity by gel filtration and ion exchange chromatography, characterized in that the pituitary extract is purified by gel filtration on polymerized dextran with a fractionation range of 4,000 to 150,000 daltons, followed by anion exchange chromatography on cellulose with substituted diethylaminoethyl ion groups using elution with a convex NaCl concentration gradient followed by cation exchange chromatography on agarose with substituted carboxymethyl ion groups using elution with a linear NaCl concentration gradient followed by gel filtration on polymerized dextran with a particle size of 10 to 40 μm with a fractionation range 4,000 to 150,000 daltons, followed by lyophilization.