CS277650B6

CS277650B6 - Combination preparation with anti-thrombotic effect

Info

Publication number: CS277650B6
Application number: CS904726A
Authority: CS
Inventors: Werner Witt; Berthold Baldus; Bernd Dr Muller; Claus-Steffen Dr Sturzebecher; Werner Dr Skuballa
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 1993-03-17
Also published as: AU640692B2; EP0420368A1; NO921223D0; EP0420368B1; DD299153A5; DK0420368T3; CA2069296C; JPH05500805A; PT95456A; AU6419090A; US5093325A; HU9201045D0; DE3933027A1; ZA907808B; IL95849A; NZ235521A; IL95849A0; NO921223L; PT95456B; ES2058771T3

Description

Vynález se týká přípravku k inhibici funkce trombocytů a k léčení trombosy, obsahujícího deriváty karbacyklinu cikaprost nebo eptaloprost a kyselinu acetylsalicylovou (KAS).

Při'arterialní a s určitým omezením také při venosní trombogenesi hraje aktivace trombocytů s následnou agregací ústřední roli. Tuto aktivaci destiček působí stimuly, které mohou nastat při poškození cévních stěn a při aktivaci srážlivosti, jako například trombinem, kolagenem, adenosindifosfátem, adrenalinem nebo destičky aktivujícím faktorem (PAF). Tyto stimuly působí vedle agregace současně uvolňování látek z trombocytů, které jsou obsažené v tak zvané granule trombocytů. Některé z těchto látek, jako plasminogenní aktivátor inhibice-1 (PAI-1) nebo platelet-derived-vzrůstový faktor (PDGF) mají pravděpodobně zvláštní význam pro pathogenesi tromboticky aterosklerotických onemocnění.

Tak je PAI-1 potentní inhibitor plasmogenních aktivátorů jako urokinasy a t-PA a inhibuje touto vlastností fibrinolysu nutnou pro obnovu prokrvení po trombotickém uzávěru. PDGF je mitogen, který stimuluje chorobné tvoření různých buněčných typů .(zvláště buněk hladkého svalstva). Na základě tohoto mechanismu še PDGF připisuje v arterogenesi klíčová role.. Inhibice nejen agregace trombocytů ale i uvolňování patogenních látek jako PAI-1 a PDGF by mohla být důležitým příspěvkem pro profylaxi tromboembolickýcha aterosklerotických onemocnění.

Kyselina acetylsalicylová známá jako inhibitor agregace trombocytů je pouze slabá inhibiční látka pro funkci trombocytů a také pouze slabé- antitrombotikum. Jako cyklooxygenasní inhibitor inhibuje kyselina acetylsalicylová pouze jednu aktivační cestu trombocytů, vznik tromboxanu. Navíc se kyselinou acetylsalicylovou v cévách inhibuje vznik prostacyklinu,' přirozené inhibiční látky tvorby trombocytů. Proto není terapeutická účinnost kyseliny acetylsalicylové pro léčení tromboembolických druhů nemocí dostatečná.

Mimetika přírodního prostacyklinu, jako jmenované deriváty karbacyklinu se používají pro klinické použití v orální formě. Platí jako inhibitory všech podstatných aktivačních cest trombocytů a jako silné inhibitory tvorby trombocytů a jako antitrombotika. Navíc mají ještě další vlastnosti, jako například schopnost relaxace hladké cévní muskulatur, která podporuje jejích terapeutický účinek při určitých formách nemoci.

Při vyšším dávkování vystupuje do popředí pro látkovou třídu karbacyklinů charakteristický profil vedlejších účinků, čímž je použitelná výše dávek limitována a plné klinické využití inhibičního účinku pro funkci trombocytů a antitrombotického účinku je omezené.

Nyní bylo překvapivě nalezeno, že kombinační přípravky z cikaprostu a kyseliny acetylsalicylové a z eptaloprostu a kyseliny acetylsalicylové v různých biologických systémech působí synergicky nebo mají kooperativní efekty jednotlivých účinných látek.

Obě kombinace předčí například sílu antitrombotického účinku kyseliny acetylsalicylové a dovolují značnou redukci dávek pro trombocyty inhibující část karbacyklinu ve srování s ekvipotentními dávkami samostatně podávaného karbacyklinu . (cikaprost eptaloprost) o faktor až 10.

Tím jsou kombinace silnějšími inhibitory trombocytů a silnějšími antitrombotickými prostředky než kyselina acetylsalicylová s vyšší specifičností a terapeutickou šíří ve srovnání s cikaprostem/eptaloprostem, kooperativním zesílením jejich trombocytární účinné komponenty. Žaludečné protektivními vlastnostmi karbacyklinů se snižují nežádoucí gastrointestinální vedlejší účinky vyvolávané kyselinou acetylsylicylovou.

Vynález se tedy týká kombinačního přípravku z kyseliny acetylsalicylové a cikaprostu nebo eptaloprostu, přičemž karbacykliny se také mohou používat ve formě svých adičních solí s fysiologicky snášelnlivými bázemi nebo jejich klatraty s cyklodextriny, jakož i léčiv s obvyklými pomocnými a nosnými látkami k inhibici funkce trombocytů a k léčení trombosy.

Eptaloprost [(5E)-(16S)-13,14-didehydro-la,lb-dihomo-16,20. -dimethyl-3-oxa-18,18,19,19-tetradehydro-6a-karbaprostaglandin—1₂] á jeho β-cykíodextrinklatrát sě mohou vyrobit následovně:

Ke směsi 6,9 g 2-[(E)-(1S,5S,6S,7R)-7-(dimethyl-terc.butylsilyl-oxy)-6-[(3S,4S)-3-(dimethyl-terc. butylsilyloxy)-4-methyl-nona-1,6-diinyl]-bicyklo[3.3.0]oktan-3-yliden]-ethan-l-olu (W. Skuballa, E. Schillinger, C. S. Sturzebecher, H. Vorbrúggen, J. Medicinal Chemistry 29, 313 (1986); v tom popsaná jako sloučenina 15a) a 11,5 g trimethyl-ortho-brombutyratu se přidá 17,2 ml 50% louhu sodného a 337 mg tetrabutylamoniumhydrosíranu a míchá se 16 hodin při 22 ’C pod argonem. Potom se při chlazení ledovou vodou zředí 20 ml vody a 10% roztokem kyseliny citrónové se okyselí na pH 5. Extrahuje se třikrát vždy 300 ml, etheru, organická fáze se jednou promyje 200 ml solného roztoku, suší se síranem hořečnatým a odpaří ve vakuu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu směsí hexan/ether (8:2) a získá 7,6 g (5E)-(16S)-13,14-didehydro-la,lb-dihomo-16,20-dimethyl-3-oxa-18,18,

19,19-tetradehydro-6a-karbaprostaglandin-I₂-methylester-ll,15-bis-(dimethyl-terc.butyl-etheru) jako bezbarvý olej.

IČ(CHC1₃): 2953, 2925, 2859, 2230, 1730, 1250, 838 cm“¹

K silyletherovému štěpení se míchá 7,25 g shora popsaného bissilyletheru 48 hodin při 24 °C s 600 mi směsi kyselina octová/voda/tetrahydrofuran (65+35+10). Potom se odpaří ve vakuu a zbytek se chromatografuje na silikagelu. Směsí acetát/hexan (3+2) se získá 3,9 g (5E)-(16S)-13,14-didehydro-la,lb-dihomo-16,20-dimethyl-3-oxa-18,18,19,19-tetradehydro-6a-karbapros+:?glandin-I₂-methylesteru jako bezbarvý olej.

IČ(CHC1₃): 3400 (široké), 2935, 2865, 2230, 1735 cm^-1.

Ke zmýdelnění se míchá roztok 3,66 g dříve vyrobeného methylesteru ve 35 ml methanolu s 35 ml 0,5 molárního louhu sodného, 30 minut při 24 °C pod argonem. Potom se zředí 20 ml vody, okyselí 20% roztokem kyseliny citrónové na pH 2, extrahuje se čtyřikrát vždy 100 ml methylenchloridu, organická fáze se jednou promyje 50 ml solného roztoku, suší se síranem sodným a odpaří ve vakuu. Zbytek se chromatografuje acetátem na silikagelu. Při tom se obdrží 3,4 g sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvý olej.

IČ(CHC1₃): 3400 (Široké), 2962, 2940, 2865, 2230, 1722 cm“¹.

β-Cyklodextrinklatrát (5E)-(16S)-13,14-didehydro-la,1b-dihomo-16,20-dimethyl-3-oxa-18,18,19,19-tetra-dehydro-6a-karbaprostaglandinu-I₂.

41,75 g β-cyklodextrinu se rozpustí v 298 ml vody při 80 °C a během 15 minut se přikape roztok 1,5 g (5E)-(16S)-13,14-didehydro-la,lb-dihomo-16,20-dimethyl-3-oxa-18,18,19,19-tetradehydro-6a-karba-prostaglandinu-I₂ ve 24 ml ethanolu. Míchá se 4 hodiny při 60 °C a potom se za míchání nechá přes noc zchladit. Vypadlá pevná látka se odsaje, promyje se 50 ml směsi voda-ethanol (1:1) a 24 hodin se při 13,3 Pa a 25 °C suší oxidem fosforečným. Získá se 38 g volně tekoucích krystalů β-cyklodextrinklatrátu o.a. analogu karbacyklinu. Obsah analogu karbacyklinu v klatrátu se určí titrací. a činí 3,3 %.

Cikaprost a jeho β-cyklodextrinklatrát se mohou vyrobit postupem popsaným v EP-PS 119 949 a v mezinárodním zveřejňovacím spise WO 87/05294.

K tvorbě solí jsou vhodné anorganické a organické báze, jak jsou odborníkům známé k tvorbě fysiologicky snášenlivých solí. Příkladně je možné jmenovat hydroxidy alkalických kovů, jako hydroxid sodný a hydroxid draselný, hydroxidy alkalických zemin jako hydroxid vápenatý, amoniak, aminy, jako ethanolamin, diethanolamin, triethanolamin, N-methylglukamin, morfolin, tris-(hydromethyl)methylamin atd. Výhodný cyklodextrin pro tvorbu klatrátu je β-cyklodextrin.

Kyselina acetylsalicylová a jmenované karbacykliny se nasazují v množství, která jsou pod množstvím jinak obvyklým pro jednotlivé látky kombinace. Množství- odpovídající předloženému vynálezu závisí na rozsahu trombosy.

Kombinace podle vynálezu se výhodně podává orálně, kyselina acetylsalicylová a karbacyklin jsou ve hmotnostním poměru

1:5.10^-6 až 1:1, přičemž dávkovači jednotka karbacyklinu činí 1-1000 μg a dávkovači jednotka kyseliny acetylsalicylové činí 1-500 mg.

Příklad 1

Lidské plasma bohaté na destičky (PRP) se při 37 ^eC inkubuje v agregometru a k vyvolání agregace se přidají 3 ng/ml kolagenu. Cikaprost a kyselina acetylsalicylová jakož i kombinace obou látek se k násadě pipetují 1 minutu před přidáním aktivátoru kolagenu. Průběh agregace se registruje v agregometru. 10 minut po přidání kolagenu se vzorky odstředí při 3000 opm a kapalina nad usazeninou‘se pomocí ELISA testu (enzyme linked immunosorbent assay) testuje na obsah plasmogenního aktivátoru inhibice-1

I

CS 277650 Ββ (PAI-1) a pomocí RIA testu (radio-immuno-assay) na obsah růstového faktoru krevních destiček (pateled-derived growth faktor) (PDGF).

Výsledky:

Koncentrace 10~¹⁰ popř. ΙΟ⁹ M cikaprostu, samy neúčinné, vedou v kombinaci s rovněž neúčinnými popř. slabě účinnými koncentracemi 3xl0^-5, 10^-4 a 3xl0⁴ M kyseliny acetylsalicylové k 42%, 71% a 91% inhibici agregace trombocytů (tabulka 1). Vyčerpání PAI-1 se při stejných koncentracích inhibitoru inhibuje ze 36 %, 54 % a 64 %, uvolňování PDGF z 24%, 42 % a 55 %. Účinek kombinace cikaprost/kyselina acetylsalicylové je přiměřeně definici M. C. Berenbauma (Clin. exp. Immunol. 28:1-18, 1977) synergický.

Tabulka 1

Inhibice agregace jakož i PAI-1 a PDGF

Uvolňování kolagenem stimulovaných lidských trombocytů v % kontrolní reakce (N = 6) . % Inhibice

	10“¹⁰M	Agregace	PAI-1	L '	PDGF
cikaprost	4	+	3	0	+	8	1	+	2
	10“⁹M	0	+	3	0	+	12	3	+	3
	. io⁸m	95	+	4	72	+	3	⁸¹	+	3
	io⁷m	95	+	3	80	+	5	81	+ '	1
KAS	3x10~⁵M	2	+	1	6	+	10	8	+	2
	io^_4m	9	±	3	10	+	8	26	+	6
	3x10“⁴M	30	+	6	28	+	4	39	+	2
	io³m	46	+	6	27	+	10	47	+	4
cikaprost	10~¹⁰M
+ KAS	3xl0^_SM	42^a	+	17	36	+	14	24	+	10
cikaprost	io“⁹m
+ KAS	io“⁴m	71^a	+	12	54^a	+	9	42	+	8
cikaprost	io“⁹m
+ KAS	3x10⁴M	91^a	+	2	64^a	±	5	55^a	+	6
a signifikantní	vůči jednotlivým dávkám	KAS	a	cika	prostu (	> 5%,

řadový sumární test)

Příklad 2

U narkotisovaných morčat se injekcí kolagenu (40 g/Kg i. v.) vyvolá vratná trombocytopenie. Příčinou této trombocytopenie je agrogace kolagenem stimulovaných krevních destiček a embolisace těchto destičkových agregátů do plic, kde pak zůstanou zablokované a tak působí pozorovaný úbytek počtu destiček v krvi (trombocytopenie). Za kontrolních podmínek konstantní trombocytopenie (v průměru 40 % úbytku z počtu

I destiček právě existujícího basálního nivo) slouží jako míra intravasalní destičkové agregace.

Dávka 1 ng/kg/min i. v. cikaprostu, sama neúčinná, vede v kombinaci se slabě inhibující dávkou 0,5 mg/kg i. v. KAS k inhibici trombocytopenií 34 %, signifikantní vůči kontrole a podávání obou účinných látek jednotlivě (tabulka 2). Tohoto efektu se jinak dosáhne pouze trojnásobně vyšší dávkou cikaprostu.

Tabulka 2

Inhibice kolagenem indukované trombocytopenie u morčat (Střední

hodnoty ± SEM).
Kontrola	N 8	% inhibice trombocytopenie 2 ± 6
cikaprost	1 ng/kg/min	6	8 + 5ⁿ’^s*
	3 ng/kg/min	6	36 ± 4^a
KAS	0,5 mg/kg	8	17 ± 3^a
KAS	0,5 mg/kg +		-a Ή
cikaprost	. 1 ng/kg/min	8	34 ± 5^a'°
^a signifikantní	vůči kontrole	(t-test, p<0,05)
^b signifikantní	vůči KAS/cikaprostu (p<0,01)

^n,s· nesignifikantní

Příklad 3

U narkotisovaných morčat se s temperovaným roztokem kuchyňské sole vpraví mesenterialní smyčka. Za intravitálně mikroskopické kontroly se cévní stěna mesenteriální arterioly (020-50m) poškodí sérií elektrických impulsů. Následnou lokální aplikací stoupajících koncentrací roztoku ADP (adehosindifosfát) se zjistí trombogenní koncentrace ADP, při které se na poškozeném místě arterioly tvoří okludující destičkový trombus. Tato trombogenní koncentrace ADP vytváří cévně specificky a reprodukovatelně tromby v příslušné arteriole.

Výsledky:

Kyselina acetylsalicylová 10 mg/kg i.v. nemění trombogenní koncentraci ADP (tabulka 3). Cikaprost 10 ng/kg/min i.v. není rovněž v tomto dávkování signifikantně účinný. Kombinace těchto, na tomto trombosním modelu neúčinných dávek cikaprostu a KAS vede k signifikantnímu zvýšení trombogenní koncentrace ADP o 1,27 + 0,54 log M (= 30,9 násobek výchozí koncentrace). Tohoto antitrombotického účinku kombinace se samotnou kyselinou acetylsalicylovou nemůže dosáhnout a samotným cikaprostem pouze při desetinásobně vyšším dávkování (100 ng/kg/min i.v.: zvýšení o 1,32 ± 0,2 log M ADP, N = 5).

Tabulka 3

Účinek cikaprostu, KAS a kombinace cikaprost + KAS na vývoj okludujících destičkových trombů u poškozených mesenteriálních arteriol morčete (střední hodnoty + SEM).

Trombogenní koncentrace ADP

	N	Výchozí (μΜ)	hodnota	Zvýšení (log μΜ)
cikaprost	10	ng/kg/min	5	84,6	+	54,9	+0,36ⁿ’^s*±0,39
	30	ng/kg/min	5	79,8	+	29,6	+l,02^a ±0,20
	100	ng/kg/min	5	64,6	+	23,7	+l,32^a ±0,20
KAS	10	mg/kg	5	26,1	+	13,9	+0,06ⁿ *²⁵ ‘ ±0,13
cikaprost	10	ng/kg/min					a Ή
+ KAS	10	mg/kg	5	13,8	+	6,7	+l,27^a,° ±0,54

^a signifikantní vůči kontrole (t-test, p<0,05) ^b signifikantní vůči KAS/cikaprost jednotlivým dávkám (p<0,05) . .. ⁿ'^s· nesignifikantní . . .

Příklad 4

U narkotisovaného morčete se pečlivě vypreparuje 2 cm dlouhý kousek externí levé karotisarterie a natáhne se přes malou

... kovovou destičku. Potom .se cévní stěna v délce 1 cm na 3 minuty zatíží 200 g těžkým, na -15 ’C ochlazeným razítkem. Tímto způsobem dochází k silnému lokálnímu poškození cévní stěny u velké arterie a k nárůstů červeného trombu na poškozeném místě. 3 hodiny po poškození se poškozený segment a stejně dlouhý kousek kontralaterální arterie odejmou, propláchnou a dají se do hemoglobin testovací reagencie. Po 24 h se stanoví obsah hemoglobinu obou segmentů. Z diference těchto obsahů hemoglobinu se pak vypočte netto obsah hemoglobinu červeného trombu jako míra velikosti trombu.

Výsledky

Kyselina acetylsalicylová 5 mg/kg i.v. na tvorbu trombu v karotisarterii morčete nemá žádný signifikantní vliv (tabulka 4). Cikaprost v rovněž nesignifikantně účinné dávce 0,3 ng/kg/min i.v. vede v kombinaci s KAS k signifikantně antitrombotickému účinku. Obsah trombového hemoglobinu se redukuje o 85 % oproti kontrole z 8,6 μπιοί (medián) na 1,3 μπιοί.

Tabulka 4

Účinek cikaprostu, KAS a kombinace cikaprostu + KAS na tvorbu trombu v karotisarteriích morčete poškozených tlakem a chladem (mediány a quartily obsahu hemoglobinu (Hb) v trombu).

Obsah Hb trombů [⁴mol]

	N	medián	Q 25	/	Q 75
kontrola		30'	8,6	5,7	/	12,1
cikaprost	0,3 ng/kg/min	10	12,4ⁿ’^s*	8,0	/	25,0
	1,0 ng/kg/min	10	1,9^a	0,2	/	5,8
	3,0 ng/kg/min	11	. 0^a	-0,4	/	0,7
KAS	5 mg/kg	10	3,4ⁿ^s	-0,1	/	13,8
cikaprost	0,3 ng/kg/min
+ KAS	5 mg/kg	10	l,3^a,b	-1,2	/	5,1

^a signifikantní vůči kontrole (= 5 %, řadový sumární test) ^b signifikantní vůči cikaprostu ^n,s* nesigniikantní

Claims

1. Kombinační přípravek k inhibici funkce trombocytů a k léčení trombosy obsahující kyselinu acetylsalicylovou a deriváty karbacyklinu cikaprost nebo eptaloprost ve vzájemném hmotnostním poměru 1:5.10 až 1:1.

2. Přípravek podle nároku 1, vyznačený tím, že kyselina acetylsalicylová a derivát karbacyklinu jsou v oddělených dávkovačích jednotkách.

3. Přípravek podle nároku 1, vyznačený tím, že kyselina acetylsalicylová a derivát karbacyklinu jsou v jedné dávkovači j ednotce.

4. Přípravek podle nároku 1, obsahující dávkovači jednotku derivátu karbacyklinu 1 až 1000 μ9 a dávkovači jednotku kyseliny acetylsalicylové 1 až 500 mg.