CS366891A3 - N,o-sulfated heparosanes, process of their preparation and pharmaceuticalcompositions containing said n,o-sulfated heparosanes - Google Patents
N,o-sulfated heparosanes, process of their preparation and pharmaceuticalcompositions containing said n,o-sulfated heparosanes Download PDFInfo
- Publication number
- CS366891A3 CS366891A3 CS913668A CS366891A CS366891A3 CS 366891 A3 CS366891 A3 CS 366891A3 CS 913668 A CS913668 A CS 913668A CS 366891 A CS366891 A CS 366891A CS 366891 A3 CS366891 A3 CS 366891A3
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- sulphated
- molecular weight
- chains
- heparosans
- heparosan
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 78
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 38
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 124
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 92
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 54
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 claims description 41
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 35
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 34
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 claims description 33
- AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N sulfur trioxide Chemical compound O=S(=O)=O AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 29
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 claims description 29
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 25
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 25
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 23
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 claims description 23
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 18
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 16
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 14
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 claims description 14
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 11
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 9
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 9
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 claims description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 150000002301 glucosamine derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 claims 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims 1
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000020964 regulation of blood coagulation Effects 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 126
- 239000000047 product Substances 0.000 description 88
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 74
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 59
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 37
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 37
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 37
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 37
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 33
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 28
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 25
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 23
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 23
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 17
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 15
- FPJHWYCPAOPVIV-VOZMEZHOSA-N (2R,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-(hydroxymethyl)-6-methoxy-3-sulfooxyoxan-4-yl]oxy-4,5-dihydroxy-3-methoxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H]([C@@H](OC)[C@H](O)[C@H]2O)C(O)=O)[C@H]1NC(C)=O FPJHWYCPAOPVIV-VOZMEZHOSA-N 0.000 description 14
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 14
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 13
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical compound CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 11
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000004032 Heparin Cofactor II Human genes 0.000 description 10
- 108090000481 Heparin Cofactor II Proteins 0.000 description 10
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 10
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 10
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 10
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 8
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 6
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 6
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 6
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 5
- -1 heparin polysaccharide Chemical class 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 4
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 4
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 4
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N Tricine Natural products OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 230000000850 deacetylating effect Effects 0.000 description 3
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 3
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 3
- LKAPTZKZHMOIRE-KVTDHHQDSA-N (2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolane-2-carbaldehyde Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](C=O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKAPTZKZHMOIRE-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- UDQPBAKZZSWNSE-MBMOQRBOSA-N (2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolane-2-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O UDQPBAKZZSWNSE-MBMOQRBOSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-5,5-dimethylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound CC1(C)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 2
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N L-idopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N N-methylaminoacetic acid Natural products C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001858 anti-Xa Effects 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N chlorosulfonic acid Substances OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002634 heparin fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APVPOHHVBBYQAV-UHFFFAOYSA-N n-(4-aminophenyl)sulfonyloctadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 APVPOHHVBBYQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N uranium(0) Chemical group [U] JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L (2-dodecoxy-2-oxoethyl)-[6-[(2-dodecoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]hexyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCCCCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCCCC XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MCHWWJLLPNDHGL-KVTDHHQDSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MCHWWJLLPNDHGL-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOTVQXNRIAEYCG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-2-[hydroxymethyl(methyl)amino]propanoic acid Chemical compound OCN(C)C(CO)(CO)C(O)=O LOTVQXNRIAEYCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- VKCLPVFDVVKEKU-UHFFFAOYSA-N S=[P] Chemical compound S=[P] VKCLPVFDVVKEKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910018503 SF6 Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- JGDITNMASUZKPW-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.Cl[Al](Cl)Cl JGDITNMASUZKPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003254 anti-foaming effect Effects 0.000 description 1
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N bis(2-ethylhexyl) phthalate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC(CC)CCCC BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- LKAPTZKZHMOIRE-UHFFFAOYSA-N chitose Natural products OCC1OC(C=O)C(O)C1O LKAPTZKZHMOIRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 1
- KIUAERUGDCOOSB-UHFFFAOYSA-N hydron;trimethylazanium;sulfate Chemical compound CN(C)C.OS(O)(=O)=O KIUAERUGDCOOSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N l-iduronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004460 liquid liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylmethanamine;sulfur trioxide Chemical compound CN(C)C.O=S(=O)=O DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N nitrous oxide Inorganic materials [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SRWFBFUYENBCGF-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrochloride Chemical compound [Na+].Cl.[Cl-] SRWFBFUYENBCGF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001180 sulfating effect Effects 0.000 description 1
- SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N sulfur hexafluoride Chemical compound FS(F)(F)(F)(F)F SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000909 sulfur hexafluoride Drugs 0.000 description 1
- UDYFLDICVHJSOY-UHFFFAOYSA-N sulfur trioxide-pyridine complex Substances O=S(=O)=O.C1=CC=NC=C1 UDYFLDICVHJSOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/04—Disaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
27-628A2/K1
N,O-Sulfátované heparosany, způsob jejich přípravy a farma-ceutické kompozice obsahující tyto Ν,Ο-sulfátované heparosa ny
Oblast techniky
Vynález se týká nových N,O-sulfátovaných feparosanů,Ν,Ο-sulfátovaných heparosanových kompozic obsahujících tytonové Ν,Ο-sulfátované heparosany, způsobu jejich přípravy afarmaceutických kompozice, které tyto nové Ν,Ο-sulfátovanéheparosany obsahují jako účinnou látku.
Dosavadní stav techniky
Je známé, že glykosaminoglykany jsou produkty, které mohou být získány extrakcí živočišných tkání. Některé z těch-to glykosaminoglykanů ma velmi zajímavé antikoagulační a anti-trombotické vlastnosti. Typickými produkty této skupiny látekjsou heparin, jeho fragmenty a jejich deriváty, jakož i hepa-rinsulfát a dermatansulfát. Tyto produkty však mají nevýhoduspočívající v tom, že jsou vzhledem ke způsobu jejich získá-ní velmi drahé.
Je známo, že dermatansulfát je tvořen skupinou polyme-rů s proměnným stupněm polymerace, tvořenými opakujícími sestrukturními jednotkami sestávajícími ze skupiny kyselinyuronové (iduronyl nebo glukuronyl) a z acetylsulfo-4-galakto-saminylové skupiny (H.W. Stuhlsatz "The Methodology of Con-nective Tissue Research", (1976), 137-146). Přírodní derma-tansulf át má molekulovou hmotnost mezi 20 000 a 40 000 Da.
Tento produkt je obzvláště zajímavý jako antikoagulačně a antitromboticky účinná látka (F.Fernandez a kol., British Jour- nal of Haematology, (1986), 64,309-317). 2
Kromě toho je známo (I. Bjórk a U.Lindahl, "Molecularand Cellular Biochemistry" (1982), Dr. W. Junk Publishers, Ho-landsko), že krevní koagulace je komplexním fysiologickým je-vem, jehož mechanismus může být schematicky znázorněn následu-jícím způsobem:
Kontaktní aktivace
Faktor XII -Faktor Xlla
Faktor XI -Faktor Xla
Faktor IX -Faktor IXa+
Tkáňovýfaktor Vila
Faktor X - Faktor Xa+ -Faktor X
Protrombin II - Trombin+ Ha
Fibrinogen ---ý Fibrin XHIa Některé stimuly, jako kontaktní aktivace a tkáňovéfaktory, spouští následnou aktivaci série koagulačních fakto-rů přítomných v krevní plasmě, přičemž tyto faktory jsou vevýše uvedeném schématu definovány římskými číslicemi a přítom-nost indexu a symbolizuje aktivovanou formu, zatímco nepří-tomnost symbolu a symbolizuje neaktivovanou formu daného koa- 3 gulačního faktoru.
At je charakter stimulu jakýkoliv, finální etapy jsouvždy identické: faktor Xa aktivuje faktor II (tento faktorje rovněž nazýván protrombin), jehož aktivní forma (faktor II,který je rovněž nazýván trombin) vyvolává parciální proteolýzurozpustného fibrinogenu za vzniku nerozpustného fibrinu, kterýje základní složkou krevního koláče.
Za normálních fysiologických podmínek jsou v plasměrovněž přítomné regulační proteiny, jakými jsou antitrombinIII (ATIII) a kofaktor II heparinu (HCII).
Antitrombin III má inhibiční účinnost vůči množině koa-gulačních faktorů označených ve výše uvedeném schématu křížkemTento inhibiční účinek je velmi výrazně zesílen přítomnostíheparinu nebo syntetických oligosacharidů heparinového typu(D.H. Atha a kol., Biochemistry (1985), 24, 6723-6729).
Kofaktor II heparinu vykazuje inhibiční účinnost pouzevůči faktoru Ha (trombin), který katalýzuje poslední etapukoagulace krve. Tato inhibiční účinnost je zesílena výraznýmzpůsobem v přítomnosti heparinu nebo dermatansulfátu (D.M.Tollefsen, J.Biol.Chem (1983), 258, 6713-6716).
Inhibice faktoru Xa nebo faktoru Ha představuje před-nostní prostředek, pomocí kterého lze dosáhnout antikoagulač-ní a antitrombotické účinnosti, protože tyto dva faktory zasa-hují do posledních dvou etap systému krevní koagulace, kteréjsou nezávislé na charakteru stimulu spouštějícího proces srá-žení krve. Při inhibici samotného faktoru Ha spočívá zajímavámožnost ve využití specifičnosti kofaktoru II heparinu a vzesílení jeho inhibiční účinnosti. Dermatansulfát je známýmproduktem, který má nejmocnější zesilující účinnost tohototypu.
Rovněž je známo, že stavba heparinového řetězce probíhá 4 ve dvou etapách. Nejdříve se heparin biosyntetizuje z proteo-glykanového prekurzoru, jehož polysacharidová část je tvořenaskupinou polymerů s různým stupněm polymerace tvořených opaku-jícími se beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-D-glukosamyl-(1,4)-ovými jednotkami (disacharidové jednotky) s molekulovouhmotností 379 Da. Tato polysacharidová část je obvykle nazývánaN-acetylheparosan (J. Navia, Anal. Biochem., (1983), 135, 134-140). Tato první etapa biosyntézy, je jedinou etapou, kdy lzeopravdu mluvit o "disacharidových strukturních jednotkách", nebotdruhá etapa biosyntézy výrazným způsobem modifikuje tento jedno-duchý skelet ("Heparin, fabrication, structure, propriétés, ana-lyses", J.P. Duclos, (1984), str.81-83, Masson Ed., Francie).
Ve skutečnosti je biosyntézou vytvořený přírodní heparinpolysacharidem tvořeným molekulami kyseliny glukuronové a ky-seliny iduronové (uronové kyseliny) případně sulfátovanými v po-loze 2 a připojenými k molekulám glukosaminu, případně sulfáto-vaným v poloze 6 a sulfátovaným nebo acetylovaným v poloze 2.
Struktura heparinu může být statisticky znázorněna ná-sledujícím obecným vzorcem i :
ve kterém
znamená atom vodíku a skupinu SO 3 5 B znamená skupinu SO^ a COCH^ a n je celé číslo mezi 20 a 30, což odpovídá molekulové hmotnosti 12000 až 18000 Da (EP-A-0116801 ) . Výrazy "atom vodíku a skupina SO^ " a "skupina SO^ aCOCH3",použité ve významech obecných substituentú A a B, zna-menají, že ve 20 až 30 výše uvedených disacharidových jednot-kách A v některých případech znamená atom vodíku a v jinýchpřípadech znamená skupinu SO^ , a analogicky B ve většině pří-padů’ znamená skupinu SO^ a v ostatních případech znamená ace-tylovou skupinu.
Stejně tak vlnovková vazba znamená, že skupina COO ve20 až 30 výše uvedených disacharidových jednotkách má v někte-rých případech konfiguraci vzorce ii :
COOH
(jedná se o kyselinu D-glukuronovou) a ve většině z n jednotekmá konfiguraci vzorce iii :
COOH (iii) (jedná se o kyselinu L-iduronovou).
Heparin a fragmenty heparinu, které se zejména získajírůznými polymeračními postupy, jsou tedy makromolekuly obsahu- 6 jícími jak jednotky kyseliny glukuronové, tak i jednotky kyse-liny iduronové. Některé depolymerační metody umožňují získat fragmentyheparinu mající molekulovou hmotnost 2000 až 9000 Da a stupeňsulfatace, který je alespoň o 20 % vyšší než stupeň sulfatacevýchozího heparinu. Takové "supersulfátované" hepariny jsoupopsané v patentové přihlášce EP-A-0 116 801 a mají v případěuronových jednotek obě výše uvedené struktury vzorců ii a iii.
Rovněž je známo, že některé bakterie rodu Escherichia coliprodukují tobolkovitý polysacharid, který je obvykle označovánjako antigen K5 a který je tvořen skupinou polymerů tvořenýchopakujícími se strukturními beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-ace-tyl-D-glukosamyl-(1,4)-ovými jednotkami (W.F. Vann a kol., Eur. J. Biochem (1981(, 116, 359-364).
Tento polysacharid, který má stejnou chemickou povahujako polysacharidová část proteoglykanového prekursoru hepari-nu, zde bude nazýván N-acetylheparosanem. Tento produkt má mo-lekulovou hmotnost 10^ až 2.10θ Da a v úrovní jednotek "kyselinauronová" má velmi pravidelnou strukturu tvořenou výlučně kyse-linou D-glukuronovou (W.F. Vann a kol., Eur.J.Biochem.,(1980),116, 359-364; patentová přihláška EP-A-0 333 243).
Patentová přihláška EP-A-0 333 243 popisuje O-sulfátova-ný polysacharid K5, jakož i některé z jeho fragmentů tvořených4, 6 nebo 8 "cukernými" jednotkami, které jsou rovněž O-sulfáto-vané. Tyto produkty mají antiangiogenní a protinádorovou účin-nost s příznivým poměrem těchto účinností vzhledem k antikoagu-lačním vlastnostem. Tento document rovněž popisuje N-acetylhepa-rosanové fragmenty tvořené 4, 6, 8 nebo 10 "cukernými" jednotka-mi .
Patentová přihláška EP-A-0 333 243 rovněž popisuje pří- pravu pentasacharidu majícího strukturu N-acetylheparosanu, který je O-sulfátován, celkovou chemickou syntézou. 7
Podstata vynálezu
Nyní bylo zjištěno, že Ν,Ο-sulfátované heparosany sproměnnou molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da majíantikoagulační účinnost vůči heparinovému kofaktoru II a vel-mi zvýšenou anti-Xa-účinnost. Ν,Ο-sulfátované heparosany, které jsou předmětem vyná-lezu, se tedy liší od ostatních produktů, které již byly po-psané v literatuře, jejich originální strukturou, zejména je-jich stupněm sulfatace (sulfatace také na aminové skupině glu-kosaminu) a jejich farmakologickými vlastnostmi. Vedle jinýchfarmakologických vlastností mají antikoagulační účinnost vůčiheparinovému kofaktoru II (HCII) silnější, než je stejná účin-nost dermatansulfátu a jsou velmi zajímavými farmakokinetiky.Produkty podle vynálezu, které jsou produkty získanými chemic-kou polosyntézou, mají farmakologické účinky glykosaminoglyka-nů běžně terapeuticky používaných, zejména farmakologické účin-ky heparinu, a mohou být proto použity pro regulaci krevní koa-gulace, přičemž mohou najít použití zejména jako antitrombo-tika.
Předmětem vynálezu jsou Ν,Ο-sulfátované heparosanytvořené řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotnostímezi 1500 a 15000 Da, charakterizovanými opakovanou disacha-ridovou strukturou obecného vzorce I
ve kterém (I) 8 E znamená v O až 80 % disacharidových jednotek uvedených N,O-sulfátovaných heparosanech acetylovou skupinu a vezbývajících disacharidových jednotkách sulfátovou sku-pinu a případně atom vodíku, a G znamená atom vodíku a sulfátovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli uvedených N,O-sulfátovanýchheparosanů.
Stupeň sulfatace N,O-sulfátovaných heparosanů, vyjádře-ný jako poměr sulfát/karboxyl, je s výhodou roven 1,5 až 3,0. Předmětem vynálezu je také N,O-sulfátoheparosanová kom-pozice obsahující alespoň 70 % hmotnosti N,0-sulfátovanéhoheparosanů, který byl popsán výše, přičemž tako kompozice s výhodou obsahuje alespoň 90 % hmotnosti N,O-sulfátovaných heparosanů podle vynálezu. N,O-Sulfátované heparosany podle vynálezu mohou býttvořeny polysacharidovými řetězci s identickou, dobře defino-vanou molekulovou hmotností, přičemž tato molekulová hmotnostleží v intervalu 1500 až 15000 Da. Uvedené N,O-sulfátované he-parosany mohou být také tvořeny směsí řetězců s různou mole-kulovou hmotností, přičemž tyto molekulové hmotnosti leží vrozmezí mezi 1500 a 15000 Da. Rozptyl molekulových hmotnostítěchto řetězců může být větší nebo menší. Ve skutečnosti sul-fátované heparosany podle vynálezu mohou být tvořeny řetězci,jejichž vzájemné molekulové hmotnosti se liší nejvíce o 13500Da, nebo naopak řetězci, jejichž vzájemné molekulové hmotnostise liší o asi 300 Da, což odpovídá jednotce uronové struktury(kyselina D-glukuronová nebo její deriváty) nebo glukosamino-vé struktury. Rovněž je zřejmé, že v závislosti na konstitu-ci každého Ν,Ο-sulfátovaného heparosanů může molekulová hmot-nost řetězců majících buá nejnižší nebo nejvyšší molekulovouhmotnost odpovídat libovolné hodnotě mezi 1500 a 15000 Da. Výše uvedený výraz "G znamená atom vodíku a sulfáto-vou skupinu" znamená, že G v disacharidové jednotce znamená 9 pro některé polohy atom vodíku a pro zbývající polohy sulfá-tovou skupinu. Stejným způsobem E znamená v některých disacha-ridových jednotkách acetylovou skupinu a ve zbývajících jednot-kách sulfátovou skupinu nebo případně atom vodíku. Disacharido-vé jednotky Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů nejsou tedy všechnyidentické.
Vzorec I zahrnuje opakovanou disacharidovou strukturutvořenou glukosaminovou jednotkou a jednotkou kyseliny D-glukuro-nové. Uvedené jednotky mohou být invertované, zejména bere-li sev úvahu, že disacharidová struktura obecného vzorce I se opa-kuje n-krát a že neredukční jednotkou řetězců může být buň glu-kosaminová jednotka, jakou je jednotka uvedená v obecném vzor-ci I s hydroxylovou skupinou v poloze 4, přičemž tato glukosa-minová jednotka je nebo není sulfátována, nebo kyselina D-glu-kuronová, která případně obsahuje dvojnou vazbu v poloze C4-C5a je nebo není sulfátována. Redukční jednotkou může být budkyselina D-glukuronová, jakou je jednotka uvedená v obecnémvzorci I, substituovaná vodíkem na anomerním atomu kyslíku,nebo glukosamin nebo 2,5-anhydromanno-struktura, jakou jestruktura získaná dusitou depolymerací (2,5-anhydro-D-mannosa)a případnou následnou oxidací (kyselina 2,5-anhydro-D-mannonová)nebo redukcí (2,5-anhydro-D-mannitol). Výhodnými produkty jsou ty produkty, jejich oba konce,redukční i neredukční, řetězců Ν,Ο-sulfátovaných heparosanůpodle vynálezu jsou tvořeny sulfátovanými nebo nesulfátovaný-mi uronovými jednotkami, sulfátovaným nebo nesulfátovanýmglukosaminem, N-acetylglukosaminem, který je nebo není sulfátován,nebo jednotkami majícími 2,5-anhydromanno-strukturu. Výhodné jsou N,0-sulfátované heparosany tvořené řetěz-ci, jejich oba konce, redukční i neredukční, jsou tvořenysulfátovanými nebo nesulfátovanými uronovými jednotkami, sul-fátovaným nebo nesulfátovaným glukosaminem a sulfátovanýmnebo nesulfátovaným N-acetylglukosaminem. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy kompozice 10 obsahující 70 až 100 % Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu podle vy-nálezu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje sekvenci ná-sledujících stupňů: - stupeň a: kultivace kmene Escherichia coli (K5) za účelem vytvoření N-acetylheparosanu, - stupeň b: izolace a čištění vytvořeného N-acetylheparosanu
za účelem získání kompozice obsahující 70 až 100 %N-acetylheparosanu tvořeného řetězci nebo směsí ře-tězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da,charakterizovanými opakovanou disacharidovou struk-turou vzorce II
(Π) stupeň c: parciální desacetylace tého kompozice N-acetylhe-parosanu za účelem získání kompozice obsahující70 až 100 % heparosanu tvořeného řetězci nebo smě-sí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a15000 Da, charakterizovanými opakovanou disacha-ridovou strukturou vzorce III : 1 1
OH ch2oh
COOH
OH
NHR (lil) ve kterém r' znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotekacetylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednot-kách atom vodíku, - stupeň d: - buď parciální Ν,Ο-sulfatace této heparosanové kompozice, - nebo parciální Ν,Ο-sulfatace této heparosanovékompozice a následný stupeň celkové N-sulfatace, - nebo celková nebo parciální N-sulfatace a následnýstupeň celkové nebo parciální O-sulfatace, při čemž uvedený způsob zahrnuje případně jeden nebo několikstupňů frakcionace molekulových hmotností, provedených po ukon-čení stupňů a, b, c nebo d.
Pro přípravu kompozice obsahující 70 až 100 % N,0-sul-fátovaného heparosanu podle vynálezu způsobem podle vynálezuse jako kmen Escherichia coli(K5) s výhodou použije kmenEscherichia coli SEBR 3282. Tento kmen je odvozen od kmeneBi 8337-41 ( 0 1 0 : K5:H4)ATCC 23506 (popsán zejména D.S.Guptaa kol. , FEMS Microbiology Letters, (1982), 14, 75-78 a W.Vann-em v Eur.J.Biochem.,( 198 1), 1 1 6, 359-364 ).
Tento kmen Escherichia coli SEBR 3282 má pozitivníodezvu při typovém testu fágem K5, provedeném postupem, po-psaným B. Kaiser-em a kol (J.Clin. Microbiol.,( 1984), 19,2,264-266). Jedná se tedy opravdu o kmen Escherichia coli(K5). 12
Tento kmen byl uložen u CNCM Pasteurova ústavu v Paříži podčíslem 1-1013. Rovněž je možné použít mutant, a to buá spon-tánní nebo indukovaný, tohoto kmene, stejně jako další vhodnékmeny Escherichia coli(K5), například kmen Bi 626-42 (012:K5:NM)ATCC 23508.
Použité kultivační prostředí je s výhodou bohaté nadusíkatý materiál a může být například tvořené kultivačnímprostředím s podstatným obsahem kvasničného extraktu a kasei-nového hydrolyzátu, což je méně nákladný prostředek obsahujícívýznamné množství aminokyselin. V kultivaci kmene Escherichia coli (K5) se výhodně po-kračuje ještě alespoň dvě hodiny po ukončení nárůstu biomasy.
Izolace a čištění N-acetylheparosanu za účelem získáníkompozice obsahující 70 až 100 % N-acetylheparosanu tvořené-ho směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da,charakterizovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzor-ce II, se provádějí způsobem zahrnujícím alespoň jeden sráže-cí stupeň a iontoměničový chromatografický stupeň. Tento stu-peň se s výhodou provede na sloupci Q-Sepharosy nebo na ekviva-lentním sloupci. Srážení se provádí za použití vhodného orga-nického rozpouštědla, zejména alkoholu, výhodně ethanolu. Přitomto způsonu může·být N-acetylheparosan ve formě soli, výhod-ně ve formě sodné soli.
Jakožto příklad je možné úvést následující výhodnéschéma izolačního a čistícího procesu: - stupeň a1: srážení ethanolem, - stupeň b1: dialýza, - stupeň c^: srážení ethanolem,potom dehydratace a vysušení, - stupeň d^: čištění iontoměničovou chromatografií a - stupeň e^ srážení elátu získaného ve stupni d1 ethanolem, dehydratace, vysušení a mletí.
Pokud jde o stupně a^, b+ a c1, není důležité v jakém pořadí se tyto stupně provádějí. Jeden ze stupňů a1 nebo c^ může být vypuštěn. 13
Stupeň zahrnující srážení ethanolem není nezbytný.N-Acetylheparosan muže být izolován i jinými postupy, napří-klad odpařením za vakua eluátu získaného ve stupni d^ .
Izolace a čištění N-acetylheparosanu za účelem získáníkompozice obsahující 70 až 100 % N-acetylheparosanu tvořenéhosměsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da mohoubýt rovněž provedeny následujícím způsobem: - stupeň a 1 - stupeň b ' i - stupeň c ' .j - stupeň d^ - stupeň e"^ - stupeň f'1 dialýza, čištění v kyselém prostředí, odstranění nerozpust-ných nečistot ve vodných roztocích s pH 3,5 apH 1,8, srážení ethanolem, potom dehydratace a vysušení,alkalická hydrolýza a dialýza,čištění iontoměničovou chromatografií, ačištění exkluzní chromatografií.
Tento způsob izolace je také výhodným provedením způsobupodle vynálezu.
Alkalická hydrolýza se provádí za použití roztoku hydro-xidu sodného při teplotě 30 až 80 °C. V případě použití uvedených izolačních a čistících po-stupů je možné jako výchozí produkt použít suspenzi získanoupo ukončení kultivace, přičemž v tomto případě je nezbytná před-běžná filtrace, nebo produkt, který se ještě podrobí předběžné-mu čištění provedenému postupem, který zahrnuje následujícístupně: - stupeň a'^: odstředění suspenze získané po kultivaci, - stupeň b"ý: uvedení supernatantu do styku s alkalickým roz- tokem, - stupeň c'^: předběžná filtrace, - stupeň d"^: koncentrace na membráně se stanoveným separač- ním prahem, umožňující rozdělení podle molekulo-vých hmotností, a - stupeň e"^: dialýza.
Stupeň e'^ zahrnující dialýzu nebí nezbytný.
Jako alkalický roztok lze použít 0,1N roztok hydroxidusodného. S výhodou se předběžné čištění získaného produktu prove-de výše popsaným postupem po ukončení kultivace.
Kultivace kmenů Escherichia coli (K5) a uvedené izolač-ní a Čistící postupy, jakož i výše zmíněné předběžné čištěníumožňují získat N-acetylheparosanové kompozice obsahující 70až 100 % N-acetylheparosanu tvořeného směsí řetězců s molekulo-vou hmotností mezi 1500 a 15000 Da, charakterizovaných opakova-nou disacharidovou strukturou vzorce II
(Π)
Ve skutečnosti je díky výše popsaným postupům izolace,čištění a předběžného čištění možné získat N-acetylheparosanovékompozice obsahující alespoň 80 až 100 % N-acetylheparosanutvořeného směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000Da. N-Acetylheparosany tvořené směsí řetězců s molekulo-vou hmotností 1500 až 15000 Da jsou novými produkty a tvořírovněž předmět vynálezu. 15
Oba konce, redukční i neredukční, nových N-acetylhepa-rosanů získaných výše popsaným způsobem, při kterém je použitkmen Escherichia coli SEBR 3282 nebo jiný vhodný kmen, jak to jižbylo zmíněno výše, jsou uronovými jednotkami nebo N-acetylglu-kosaminem.
Ve většině řetězců je neredukční konec tvořen uronovoujednotkou vzorce a :
Případné obohacení získané kompozice N-acetylheparosa-nem, tvořeným směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až15000 Da, majících opakovanou disacharidovou strukturu vzorceII, může být provedeno do různých stupňů a zejména až k dosa-žení izolace uvedeného N-acetylheparosanu. Toto obohacení seprovede použitím klasických postupů frakcionace molekulovýchhmotností, jakými jsou zejména permeační gelová chromatografiea ultrafiltrace {A.A. Horner, Biochem. J., (1989), 953-958; G. Pyler a kol., J.Biol. Chem. (1988), 263, 11, 5197-5201 aU. Lindahl a kol., J. Biol. Chem., (1984), 259, 20, 12368-12376). Rovněž je možné použít metodu ethanolové frakcionace(patentová přihláška EP-A-0 287 477). Tato posledně uvedenáfrakcionační metoda je ze všech případně použitelných metodobzvláště výhodná. Výše popsané A-acetylheparosany jsou použity jako me- ziprodukty pro přípravu Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů podle vynálezu, ale také pro přípravu jiných derivátů. 16
Pro přípravu Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů podle vynálezu lzetaké použít jiné známé N-acetylheparosany, jakými jsou napří-klad N-acetylheparosany tvořené hlavně polysacharidovými ře-tězci, které všechny mají stejný počet disacharidových jedno-tek, které jsou popsané v patentové přihlášce EP-A-0 333 243a které jsou zejména tvořené 6, 8 nebo 10 "cukernými" jednot-kami, frakce N-acetylheparosanů tvořených řetězci obsahujícímiprůměrně 10 monosacharidových jednotek (Gupta a kol. FEMS Microbiology Letters (1983), 16, 13-17) nebo N-acetylheparosany svysokou molekulovou hmotností, které mohou být potom depoly-merovány za použití postupů, které se používají pro přípravuheparinů s nízkou molekulovou hmotností.
Ve skutečnosti mohou být Ν,Ο-sulfátované heparosany po-dle vynálezu připraveny dalšími postupy ze známého polysacha-ridu (K5) majícího vysokou molekulovou hmotnost. V tomto pří-padě je nezbytné zařadit depolymerační stupeň.
Tato depolymerace může být provedena před deacetylacíN-acetylheparosanu s vysokou molekulovou hmotností, po tétodeacetylací, po N-sulfataci nebo také po Ν,Ο-sulfataci.
Jak již bylo dříve zmíněno, může být depolymerace prove-dena postupy, které jsou v odborné literatuře popsané pro pří-pravu heparinů s nízkou molekulovou hmotností, například depo-lymerací jodistanem, volnými radikály, beta-eliminací nebo pů-sobením kyseliny dusité (patentové přihlášky nebo patenty EP-0 040 144, EP-0 037 319, EP-0 121 067). Tyto metody jsou zdeuvedené pouze jako příklady použitelných metod a tento výčettedy nemá omezující účinek. Za tímto účelem je možné použít li-bovolnou jinou metodu depolymerace glukosaminoglykanů.
Když se Ν,Ο-sulfátované heparosany připraví depolymera-cí z N-acetylheparosanu s vysokou molekulovou hmotností (před-běžně deacetylovaného a případně N-sulfátovaného) jeho vysta-vením účinku kyseliny dusité, může mít redukční jednotka Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů podle vynálezu 2,5-anhydromanno-strukturu a zejména strukturu 2,5-anhydromannosy. Depolyme-race účinkem kyseliny dusité může být provedena po stupni 17 N-deacetylace nebo N-sulfatace. V případě, že tento stupeň jenásledován oxidací nebo redukcí, potom se získají N,0-sulfáto-vané heparosany mající redukční jednotku tvořenou strukturoukyseliny 2,5-anhydro-D-mannonové nebo 1,5-anhydro-D-mannitem.
Parciální deacetylace kompozic obsahujících 70 až 100 %N-acetylheparosanu, která vede k získání kompozic obsahujících70 až 100 % a dokonce 80 až 100 % heparosanu tvořeného směsířetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, charakteri-zovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzorce III, kterýbyl uveden výše, se provádí působením deacetylačního činidla.
Jakožto deacetylační činidla lze zmínit sulfid fosforeč- t ný, triethoxyoxoniumfluorboritan, hydroxid sodný nebo hydra-zin, přičemž dvě posledně uvedená činidla jsou obzvláště vý-hodná. Rovněž je možné použít silné minerální kyseliny, jaký-mi jsou kyselina chlorovodíková, kyselina sírová a podobně.
Doba trvání této reakce bude záviset na zvolených reakčníchpodmínkách a zejména na teplotě a koncentraci deacetylačníhočinidla v reakční směsi.
Obohacení heparosanové kompozice heparosanem tvořenýmřetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až15000Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou struktu-rou vzorce III, se provádí použitím klasických postupů frakcionace molekulových hmotností, které již byly zmíněné výše (per-meační gelová chromatografie, ultrafiltrace a ethanolováfrakcionace). V tomto případě se získají kompozice obsahují-cí 90 až 100 % hmotnosti heparosanu tvořeného směsí molekulo-vých hmotností mezi 1500 a 15000 Da, majících opakovanou di-sacharidovou strukturu vzorce III.
Pro přípravu heparosanu tvořeného směsí řetězců s mo-lekulovou hmotností 1500 až 15000 Da je rovněž možné použítN-acetylheparosany s vysokou molekulovou hmotností. Získanéheparosany s vysokou molekulovou hmotností mohou být po deace-tylaci depolymerovány postupy, které již byly popsané pro pří-pravu heparinů s nízkou molekulovou hmotností a které již byly zmíněny výše. Depolymerační produkty mohou být potom podrobe-ny frakcionaci za účelem získání výhodných heparosanů podlevynálezu.
Heparosany tvořené směsí řetězců s molekulovou hmotnos-tí 1500 až 15000 Da, .charakterizovaných opakovanou disacharido-vou strukturou vzorce III :
ve kterém R znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek ace-tylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednotkáchatom vodíku, jsou novými produkty a vzhledem k tomu jsou rov-něž předmětem vynálezu. Výhodnými heparosany podle vynálezu jsou heparosanytvořené směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da,charakterizovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzorceIII, ve kterém je acetylová skupina (R') přítomna v míře niž-ší nebo rovné 60 %.
Heparosanové kompozice, které obsahují alespoň 70 % hmot-nosti výše popsaného heparosanu, tvoří rovněž podstatu vyná-lezu. Tyto heparosany a heparosanové kompozice jsou rovněž me-ziprodukty použitelnými pro přípravu N,O-sulfátovaných heparo-sanů podle vynálezu, ale mohou být rovněž použity pro přípra-vu jiných produktů, například produktů, které se následněepimerují v úrovni jednotky kyseliny D-glukuronové. Před stupněn parciální N,O-sulfatace mohou být heparo- 19 sány převedeny na sůl s organickou bází nebo na kvartérníamoniovou sůl. Za účelem získání kvartérní amoniové soli uvede-ných heparosanů se s výhodou použije tetrabutylamonium.
Stupeň parciální Ν,Ο-sulfatace realizovaný postupem,popsaným ve francouzském patentu 2 584 728 ze dne 10.11.1987(odpovídajícím patentové přihlášce FR-85.10787), se provádí vaprotickém polárním rozpouštědle, jakým je dimethylformamid,dimethylsulfoxid, hexamethylfosforamid nebo acetonitril nebolibovolná směs těchto rozpouštědel, pomocí například komplexuoxidu sírového (SO^) s organickou bází, jakou je trimethyl-amin nebo pyridin. Tato parciální Ν,Ο-sulfatace může býtrovněž provedena roztokem kyseliny chlorsulfonové v pyridinu. S výhodou se používá komplex oxidu sírového s pyridinem.
Rovněž je možné použít i další sulfatační činidla, zejmé-na ta sulfatační činidla, která jsou popsána E.E. Gilbert-emv Chemical Rewiew (1962), 62, 549-589. N,O-sulfatační reakcese obecně provádí při teplotě O až 100 °C, výhodně při teplo-tě 10 až 50 °C, po dobu 6 až 14 hodin. Při způsobu přípravy se po ukončení částečné N,O-sulfa-tační reakce N,O-sulfátovaná heparosanová kompozice obsahují-cí 70 až 100 % N,O-sulfátovaného heparosanů podle vynálezu vy-sráží přidáním chloridu sodného až k dosažení 0,33M roztokuchloridu sodného a potom přidáním adekvátního množství ethano-lu. Vyloučená sraženina se vyjme 0,5M roztokem chloridu sod-ného. Tento roztok se potom neutralizuje. Po přidání adekvát-ního množství ethanolu se vyloučená sraženina izoluje, vyjmeultra-čistou vodou, dialyzuje proti této vodě, lyofilizujea vysuší.
Jak N,O-sulfatační stupeň, tak i stupně čištění kompoziceN,O-sulfátovaného heparosanů, popsané v předcházejícím odstav-ci, mohou být opakovány jednou nebo několikrát. Uvedenýzpůsob čištění je pouze příkladem použitelného čistícíhopostupu, který nevylučuje použití ekvivalentních čistícíchpostupů. 20
Po tomto Ν,Ο-sulfatačním stupni s výhodou následujestupeň celkové N-sulfatace, který se obecně realizuje ve vodnémrozpouštědle, výhodně při alkalickém pH, působením sulfatační-ho činidla, jakým je komplex oxidu sírového s organickou bází,například s trimethylaminem.
Po ukončení stupně celkové N-sulfatace se N,0-sulfáto-vaná heparosanová kompozice vysráží přidáním chloridu sodnéhoaž k získání 0,5M roztoku chloridu sodného a ethanolu. Vylou-čená sraženina se potom vyjme 0,5M roztokem chloridu sodného,vysráží ethanolem, vyjme ultra-čistou vodou, dialyzuje protiiltra-čisté vodě, lyofilizuje a vysuší.
Obohacení kompozice N,O-sulfátovaného heparosanu N,O-sulfátovaným heparosanem se provádí použitím klasických postu-pů frakcionace molekulových hmotností, které již byly zmíněnyvýše. Je výhodné provést toto obohacení. N,O-sulfátované heparosany podle vynálezu a kompoziceN,O-sulfátovaného heparosanu obsahující alespoň 70 % novéhoΝ,Ο-sulfátovaného heparosanu podle vynálezu se výhodně získajízpůsobem zahrnujícím finální N-sulfatační reakci. E tedy v opakováných strukturách vzorce I znamená acetylovou skupinu a sulfá-tovou skupinu.
Rovněž je možné získat Ν,Ο-sulfátované heparosany podle vynálezu tak, že se nejdříve provede N-sulfatace, po které následuje' O-sulfatace. Tato varianta způsobu podle vynálezu před stavuje výhodnou variantu. * N-Sulfatace se provede pomopí komplexu oxidu sírovéhos organickou bází, jakou je trimethylamin, triethylamin nebopyridin. N-sulfatace může být rovněž provedena roztokem kyse-liny chlorsulfonové v pyridinu. S výhodou se použije komplexoxidu sírového s trimethylaminem a N-sulfatační reakce seprovádí při teplotě 20 až 80 °C ve vodném alkalickém prostře-dí. Po ukončení N-sulfatační reakce se takto získaný produktvysráží přidáním adekvátního množství ethanolu. Vyloučenásraženina se vyjme ultra-čistou vodou, dialyzuje proti této 21 vodě, lyofilizuje a vysuší. Tento čistící postup je zde uvedenpouze jako příklad použitelného čistícího postupu, který nevy-lučuje použití jiných ekvivalentních čistících postupů. Čistícístupně mohou být opakovány několikrát. V rámci způsobu podle vynálezu se N-sulfátovaný heparo-san před O-sulfatací s výhodou převede na sůl s organickou bá-zí nebo na kvartérní amoniovou sůl. Za účelem získání kvartérníamoniové soli se s výhodou použije tetrabutylamonium. O-sulfatační reakce se provádí ve formaldehydu nebo v ji-ném chemicky ekvivalentním rozpouštědle pomocí například kom-plexu oxidu sírového s organickou bází, jakou je trimethylamin,triethylamin nebo pyridin. S výhodou se použije komplex oxi-du sírového s pyridinem. O-Sulfatační reakce se obecně provádípři teplotě 10 až 50 °C. N,O-sulfátovaný heparosan se potom vysráží tím, že sek reakční směsi přidá chlorid sodný až k získání 0,33M roztokuchloridu sodného a potom adekvátní množství ethanolu, stejnějako v případě N,O-sulfatace. Potom se provede čištění kompoziceN,O-sulfátovaného heparosanu. Jednotlivé čistící stupně již bylydetailně popsány v předcházejícím textu (srážení ethanolem,dialýza atd.). Ν,Ο-Sulfátovaný heparosan podle vynálezu s výhodouobsahuje alespoň 90 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotnos-tí nižší než 11000 Da. Je zjištěno, že tentoN,O-sulfátovanýheparosan obsahuje méně než 0,2/umol/mg aminové skupiny (NH^)-
Acetylová skupina je výhodně přítomna v míře nižší ne-bo rovné 60 % , přičemž stupeň sulfatace, vyjádřený jako po-měr sulfát/karboxyl leží v rozmezí od 1,5 do 3,0. Výhodnými produkty podle vynálezu·jsou N,0-sulfátova-né heparosany tvořené řetězci majícími střední molekulovouhmotnost asi 4000 až 7000 Da a stupeň sulfatace, vyjádřenýjako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,7 až 3, jakož i N,O-sulfá-tované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množství pří- 22 tomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %) a tvořené alespoň70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností 5000 až 7000 Daa mající stupeň sulfatace rovný 1,8 až 2,5, nebo také N,0-sulfá-tované heparosany tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s mo-lekulovými hmotnostmi 10000 až 12000 Da, N-deacetylované zasi 80 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovné asi 20 %)a mající stupeň sulfatace rovný 1,8 až 2,5, nebo konečně N,O-sulfátované heparosany, N-deacylované ze 40 % (množství přítom-né acetylové skupiny je rovné asi 60 %) a tvořené alespoň 70 %hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností 6000 až 8000 Da a ma-jícími stupeň sulfatace 2,0 až 2,8. Výhodnými Ν,Ο-sulfátovanými heparosany podle vynálezujsou zejména: - Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množst-ví přítomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %), které jsoutvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotnos-tí 2300 až 7200 Da a které mají stupeň sulfatace 1,8 až 2,5, - Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množst-ví přítomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %), které jsoutvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností3300 až 7700 Da a které mají stupeň sulfatace 1,8 až 2,5, - Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množst-ví přítomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %), které jsoutvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotnos-tí 6900 až 1 35*00 Da a které mají stupeň sulfatace 1,8 až 2,5, a - Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 40 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovno asi 60 %), které jsoutvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností4000 až 10300 Da a které mají stupeň sulfatace 2,0 až 2,8.
Pod pojmem soli N,O-sulfátovaných heparosanů se rozumí - 23 - všechny farmaceuticky přijatelné soli. Tyto soli se získají klasickýmipostupy, které jsou zejména popsány pro přípravu solí heparinu(patent US 4.168.377). Výše uvedený způsob získání Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů,jakož i uvedené čistící postupy umožňují získání Ν,Ο-sulfátova-ných heparosanů ve formě sodné soli. Z těchto solí mohou býtzase použitím metod pro přípravu různých solí heparinu neboheparinu, který není ve formě soli ("i/héparine, fabrication,structure, propriétés, analyses", J.P. Duclos, (1984), str.81-83, Masson Ed, Francie) získány další soli Ν,Ο-sulfátovanýchheparosanů nebo Ν,Ο-sulfátované heparosany, které nejsou veformě solí. N,O-Sulfátované heparosany podle vynálezu mají zajíma-vé farmakologické a biochemické vlastnosti, přičemž tyto vlast-nosti jsou v překvapivém rozporu s tím, co bylo dosud tvrzenov rámci dosavadního stavu techniky.
Zejména na rozdíl od sulfátovaných produktů antigenuK5 popsaných v patentu EP-A-0 333 243, které mají antiangiogennía protinádorovou účinnost s příznivým poměrem těchto účinnostívzhledem k antikoagulačním vlastnostem, mají N,0-sulfátovanéheparosany podle vynálezu dobrou regulační účinnost krevníkoagulace. Tato účinnost je vyšší než stejná účinnost dermatan-sulfátu vzhledem k různým parametrům koagulace a může být spí-še srovnána s účinností heparinu.
Inhibiční účinnosti vůči faktoru Ha a stimulujícíúčinnost vůči antitrombinu III (ATIII) a heparinovému kofaktoruII (HCII) representativních produktů podle vynálezu byly stano-veny metodami, popsanými D. Dupouy-em a kol. v Thrombosis aHaemostasis, (1988), 60, 2, 236-239 pro heparinový kofaktor IIa M.L. Larsen-em a kol. v Thrombosis Research, (1978),13,2,285-288 pro antitrombin. V obou případech test spočívá v tom, že se měří in vitro inhibiční účinek studovaného produktu na přečištěný trombin (faktor Ha) v přítomnosti HCII nebo ATIII (přečistě- 24 ný), přičemž se stanovuje amidolytická účinnost trombinu vůčichromogennímu substrátu. Vzhledem k tomu, že dermatansulfát,připravený postupem, popsaným H.W.Stuhlsatz-em a kol. v "The Me-thodology of connective Tissue Research" (1976) 137-146, mánejsilnější stimulační účinnost na inhibiční účinek HCII vůčifaktoru Ha, je tento dermatansulfát použit jako referenčníprodukt při měření této účinnosti, přičemž výsledek testu jevyjádřen v mg dermatansulfátu (DS) ekvivalentních účinnosti 1 mgstudovaného produktu (mg DE ekviv./mg).
Anti-Xa-účinnost (Yin-Wesslerův titr) uvedených repre-zentativních produktů podle vynálezu byl měřen metodou, popsa-nou E.T.Yin-em a kol. v J. Lab. Clin. Med. (1973), 81, 2, 298-310, zatímco jejich globální antikoagulační účinnost byla mě-řena testem APTT, popsaným R.R.Proctor a kol v Am. J. Clin.Path.(1961), 36, 212-219. U všech testovaných produktů byla stanovena anti-IIa-HCII-dependentní účinnost vyšší než účinnost stejného typu vy-kazovaná dermatansulfátem. Anti-IIa-ATIII-dependentní účinnosta Yin-Wesslerův tite testovaných produktů jsou sice nižší nežodpovídající charakteristiky heparinů, avšak vyšší než stejnécharakteristiky dermatansulfátu. Jejich APTT-titr je asi 2-až 20-krát vyšší než APTT-titr dermatansulfátu a může činitaž 60 % APTT-titru heparinů. N,O-Sulfátované heparosany podle vynálezu mají tedy vel-mi zajímavou specifičnost účinku a antikoagulační účinnost. Nízká molekulová hmotnost těchto produktů jim jinak dává takévelmi zajímavé farmakokinetické vlastnosti. N,O-sulfátované heparosany podle vynálezu jsou velmimálo toxické; jejich toxicita je dokonale slučitelná s jejichpoužitím ve funkci léčiv. Předmětem vynálezu jsou tedy i farmaceutické kompozice, které jako účinnou látku obsahují N,O-sulfátované haparosany podle vynálezu, některou z jejich solí nebo kompozici N,0-sul- 25 fátovaného heparosanu obsahující alespoň 70 % tohoto N,0-sul-fátovaného heparosanu nebo některé z jeho solí v kombinaci sjedním nebo několika farmaceuticky vhodnými vehikuly.
Tyto farmaceutické kompozice jsou zejména použitelnépro preventivní nebo symptomatické léčení poruch vaskulárnístěny, jakými jsou ateroskleróza a arterioskleróza, jakož ihyperkoagulační stavy pozorovatelné například po chirurgickýchzákrocích, nádorového růstu nebo anomálií krevní srážlivostiindukovaných bakteriálními, virovými nebo enzymatickými aktivá-tory. Dávkování těchto produktů se bude v široké míře měnitv závislosti na věku, hmotnosti a zdravotním stavu pacienta,na druhu a závažnosti léčeného onemocnění nebo stavu a na způsobupodání.
Toto dávkování zahrnuje podání jedné nebo několika dá-vek asi 1 mg až 1 g denně, s výhodou asi 5 mg až 500 mg denně,například asi 200 mg denně, intravenózní nebo subkutánní ces-tou, přičemž toho podání je diskontinuální nebo se provádív pravidelných intervalech, nebo podání jedné denní dávky asi 200až 1000 mg perorální cestou.
Tyto dávky mohou být samozřejmě upraveny pro každéhopacienta v závislosti na pozorovaných výsledcích a dříve pro-vedených krevních analýzách. V následující části popisu bude vynález blíže objasněnpomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto pří-klady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují roz-sah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patento-vých nároků. Příklady provedení vynálezu N-Acetylheparosany 26 Příklad 1 Příprava N-acetylheparosanu majícího převážně nízkou moleku-lovou hmotnost (způsob I) 1) Kultivace bakteriálního kmene Escherichia coli (K5)a separace filtrátu obsahujícího N-acetylheparosan 400 ml kultivačního prostředí B, jehož složení je přes-ně uvedeno v následující tabulce I, se naočkuje kmenem Escheri-chia coli SEBR 3282 (uloženého u CNCM Pasteurova ústavu v Pa-říži pod depozitním číslem 1-1013) a inkubuje po dobu 2 hodinpři teplotě 37 °C. Získaná předkultura se potom převede do fermentoru oobsahu 18,5 litru, obsahujícího 11 litrů kultivačního prostře-dí A, jehož složení je přesně uvedeno v následující tabulce I,a kultivační směs se inkubuje po dobu 4 hodin při teplotě 37 °Ca pH rovném 7,4, přičemž se udržuje parciální tlak kyslíku 5,32kPa regulací vhánění kyslíku (až 20 1/min) a míchání. Potomse přidá glukóza kontinuálním přiváděním sterilního roztoku,obsahujícího 600 g/1 glukózy, v množství 250 ml/h po dobu 8hodin.
Po zastavení přívodu glukózy se v kultivaci pokračujeza stejné teploty, stejné hodnoty pH a stejného parciálníhotlaku kyslíku po dobu 10 hodin. Sledování DO (vlnová délka600 nm) kultivačního prostředí umožňuje určit, že v průběhuposledních 12 hodin kultivace nedochází k nárůstu biomasy.
Kultivační břečka se ochladí na teplotu 25 °C, načežse zfiltruje přes memránu s velikostí pórů 0,22 mikrometrů.Tímto způsobem se získá asi 12 1 filtrátu obsahujícího N-ace-tylheparosan. 27
Tabulka I
Složení a příprava kultivačních prostředí A a B
Kultivační prostředí A
Kultivační prostředí A se připraví slitím třech dáleuvedených sterilních roztoků:
Roztok č.1 V 700 ml ultračisté vody se rozpustí v následujícím po-řadí : komplexotvorné činidlo: N -/tris-(hydroxy-methylJmethylglycin (Tricine komerčně do-stupný u firmy Fluka)
FeSO..7H_04 2
CaCl2.2H2O
MgCl-.6H.-0 k2so4 KC1 kaseinový hydrolyzát (hlavní zdroh amino-kyselin) HY CASE SF (komerčně dostupný ufirmy Sheffield) kvasničný exktrakt (komerčně dostupný ufirmy Difco) roztok oligo-prvků (viz následující tabul-ka II) 360 mg 280 mg 6, 7 mg 1270 mg 500 mg 5000 mg 25000 mg 18000 mg 1 ml přísada proti tvorbě pěny Struktol J673 (komerčně dostupná u firmy Schill a Seil- acher) v množství několika kapek uvolněných Pasteurovou pipetouHodnota pH tohoto roztoku se nastaví na 7,4 roztokem hydroxi-du draselného (d=1,38) a roztok se doplní na objem 850 ml ultračistou vodou, načež se přechovává v autoklávu po dobu 45 minutpři teplotě 120 28
Roztok č,2 V asi 40.ml ultračisté vody se rozpustí 5 g K2HPO4, načež se objem získaného roztoku upraví stejným rozpouštědlemna objem 50 ml. Získaný roztok se potom zfiltruje přes filtrs velikostí pórů 0,2 mikrometrů.
Roztok č.3 V adekvátním množství ultračisté vody se rozpustí 20,7g glukózy a objem získaného roztoku se upraví na 100 ml stej-ným rozpouštědlem. Roztok se potom přechovává v autoklávu podobu 30 minut při teplotě 110 °C.
Kultivační prostředí B Příprava kultivačního prostředí B je stejná jako pří-prava kultivačního prostředí A s výjimkou spočívající v tom,že se po přidání přísady proti tvorbě pěny navíc přidá pufrpH=7,2 (kyselina 3-morfolinopropansulfonová) v množství 20 g.
Tabulka II
Příprava roztoku oligo-prvků použitého při přípravě kultivač-ních prostředí A a B V 800 ml ultračisté vody se rozpustí v následujícím pořadí: h3bo3 500 mg NanMoO . .2H-0 2 4 2 1930 mg CoC12.6H20 11850 mg CuSO4.5H2O 25 mg ZnSO..7H_0 4 2 2000 mg A1C13.6H2O 2410 mg.
Potom se přidá 100 ml kyseliny chlorovodíkové mající hustotu 29 1,19 a objem roztoku se doplní ultračistou vodou na finálníobjem 1000 ml. 2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu majícího převážně níz-kou molekulovou hmotnost
Stupeň a - Etanolové srážení K filtrátu se přidá asi 48 1 ethanolu (95% hmot./hmot.),směs se ponechá vysrážet a sraženina usadit při teplotě 4 °C podobu 8 hodin. Supernatant se oddělí nejdříve odsátím a potomodstředěním, načež se centrifugační koláč vyjme asi 1 1 ultra-čisté vody.
Stupeň b - Dialýza
Roztok získaný v předcházejícím stupni, zavedený do tru-bice NOJAX 40 obsahující membránu na bázi celulózy s velikostípóru 2,4 nm, se dialyzuje po dobu 24 hodin proti ultračistévodě (1 objem roztoku/6 objemů vody, obnovovaných po 2 hodi-nách, 8 hodinách a 16 hodinách). Tato operace umožňuje odstra-nit malé molekuly přítomné v kultivačním prostředí, jakýmijsou soli, cukry, aminokyseliny, oligonukleotidy a oligopep-tidy.
Stupeň c - Srážení, dehydratace a sušení K 1 objemu dialyzovaného roztoku se přidá 0,5 M chlori-du sodného a 4 objemy ethanolu. Sraženina se ponechá vyloučitpo dobu 5 minut při okolní teplotě. Směs se potom odstřeóujepři 5000 g po dobu 20 minut. Centrifugační koláč se vyjmeethanolem, získaná suspenze se rozmíchá, načež se ponecháusadit v průběhu jedné hodiny při okolní teplotě. Odstředěnía resuspendování centrifugačního koláče se zopakuje. Potomse směs odstřeáuje při 5000 g po dobu 20 minut. Centrifugač-ní koláč se vysuší za vakua v sušárně při teplotě 40 °C po do- 30 bu 24 hodin.
Stupe2 d - Rozemletí na prášek
Vysušené centrifugační koláče se rozetřou na prášek vtřecí misce za bezvodých podmínek.
Stupeň e - Aniontoměničová chromatografie
Rozetřené centrifugační koláče se vyjmou v pufru označe-ném jako pufr D (Tris-HCl 20 mM, pH 75 ) použitém v množství100 ml/g. Získaný roztok se potom chromatografuje na sloupcisilného antiontoměniče,zahrnujícího agarovou matrici zesíto-vanou kvartérními amoniovými skupinami ("Q-Sepharose fast flow"od firmy Pharmacia), který byl předběžně uveden do rovnovážného stavu s pufrem D, v množství 50 ml gelu na 1 g prášku. Gel sepromyje dostatečným množstvím pufru D za účelem návratu na zá-kladní lini detekce ultrafialovým světlem při 214 nm a potom25 mM roztokem piperazinu, jehož pH bylo nastaveno na 3,5. Jakoeluční činidlo se použije roztok s pH 3,5 mající složení: 0,5 MNaCl a 25 mM piperazinu. Eluát se potom neutralizuje 5N roztokemchloridu sodného.
Stupeň f - Srážení, dehydratace, sušení, rozdrcení
Opakuje se postup, který byl popsán výše pro stupně ca d, avšak bez přidání chloridu sodného. N-Acetylheparosan získaný na výstupu ze stupně f, jeoznačen jako šarže A.
Alternativní varianta čistícího procesu spočívá v tom,že se postupně provedou stupně a, c, b, d, eaf. Takto zís-kaný N-acetylheparosan je označen jako šarže B. 3) Charakterizace N-acetylheparosanu získaného na výstupu zrůzných stupňů čištění 31
Nukleární magnetickorezonanční spektrum (NMR)
Protonové a 13C-nukleární magnetickorezonanční spektrumjsou srovnána s odpovídající spektry N-acetylheparosanu, popsanými W.E. Vann-em (Eur. J. Biochem.,(1981), 116, 59-364).
Studium spekter získaných pro šarži A a šarži B N-ace-tylheparosanu potvrzuje chemickou totožnost získaného produk-tu s N-acetylheparosanem, popsaným W.F. Vann-em. Jedná se opolymerní řetězce tvořené opakovanými beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-D-glukosaminyl-(1,4)-ovými strukturami.
Stanovení rozdělení molekulových hmotností distribuční chroma- tografií
Rozdělení molekulových hmotností se stanový vysokotlakoudistribuční kapalinovou chromatografií za následujících podmí-nek: - sloupec tvořený kuličkami silikagelu s průměrem 10/Um a póro-zitou 25 nm, - eluční činidlo: 0,5M vodný roztok síranu sodrfého, - průtok: 1 ml/min, - detekce ultrafialovým světlem o vlnové délce 205 nm, - kalibrace se provádí pomocí řady oligosacharidů odvozenýchod heparinu, majících následující molekulové hmotnosti: 1324,1883, 2436, 3411, 3996, 4535, 4995, 5365, 6150, 6671, 7542,8655, 10088, 11561, 12950, 14809, 17387 a 22674 Da.
Vzhledem k této kalibrační řadě jsou vzaty v úvahu pou-ze molekulové hmotnosti mezi 934 Da a 56703 Da. Připouští se,že detekovaná optická hustota je úměrná množství N-acetylhepa-rosanu. Nicméně přesnost metody exponenciálně klesá směrem kvysokým molekulovým hmotnostem, zejména v případě molekulovýchhmotností vyšších než 20000 Da.
Eluční profil distribuční chromatografie šarže A jeznázorněna na připojeném obrázku 1. Z obrázku 1 je zřejmé,že jde o polydisperzní distribuci, přičemž maximální pík se 32 nachází v blízkosti molekulové hmotnosti 4700 Da. Hmotnostnífrakce alespoň rovná 70 % šarže A má molekulovou hmotnost vrozmezí od 1700 do 8000 Da.
Velmi obdobný chromatogram se získá při distribučníchromatografii šarže B. Majoritní pík se v tomto případě nachá-zí v blízkosti molekulové hmotnosti 5000 Da. Hmotnostní frakcealespoň rovná 70 % šarže B má molekulovou hmotnost v rozmezíod 1500 do 8000 Da.
Studium rozdělení molekulových hmotností elektroforézou na po- lyakrylamidovém gelu
Analyzované vzorky a činidlo značkující koncovou liniimigrace obsahující bromfenolovou modř se podrobí elektroforézev Tris-boritanovém pufru na 15% polyakrylamidovém gelu získa-ném polymerací směsi akrylamidu a N,N '-methylen-bis-akrylamiduv poměru 29/1. Migrace se provádí při 40 mA po dobu asi 4 hodinna gelu dlouhém 18 cm , kdy se činidlo značkující koncovou liniimigrace dostane na konec gelu. Gel se potom vybarví alcianovoumodří a potom stříbrem technikou, popsanou S. Pelkonen-em akol.v J. Bact., (1983), 170, 6, 2646 a specifickou pro kyselé po-lysacharidy. Této elektroforéze byl podroben částečně přečištěnýprodukt, získaný na výstupu stupně a vyčištěný produkt tvořenýšarží A nebo šarží B a získaný na výstupu z finálního čistí-cího stupně, za účelem zjištění, zda v průběhu čištění, nedo-chází k výrazné modifikaci rozdělení molekulových hmotností N-acetylheparosanu.
Porovnáním profilů získaných pro částečně vyčištěnýprodukt a pro produkt z finálního čistícího stupně (šarže Anebo šarže B) lze dospět k závěru, že v průběhu čištění nedo-chází k výrazným změnách v rozdělení molekulových hmotností(ve stejných migračních vzdálenostech jsou přotomny pásy srov-natelné intenzity) N-acetylheparosanu. 33
Stanovení uronových kyselin
Množství uronové kyseliny v jednotce hmotnosti vyčiště-ného produktu (šarže A nebo šarže B) získaného na výstupu z fi-nálního stupně bylo stanoveno kolorimetricky metodou, popsanouT. Bitter-em v Analytical .Biochemistry ( 1962), 4, 330-334.
Tento způsob stanovení je založen na reakci glykosaminoglyka-nů s karbazolem v kyselém prostředí za tepla, při které docházík růžovému zbarvení, které je přímo úměrné množství uvolněnékyseliny uronové.
Pokud jde o šarži A, byla pro částečně vyčištěný produkt,získaný na výstupu stupně d, a pro vyčištěný produkt, získanýna výstupu z finálního stupně f, stanovena množství kyselinyuronové 1,3, resp. 2,1 ^umol/mg.
Pokud jde o šarži B, bylo pro vyčištěný produkt, získanýna výstupu z finálního stupně, stanoveno množství kyseliny uro-nové 2,1/umol/mg.
Spektrofotometrie v ultrafialové oblasti a ve viditelné oblas- ti světla
Vyčištěný produkt (šarže A) se rozpustí v ultračistévodě a získaný roztok (c = 1 mg/ml) se nalije do kyvety s 1 cmoptickou dráhou. Zaznamená se absorpční spektrum roztoku v roz-mezí vlnových délek 200 až 600 nm.
Ze získaného spektra lze učinit závěr, a to zejména nabázi absorpce v oblasti vlnové délky 256 nm, že šarže A obsa-huje méně než 1 % ADN.
Stanovení celkového množství proteinů
Za účelem stanovení celkového množství proteinů se po- užije souprava "protein assay", která je komerčně dostupná u firmy Biorad. Tento způsob stanovení je založen na skutečnos- ti spočívající v tom, že vlnová délka maximální absorbance kyše- 34 sého roztoku brilantní modři Coomassie g-250 se posune z 465 nmna 595 bm v případě, kdy se na ní váží proteiny (Reisner a kol.,Anal Biochem, (1975), 64, 509).
Celkový obsah proteinů v šarží A je nižší než 1,5 %.
Stanovení volných aminových skupin
Toto stanovení bylo provedeno metodou, popsanou autoryZensaku Yosizawa a kol. v Biochemica et Biophysica Acta (1967),141, 358-365.
Obsah aminových skupin (vyjádřený v ^umol/mg) je ukaza-telem množství deacetylovaných beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-D-glukosaminyl-(1,4)ových jednotek a nečistot, kteréobsahují volnou aminovou skupinu.
Jak šarže A, tak i šarže B obsahuje aminové skupiny vmnožství 0,05/umol/mg. Poměr NH2/kyselina glukuronová (0,05/2,1)je nižší než 2,5 %. Připadá tedy (v molech) na 100 beta-D-glu-kuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-glukosaminyl-(1,4)-ových jednotekméně než 2,5 deacetylované jednotky tohoto typu. Příklad 2 Příprava N-acetylheparosanu majícího převážně nízkou moleku- lovou hmotnost (způsob II) 1) Kultivace bakteriálního kmene Escherichia colu (K5) a sepa-race filtrátu obsahujícího N-acetylheparosan
Kultivace kmene Escherichia coli SEBR 3282 a separacefiltrátu obsahujícího N-acetylheparosan byly provedeny způso-bem popsaným v příkladu 1. 2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu majícího převážně níz-kou molekulovou hmotnost 35
Stupeň a - Dialýza 375 ml filtrátu se podrobí dialýze, provedené způsobem,popsaným v příkladu 1/2) Izolace a čištění N-acetylheparosa-nu majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň b/. Podialýze se získá asi 1020 ml vyčištěného roztoku.
Stupeň b - Čištění v kyselém prostředí K dialyzovanému roztoku se přidá adekvátní množství 5Nroztoku kyseliny chlorovodíkové za účelem nastavení hodnoty pH3,5. Vyloučená sraženina se oddělí odstředěním, načež se se su-pernatant okyselí stejnou kyselinou (5N HC1) za účelem nastavenípH na hodnotu 1,8. Může se vytvořit sraženina, která se odstraníodstředěním. Supernatant se potom zneutralizuje 5N roztokem hy-droxidu sodného.
Stupeň c - Srážení, dehydratace a sušení K neutralizovanému roztoku se přidá adekvátní množstvíchloridu sodného za účelem získání 0,5M roztoku chloridu sod-ného, načež se přidají 4 objemy ethanolu. Po dobu 5 minut seponechá vyloučit sraženina při okolní teplotě. Směs se potomodstřeluje při 5000 g po dobu 20 minut. Centrifugační koláč sevyjme ethanolem a získaná směs se rozmíchá za vzniku homogen-ní suspenze, která se potom nechá v průběhu jedné hodiny přiokolní teplotě usadit. Odstředění a suspendování se zopakuje.Směs se potom znovu odstřeluje při 5000 g po dobu 20 minut.Získaný centrifugační koláč se vysuší v sušárně za vakua přiteplotě 40 °C po dobu 24 hodin.
Stupeň d - Alkalická hydrolýza a dialýza
Produkt získaný v předcházejícím stupni po vysušeníse rozpustí v 0,25N roztoku hydroxidu sodného v takovém množst-ví, aby byl získán 2,5% (hmot./obj.) roztok. Takto získaný roz- 36 tok se potom udržuje na teplotě 50 °C po dobu 2 hodin. Roztok se potom neutralizuje použitím 5N roztoku kyseliny chlorovodí- kové a roztok obsahující polysacharid se potom dialyzuje postu- pem popsaným v příkladu 1/2) Izolace a čištění N-acetylhepa- rosanu majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň bú.
Po dialýze se získá asi 990 ml roztoku.
Stupeň e - Chromatografie na aniontoměniči K dialyzovanému roztoku se přidají adekvátní množstvípiperazinu, EDTA a tritonu X-100 (Prolabo) za účelem získánítěchto koncentrací uvedených látek: 25 mM piperazinu, 2 mM EDTAa 0,2 % (obj./obj.) tritonu X-100. pH se potom nastaví na hod-notu 3,5 pomocí 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Tento roz-tok se potom zavede na sloupec iontoměničové pryskyřice Q-Sepha-rose Fast Flow (400 ml), který byl uveden do rovnováhy s piperazinovým pufrem obsahujícím 25 mM piperazinu, 2 mM EDTA a 0,2 mMtritonu X-100 (pH=3,5). Sloupec se promyje piperazinovým pufrema eluuje 0,5M roztokem hydroxidu sodného, načež se provede vy-srážení 4 objemy ethanolu. Po vysušení za vakua při teplotě40 °C se získá asi 9,85 g N-acetylheparosanu.
Stupeň f - Distribuční chromatografie 4 gramy produktu získaného v předcházejícím stupni serozpustí v 60 ml pufrového roztoku obsahujícího 20 mM Tris-HCl,pH 7,5 a 1 M NaCl a získaný roztok se nechá protéci sloupcem200 ml oktyl-Sepharosy, který byl předtím uveden do rovnováž-ného stavu se stejným pufrem. K nezadržené frakci se přidají4 objemy ethanolu. Vyloučená sraženina se promyje a vysušíza vakua při teplotě 40 °C. Tímto způsobem se získá 3,90 g N-acetylheparosanu. 3) Charakterizace N-acetylheparosanu získaného na výstupuz různých čistících stupňů 37
Nukleární magnetickorezonanční spektrum (NMR)
Studium protonového a 13C-nukleárního magnetickorezo-nančního spektra potvrzuje chemickou identitu získaného pro-duktu s N-acetylheparosanem, popsaným W.F.Vann-em (Eur.J.Biochem.(1981) 116, 59-364).
Stanovení rozdělení molekulových hmot distribuční chromatogra- f ií
Rozdělení molekulových hmotností se stanoví vysokotla-kou kapalinovou distribuční chromatografií provedenou postupempro stanovení rozdělení molekulových hmotností N-acetylheparo-sanú, popsaným v příkladu 1. Hmotnostní frakce alespoň rovná86 % řetězců, které tvoří šarži na výstupu příkladu 2, má mole-kulovou hmotnost v rozmezí od 1500 do 15000 Da.
Stanovení uronových kyselin N-Acetylheparosan získaný ve stupni e má obsah kyseliny uronové 1,94/umol/mg.
Spektrofotometrie v oblasti ultrafialového a viditelného světla Získané spektrum potvrzuje, že N-acetylheparosan, kterýbyl získán v tomto příkladu, obsahuje méně než 1 % ADN.
Stanovení celkového obsahu proteinů
Celkový obsah proteinů v této šarži N-acetylheparosanuje nižší než 1 %.
Stanovení volných aminových skupin (NHp
Obsah aminových skupin v této šarži N-acetylheparosanu je nižší než 0,1/umol/mg. 38 Příklad 3 Příprava N-acetylheparosanu majícího převážně nízkou molekulo- vou hmotnost (způsob III) 1) Kultivace kmene Escherichia coli (K5)
Kultivace kmene Escherichia coli SEBR 3282 byla provede-na postupem popsaným v příkladu 1. Získá se asi 12 litrů kulti-vační břečky obsahující N-acetylheparosan. 2) Předběžné čištění
Stupeň a - Odstředění
Po ukončení kultivace se získaná kultivační břečka (12 1)odstřeluje při 8000 otáčkách za minutu (tj. 11000 až 14000 g) podobu 20 minut.
Stupeň b - Uvedení do styku s alkalickým roztokem
Po odstředění se centrifugační koláč oddělí a superna-tant se uvede do styku po dobu jedné hodiny s 0,1N roztokemhydroxidu sodného.
Stupeň c - Předběžná filtrace
Roztok získaný v předcházejícím stupni se předběžnězfiltruje přes filtr 3M (z polypropylenu, série 300).
Stupeň d -Koncentrace na membráně se stanoveným separačnímprahem
Filtrát získaný ve stupni c se koncentruje v patroněs nápní dutých vláken Amicon se separačním prahem 10000 Da nebov jiném ekvivalentním prostředku. Tímto způsobem se získá roz- 39 tok obohacený N-acetylheparosanem s nízkou molekulovou hmot-ností .
Stupeň e - Dialýza
Roztok obohacený N-acetylheparosanem s nízkou moleku-lovou hmotností se dialyzuje proti ultračisté vodě opět za po-užití systému Amicon při velmi vysokém zřeciovacím faktoru (vyš-ší než 10000) 3) Izolace a čištění N-acetylheparosanu majícího převážně níz-kou molekulovou hmotnost
Postupuje se stejně, jako je uvedeno v příkladu 1 / 2)izolace a čištění N-acetylheparosanu majícího převážně nízkoumolekulovou hmotnost, Stupeň c-Stupeň f/, přičemž se získá N-acetylheparosan mající stejné charakteristiky jako šarže A, a jakje uvedeno v příkladu 2/2) Izolace a čištění N-acetylheparosa-nu majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň a-Stu-pe2 F/. Ν,Ο-Sulfátované heparosany Příklad 4
Chemické modifikace N-acetylheparosanu majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost a získaného v příkladu 1
1) Chemická modifikace šarže B
Stupeň a Parciální deacetylace 500 mg šarže B se rozpustí v 10 ml 1N roztoku chlori-du sodného. Získaný roztok se zahřeje na teplotu 50 °C a při té-to teplotě se nechá za míchání reagovat po dobu 8 hodin. Roztok 40 se potom neutralizuje 2N roztokem kyseliny chlorovodíkové, na-čež se dialyzuje proti ultračisté vodě a potom lyofilizuje.
Stupeň b - Tvorba tetrabutylamoniové soli
Lyofilizát získaný v předcházejícím stupni se vyjme 20ml ultračisté vody. Získaný roztok se zavede na iontoměničovoukolonu, jejíž náplň je tvořena polystyrenem zesítovaným divinyl-benzenem (Dowex 50 W 8 komerčně dostupný u firmy Dow Chemical),který byl předběžně kondicionován v kyselém prostředí, za účelemregenerace kyselé formy produktu. Získaný roztok se potom smísís 0,4 ml 40% roztoku tetrabutylamonia, načež se provede lyofi-lizace.
Stupeň c - Parciální N,O-sulfatace 421 mg soli získané v předcházejícím stupni se rozpustíve 35 ml dimethylformamidu a k získanému roztoku se přidá 3,71 gkomplexu oxidu sírového a pyridinu (komerčně dostupného u firmyAldrich pod označením S755-6). Směs se nechá reagovat za míchánípři okolní teplotě po dobu 6 hodin. K jednomu objemu reakčnísměsi se přidává chlorid sodný až do okamžiku, kdy se získá0,33M roztok chloridu sodného, načež se přidají dva objemyethanolu. Počká se,až se vytvoří sraženina, načež se směs odstředí a supernatant se oddělí. Centrifugační koláč se potom vyjme0,5M roztokem chloridu sodného, který se neutralizuje. Potomse přidají dva objemy ethanolu. Opět se ponechá vyloučit sra-ženina, směs se odstředí a centrifugační koláč se vyjme ultračistou vodou, načež se provede dialýza proti ultračisté vodě alyofilizace.
Zopakuje se- soubor operací popsaných ve výše uvedenémodstavci. Získaný lyofilizát má následující vlastnosti: - obsah kyseliny uronové: 1,11/Umol/mg, - obsah volných amino-skupin: 0,01/Umol/mg, - stupeň sulfatace: 2,64 na disacharidovou jednotku. 41
Obsah uronové kyseliny a amino-skupin se sv .noví stejnějako v příkladu 1.
Stupeň sulfatace, který je rovněž označován jako poměrsulfát/karboxyl, vyjadřuje střední počet sulfátových skupin při-padajících na jednu karboxylovou skupinu; tento stupeň sulfataceje měřen konduktometrickým stanovením sulfátové skupiny a karbo-xylové skupiny, popsaným B. Casu-em a kol. v Carbohydrate Research(1975), 39, 168-176.
2) Chemické modifikace šarže A Šarže A se rozdělí na tři alikvotní frakce označené jakošarže A1, šarže A2 a šarže A3.
Stupeň a - Parciální deacetylace a gelová filtrace
Uvedené šarže A1, A2 a A3 se zpracují postupem popsanýmve stupni a pro výše uvedenou šarži B s tím rozdílem, že pouzešarže A1 se dialyzuje a lyofilizuje. Šarže A1, A2 a A3 se potomfrakcionují gelovou filtrací (která je rovněž označována jakopermeační gelová chromatografie nebo exkluzní chromatogra-fie) za následujících podmínek: - náplň: kuličky o průměru 25 až 75/Um na bázi allyldextranu zesítovaného N,N"-methylen-bis-akrylamidem (Sepha-cryl S 300 HR komerčně dostupný u firmy Pharmacia); - eluční činidlo: 0,5M roztok chloridu sodného. Připraví se směsi frakcí odpovídajících Kav 0,46 až 1pro heparosan šarže A1, 0,43 až 1 pro heparosan šarže A2 a0,43 až 0,64 pro heparosan šarže A3. Tyto frakce jsou dáleoznačované jako "gelově filtrované heparosany".
Kav je koeficient, který se obvykle používá v exkluz- ní chromatografii a který umožňuje reprodukovat frakcionaci exkluzní chromatografií. Tento koeficient je definován vzorcem: 42
Ve - VtKav = -
Vo - Vt ve kterém:
Ve znamená eluční objem úvažované frakce,
Vo znamená exkluzní objem a
Vt znamená celkový objem gelu.
Rozdělení molekulových hmotností heparosanu z šarže AIbezprostředně po parciální deacetylaci, jako i gelově filtrova-ných heparosanu z šarží A1 , A2 a A3 se stanoví exkluzní chro-matografií provedenou technikou popsanou v příkladu 1.
Eluční profily před a po gelové filtraci pro heparosanze šarže A1 jsou znázorněny na obrázcích 2 a 3. Některé výsled-ky uvedených elučních profilů jsou uvedeny v následující tabul-ce III, ve které PMo znamená takovou molekulovou hmotnost, žepouze 1% hmotnostní frakce produktu má molekulovou hmotnostvyšší než je molekulová hmotnost PMo, PM^ znamená takovou mole-kulovou hmotnost, že pouze 10% hmotnostní frakce produktu mávyšší molekulovou hmotnost než je molekulová hmotnost PM1, PM^ znamená takovou molekulovou hmotnost, že pouze 10% hmotnostnífrakce produktu má molekulovou hmotnost menší než je molekulo-vá hmotnost PM^ a PM£ je molekulová hmotnost odpovídající -ma-ximální absorpci.
Tabulka III
Rozdělení molekulových hmotností heparosanu ze šarže AI {gelo-vě nefiltrovaný) a heparosanú gelově filtrovaných ze šaržíA1, A2 a A3 43 PMo PM] PM2 PM3
Gelově nefiltrovaný hepa- rosan : ze šarže A1 41400 9600 4400 1400 Gelově san ze filtrovaný heparo- šarže A1 10700 6900 4400 1600 Gelově san ze filtrovaný heparo- šarže A2 12700 7000 4500 1500 Gelově san ze filtrovaný heparo- šarže A3 10300 6900 4500 1500 Z uvedených výsledků a ze srovnání obrázků 2 a 3 vyplýváže gelová filtrace umožňuje eliminovat minoritní frakci heparo-sanu s vysokou molekulovou hmotností. V tabulce III je tatoskutečnost zřejmá z toho, že po gelové filtraci došlo k výraz-nému poklesu molekulové hmotnosti PMo. Heparosan z každé šar-že obsahuje alespoň 90 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmot-ností nižší než 7000 Da.
Gelové filtrované heparosany ze šarží AI a A2 se potomzpracují postupem uvedeným v příkladu 1/2) Izolace a čiště-ní N-acetylheparosanu majícího převážně nízkou molekulovouhmotnost, Stupeň c/.
Gelově filtrovaný heparosan ze šarže A3 není srážen,nýbrž dialyzován proti ultračisté vodě.
Obsahy kyseliny uronové a volných aminových skupin seměří postupy uvedenými v příkladu 1. Získané výsledky jsou shrnuty v dále zařazené tabulceIV. Obsah zbylých acetylových skupin byl vyhodnocen za předpo-kladu, že existuje stejný počet glukuronylových a glukosami-nylových skupin. 44
Stupeň deacetylace je rovný poměru obsahu volných ami-nových skupin k obsahu kyseliny uronové.
Nukleární magnetickorezonančni spektrum
Studium protonového nukleárního magnetickorezonančníhospektra gelově filtrovaného heparosanu ze šarže A3 vede k zá-věru, že získaný produkt má požadovanou strukturu.
Stupeň deacetylace vypočtený integrací je roven 44 %.Tato hodnota je blízká hodnotě stupně deacetylace vypočtenéza použití uvedeného poměru obsahu volných aminových skupin kobsahu kyseliny uronové (41 %).
Tabulka IV
Charakteristiky gelově a A3 filtrovaných heparosanů z šarží AI, A Stanovený Stanovený Vypočtený Stupeň deace obsah ky- obsah NH2 obsah zby- tylace seliny (/umol/mg) lých ace- (%) uronové tylových (/Umol/mg) skupin (yumol/mg)
Gelově fil- trovaný he- parosan ze šarže A1 2,3 1,10 1,20 48 Gelově fil-trovaný he- parosan ze šarže A2 2,4 1 ,00 1,40 42 45
Tabulka IV (pokračování)
Gelově fil-trovaný he-parosan zešarže A3 2,6 1,05 1,55 41
Stupeň b - Parciální N,O-sulfatace
Gelově filtrované heparosany z deacetylováných šarží A1A2 a A3 se zpracují způsobem, který byl popsán výše pro šaržiB (Stupeň' c - parciální N,O-sulfatace), s tím rozdílem, že seneopakují operace popsané v prvním odstavci. V případě heparosanu ze šarže A3 se koláč po prvnímsrážení vyjme ultračistou vodou, dialyzuje proti ultračistévodě a ponechá v roztoku.
Charakteristiky Ν,Ο-sulfátovaných produktů jsou shrnutyv následující tabulce V.
Tabulka V
Charakteristiky Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů ze šarží A1, A2 aA3 po provedení parciální N,O-sulfatace
Obsah NH2 Stupeň sulfatace (/Umol/mg) (poměr sulfát/karboxyl) N,O-sulfátovaný heparo- san ze šarže A1 0,10 1,9 N,O-sulfátovaný heparo- san ze šarže A2 0,1 1,9 46
Tabulka V (pokračování) Ν,Ο-sulfátovaný heparo- san ze šarže A3 0,10 1,8 Z uvedených výsledků je zřejmé, že po N,O-sulfatačníreakci je obsah zbylých skupin NH2 (0,1O^umol/mg) vyšší nežobsah skupin NH2 přečištěných N-acetylheparosanů (0,05/Umol/mg)Sulfatace tedy není na atomu dusíku úplná.
Stupeň c - Celková N-sulfatace V objemu 20 ml ultračisté vody na gram použitého N,0-sulfátovaného produktu se smísí 1 hmotnostní díl N,0-sulfáto-vaného produktu, 1 hmotnostní díl hydrogenuhličitanu sodného, 1 hmotnostní díl komplexu oxidu sírového a trimethylaminu azískaná směs se míchá při teplotě 55 °C po dobu 20 hodin. Re-akční směs se potom zředí (zřeáovací faktor 10), načež se vo-divost roztoku získaného roztoku nastaví na vodivost 0,5M roz-toku chloridu sodného, potom se provede vysrážení přidáním 2 objemů ethanolu, odstředění a vyjmutí centrifugačního kolá-če 0,5M roztokem chloridu sodného a následné vysrážení 2 obje-my ethanolu. Po vyjmutí ultračistou vodou a dialýze proti ultračisté vodě se produkty lyofilizují a vysuší za vakua při te-plotě 40 °C.
Nukleární magnetickorezonanční spektrum 13
Studium C-nukleárního magnetickorezonančního spektraΝ,Ο-sulfátovaného heparosanu ze šarže A3 ukazuje, že v případětéto sloučeniny je alkoholová funkce v poloze 6 glukosaminy-lové skupiny zcela ve formě esteru kyseliny sírové. Některé charakteristiky získaných N,0-sulfátovanýchheparosanů, stanovené výše popsanými metodami jsou shrnuty 47 v následující tabulce VI.
Tabulka VI
Charakteristiky produktů získaných po celkové N-sulfataci prošarže AI, A2 a A3
Obsah kyseliny uronové(/Umol/mg) Obsah nh2 (yumol/mg) Stupeň deacetylace (%) Stupeň sulfatace (poměr sulfát,karboxyl) N,0-sulfátovanýheparosan ze šarže A1 1 ,20 0,02 48 2,2 N,O-sulfátovanýheparosan ze šarže A2 1,30 0,02 42 2,2 N,O-sulfátovanýheparosan ze šarže A3 1,35 0,02 41 2,1 Z uvedených výsledků je zřejmé, že obsah zbylých sku-pin NH2 (0,02/umol/mg) je nízký a nižší než stejný obsah vyčištěného N-acetylheparosanu (0,05/umol/mg pro šarži A a šarži B)a než stejný obsah Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu získaného poparciální Ν,Ο-sulfataci (uveden v tabulce V). To prokazujeúplný průběh N-sulfatační reakce.
Rozdělení molekulových hmotností produktů získaných po 48 N-sulfataci je stanoveno postupem popsaným v příkladu 1.
Eluční profil získaný pro produkt ze šarže A1 je znázor-něn na obrázku 4. Velmi podobné eluční profily se získají proprodukty z šarží A2 a A3. Některé výsledky uvedených elučních profilů jsou uvede-ny v následující tabulce VII. Definice symbolů PMo, PMp PM2 aPM^ jsou stejné jako v případě tabulky III.
Tabulka VII
Rozdělení molekulových hmotností produktů získaných po celkovéN-sulfataci pro šarže AI, A2 a A3 PMo PM1 PM2 pm3 Šarže A1 14700 9000 5700 2600 Šarže A2 17500 10000 5800 3400 Šarže A3 11600 7600 5000 1800 Ν,Ο-sulfátovaný heparosan každé z šarží obsahuje ales-poň 90 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností nižší než10000 Da. Ve skutečnosti šarže A1, A2 a A3 obsahují 80 % ře-tězců v rozmezí 2600 až 9000 Da, 3400 až 10000 Da a 1800 až7600 Da. Příklad 5
Chemické modifikace N-acetylheparosanu majícího převážně níz- kou molekulovou hmotnost z příkladu 2. Příprava 80% N-deacety-lovaných derivátů Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů 49
Použitý N-acetylheparosan byl připraven postupem popsa-ným v příkladu 2. Obsah kyseliny uronové v tomto produktu jeroven 2,12/Umol/mg. Stanovení rozdělení molekulových hmotnos-tí bylo provedeno exkluzní chromatografií, provedenoumetodoupopsanou v příkladu 1. Hmotnostní frakce alespoň rovná 87,5 %má řetězce s molekulovou hmotností v rozmezí 1500 až 15000 Da.Majoritní pík rozdělení molekulových hmotností se nachází voblasti 4900 Da. Tato šarže N-acetylheparosanu je označenajako šarže C.
Stupeň a Parciální deacetylace 2,5 g šarže C se rozpustí v 50 ml 2N roztoku hydroxi- ·du sodného. Roztok se zahřeje na teplotu 50 °C a ponechá sereagovat při této teplotě za míchání po dobu 8 hodin. pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 pomocí 2N roztoku kyseliny chloro-vodíkové, načež se roztok dialyzuje proti ultračisté vodě a potom lyofilizuje. Tímto způsobem se získá 1,96 g produktu.
Stupeň N-deacetylace Výsledek stanovení obsahu volných aminových skupin(t^) ukazuje, že N-acetylheparosan byl N-deacetylován z 80 %.
Stupeň b - N-sulfatace
Lyofilizát získaný v předcházejícím stupni se vyjme70 ml vody a po přidání 2,5 g uhličitanu sodného a 2,5 g kom-plexu oxidu sírového a trimethylaminu se směs ponechá reagovatpři teplotě 55 °C po dobu 20 hodin.
Vodivost reakčního roztoku se upraví na vodivost 0,5Mroztoku chloridu sodného přidáním demineralizované vody. Vy-srážení se provede přidáním 4 objemů ethanolu. Sraženina seodstředí a znovu rozpustí 0,5M roztoku chloridu sodného. Povysrážení 4 objemy ethanolu se sraženina odstředí a centrifu- 50 gační koláč se vyjme ultračistou vodou, načež se získaný roz-tok dialyzuje postupem, který byl již popsán v příkladu 1, alyofilizuje. Tímto způsobem se získají 2 g produktu.
Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli
Lyofilizát získaný v předcházejícím stupni se převedena tetrabutylamoniovou sul postupem popsaným v příkladu 4/ 1) Chemické modifikace šarže B, Stupeň b/. Získá se 2,7 g soli
Stupeň d - O-sulfatace 2,680 g soli získané v předcházejícím stupni se rozpus-tí ve 196 ml formamidu, načež se k získanému roztoku přidá11,27 g komplexu oxidu sírového a pyridinu. Směs se nechá re-agovat za míchání při teplotě 30 °C po dobu 6 hodin. Potom sena 5 objemů reakčního roztoku přidá 1 objem 2M roztoku chlori-du sodného a pH roztoku se nastaví na hodnotu 7 pomocí roztokuhydroxidu sodného. Roztok se opětovně vysráží 2 objemy ethanolu,sraženina se oddělí odstředěním a centrifugační koláč se opě-tovně rozpustí v 0,5M roztoku chloridu sodného. Potom se při-dají 2 objemy ethanolu. Ponechá se vyloučit sraženina, kteráse odstředí a opětovně vyjme 80 ml ultračisté vody. Přidá se20 ml 2M roztoku chloridu sodného a 4 objemy ethanolu. Ponecháse vyloučit sraženina, která se oddělí odstředěním.
Stupeň e - Gelová filtrace
Produkt získaný ve stupni d se vyjme ultračistou vodoua potom frakcionuje gelovou filtrací za podmínek popsaných vpříkladu 4/2) Chemické modifikace šarže A, Stupeň a/. Moleku-lové hmotnosti řetězců, které tvoří Ν,Ο-sulfátovaný heparosan,se stanoví exkluzní chromatografií provedenou postupem, po-psaným v příkladu 1. Sloučí se jednak obsahující řetězce majícímolekulovou hmotnost mezi 1500 a 12000 Da (roztok C(A)/ a jednakfrakce obsahující Ν,Ο-sulfátované heparosany tvořené řetězci 51 s molekulovými hmotnostmi mezi 2000 a 30000 Da /roztok C(M)/. K roztoku C(A( se přidají 4 objemy ethanolu. Nechá sevyloučit sraženina, která se odstředí a vyjme ultračistou vo-dou, načež se provede dialýza proti ultračisté vodě a lyofili-za. Tímto zpúsom se získá 1,8 g produktu.
Takto získaný Ν,Ο-sulfátovaný heparosan je označen jakošarže C1. Některé charakteristiky tohoto N,O-sulfátovaného heparosanu, stanovené výše uvedenými postupy, jsou shrnuty v následujícítabulce VIII.
Tabulka VIII
Charakteristiky produktu odpovídajícího šarži C1
Obsah kyseliny uronové (/Umol/mg) Obsah nh2 (/Umol/mg) Stupeň deacetylace (%) Stupeň sulfatace (poměr sulfát/karboxyl) Šarže C1 1/6 0,013 80 1,9
Rozdělení molekulových hmotností bylo stanoveno metodou popsanou v příkladu 1. Některé výsledky odvozené z elučníhoprofilu jsou shrnuty v tabulce IX. Tabulka IX Rozdělení molekulových hmotností produktu odpovídajícího šar-ži C1 PMo PM] pm2 pm3 Šarže Cl 9600 7200 5621 2367 52
Definice symbolu PMo, PM1 , Pí·^ a PM^ jsou stejné jako v případětabulky XII. Ν,Ο-sulfátovaný heparosan šarže C1 obsahuje 95 % hmot-nosti řetězců s molekulovými hmotnostmi v rozmezí od 1500 do15000 Da.
Nukleární magnetickorezonanční spektrum (NMR)
Protonové a 1^C-nukleární magnetickorezonanční spektrum Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu se získají za použití spektroskopu AMX 500 a D_O jako rozpouštědla. Studium takto získaného proto-, 13Z . , nového a C-nuklearního magnetickorezonančního spektra potvrzuježe získaný produkt má požadovanou strukturu. Jedná se tedy o Ν,Ο-sulfátovaný heparosan.
Studium poměru intenzit protonů cukrů a protonů acetylo- vých skupin v protonovém spektru vede ke stupni deacetylace » rovnému 84 %. Tato hodnota je velmi blízká hodnotě stupně de-acetylace vypočtené za použití poměru obsahu volných aminovýchskupin k obsahu kyseliny uronové (80 %). 13 z C-nukleárni magnetickorezonanční spektrum zejména po-tvrzuje, že glukosamin je téměř úplně N-sulfátován. Kyselinaglukuronová není sulfátována v poloze 2 a 3.
Stupeň f - Gelová filtrace K roztoku C(M) se přidají 4 objemy ethanolu. Ponechá sevyloučit sraženina, která se odstředí, vyjme ultračistou vo-dou, dialyzuje a lyofilizuje. Získaný lyofilizát se potom rozpustí v 0,5M roztokuchloridu sodného a frakcionuje gelovou filtrací za podmínekdefinovaných ve stupni e.
Sloučí se jednak frakce obsahující řetězce mající molekulo vé hmotnosti mezi 1300 a 21000 Da /roztok C(B)/ a jednak frak- ce obsahující řetězce s molekulovou hmotností mezi 14000 a 37000 Da /roztok C(C)/. 53
Oba tyto roztoky se zpracují postupem uvedeným výšepro roztok C(A), přičemž se po lyofilizaci v případě roztokuC(B) získá šarže C2, zatímco po lyofilizaci v případě roztokuC(C) se získá šarže C3. V následující tabulce X jsou uvedeny některé výsledkyodvozené z elučních profilů získaných pro produkty šarže C2a šarže C3.
Tabulka X
Rozdělení molekulových hmotností produktů odpovídajících šar-žím C2 a C3 PMO PM] pm2 pm3 Šarže Šarže C3 14600 9600 28656 17320 7597 5950 10512 7975
Definice symbolů PMo, PM^, PM2 a PM^ jsou stejné jakov případě tabulky III. Ν,Ο-sulfátovaný heparosan odpovídající šarži C2 obsahuje asi 99 % hmotnosti řetězců, jejichž molekulová hmotnostleží v rozmezí od 1500 až 15000 Da, zatímco Ν,Ο-sulfátovanýheparosan odpovídající šarži C3 obsahuje asi 73 % hmotnostiřetězců, jejichž molekulová hmotnost leží v rozmezí od 1500do 15000 Da. Příklad 6
Chemické modifikace N-acetylheparosanu majícího převážně níz- 54 kou molekulovou hmotnost z příkladu 2. Příprava 40% deacety- lovaného derivátu N,O-sulfátovaného heparosanu majícího stupeň sulfatace 2,6 N-Acetylheparosan použitý jako výchozí produkt byl při-praven postupem popsaným v příkladu 2. Obsah kyseliny uronovév tomto produktu je roven 1,96/Umol/mg. Tato šarže se nazývášarže D.
Stupeň a - Parciální deacetylace 3,7 g šarže D se rozpustí v 74 ml 1N roztoku hydroxidusodného a získaný roztok se zpracuje postupem popsaným v pří-kladu 5 (stupeň a). Deacetylace se provede pod atmosférou du-síku. Po lyofilizaci se získá 2,91 produktu.
Stupeň N-deacetylace
Stanovení obsahu volných aminových skupin (Ní^) v produktuzískaném po lyofilizaci ukazuje, že N-acetylheparosan byl de-acetylován ze 40 %.
Stupeň b - N-sulfatace
Produkt získaný v předcházejícím stupni byl zpracovánpo přidání 3,7 g komplexu oxidu.sírového a trimethylaminu vpřítomnosti 3,7 g uhličitanu sodného postupem popsaným v pří-kladu 5 (stupeň b). Tímto způsobem se získají 3 g N-sulfátova-ného heparosanu.
Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli
Asi 2 gramy N-sulfátovaného heparosanu získaného v před-cházejícím stupni se převedou postupem popsaným v příkladu 5(stupeň c) na tetrabutylamoniovou sůl. Získá se 2,99 g lyofi-lizátu. 55
Stupeň d - O-sulfatace 2,98 g soli získané v předcházejícím stupni se uvede v reakci se 14 g komplexu oxidu sírového a trimethylaminu postu pem popsaným v příkladu 5 (stupeň d), načež se provedou vysrá- žení a čištění popsaná v témže příkladu 5 (stupeň d). Získá se 2,8 g produktu.
Stupeň e - Gelová filtrace
Produkt získaný v předcházejícím stupni se frakcionu-je gelovou filtrací za použití metody a materiálu popsaných vpříkladu 4/2) Chemické modifikace šarže A, stupeň aú.
Rozdělení molekulových hmotností frakcí N,O-sulfátované-ho heparosanu se stanoví exkluzní chromatografií provedenoupostupem popsaným v příkladu 1. Izolují se frakce tvořené N,0-sulfátovanými heparosany, jejichž převážná většina řetězců mámolekulovou hmotnost v rozmezí od 1500 do 15000 Da.
Tyto frakce se potom zahustí a podrobí dialýze protiultračisté vodě. Provede se následné vysrážení přidáním 5 obje-mů ethanolu, vyloučená sraženina se odstředí, rozpustí v 0,5 Mroztoku chloridu sodného, načež se zopakuje srážecí operace.
Takto přečištěný produkt se podrobí druhé frakcionaciza použití metodiky zmíněné na začátku tohoto stupně. Rozděle-ní molekulových hmotností frakcí se stanoví exkluzní chroma-grafií postupem, který byl již popsán výše. Izolují se frakceobsahující produkty mající molekulové hmotnosti v rozmezíod 4000 do 8000 Da. Získané frakce se podrobí dialýze a vysrážení přidá-ním alkoholu. Sraženina se izoluje a rozpustí v 0,5M roztokuchloridu sodného. Takto získaný roztok se dialyzuje protiultračisté vodě a potom lyofilizuje. Tímto způsobem se získáasi 1 gram Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu označeného jako šaržeD1. Některé charakteristiky a rozdělení molekulových hmot- ností tohoto Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu jsou uvedeny v ná- 56 sledujících tabulkách XI a XII.
Tabulka XI
Charakteristiky produktu odpovídajícího šarži D1‘
Obsah kyseliny uronové (/umol/mg)
Obsah Stupeň NH2 deacetylace (/umol/mg) (%) ·
Stupeňsulfatace(poměr sulfát/ karboxyl) Šarže D1 1,53 0,01 40 2,60 Tabulka XII Rozdělení molekulových D1 hmotností produktu odpovídajícího šarž PMo PM1 PM2 pm3 Šarže D1 15430 10305 6850 4047 Definice symbolů PMo, PM1, PM2 a PM^ jsou stejné jako v přípa dě tabulky III. Ν,Ο-sulfátovaný heparosan šarže Dl obsahuje 80 % hmot-nosti řetězců s molekulovou hmotností v rozmezí od 4047 do10305 Da a asi 98,5 hmotnosti řetězců má molekulovou hmotnostv rozmezí od 1500 do 14600 Da. Obrázek 5 představuje eluční 57 profil získaný pro N, 0-sulfátovaný heparosan.
Nukleární magnetickorezonanční spektrum (NMR)
Protonové a ^C-nukleární magnetickorezonanční spektrumΝ,Ο-sulfátovaného heparosanu šarže D1 se získají za použitísprktrometru AMX 500, přičemž se jako rozpouštědlo použijeD„O.
Studium protonového a C-nukleárního magnetickorezo-nančního spektra potvrzuje požadovanou strukturu produktu. Jedná se tedy skutečně o N,O-sulfátovaný heparosan. ^C-nukleární magnetickorezonanční spektrum zejménapotvrzuje, že žádná aminová skupina glukosaminové jednotky ne-ní ve formě volné aminové skupiny (Ní^). Glukosamin je v polo-ze C6 zcela sulfátován a naopak všechny hydroxy-skupiny kyselíny glukuronové nejsou sulfátované. Příklad 7
Chemické modifikace N-acetylheparosanu majícího převážně níz- kou molekulovou hmotnost z příkladu 2. Příprava 40% N-deacy-lovaného derivátu Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu majícího stu- peň sulfatace rovný 3
Jako výchozí produkt se v tomto příkladu použ.ije šaržeN-acetylheparosanu připravená postupem popsaným v příkladu 2.Tato šarže je označena jako šarže E a její obsah kyseliny uro-nové činí 2ymol/mg.
Rozdělení molekulových hmotností tohoto N-acetylhepa-rosanu bylo stanoveno technikou popsanou v příkladu 1. TentoN-acetylheparosan obsahuje asi 75 % hmotnosti řetězců majícíchmolekulovou hmotnost v rozmezí od 1500 do 15000 Da, přičemžstřední molekulová hmotnost těchto řetězců je asi 10900 Da.Molekulová hmotnost majoritního heparosanu je 5135 Da. 58
Stupeň a - Parciální deacetylace N-Acetylheparosan byl ze 40% deacetylován za použitímetodiky popsané v příkladu 6 (stupeň a). Za účelem provede-ní této N-deacetylace se použije 2,5 g výchozího produktu,který se rozpustí v 50 ml 1N roztoku hydroxidu sodného. Poukončení reakce se pH reakční směsi nastaví na hodnotu 6 pomo-cí kyseliny chlorovodíkové, načež se směs zahustí.
Stupeň N-deacetylace Výsledky stanovení obsahu volných aminových skupin(NH^) ukazují, že N-acetylheparosan bel N-deacetylován ze 40 %.
Stupeň b - Gelová filtrace
Použije se sloupec Sephadecrylu S 300 HR (5 cm x 100 cm),který byl uveden do rovnovážného stavu s 0,5M roztokem chlori-du sodného. Rozdělení molekulových hmotností heparosanu obsaže-ného v různých frakcích byl stanoven exkluzní chromatografií.Sloučí se frakce obsahující řetězce mající molekulovou hmotnost6000 až 20000 Da, zahustí se v zařízení Rotavapor (rotačníodparka) a vysráží 4 objemy ethanolu, načež se vyloučená sraže-nina izoluje a vysuší. Tímto způsobem se získá asi 1 g produktu.
Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli a parciální N,O-sul-farace
Za účelem vytvoření tetrabutylamoniové soli se použije300 mg produktu získaného v předcházejícím stupni a provede sepostup popsaný v příkladu 4/1) Chemické modifikace šarže B,stupeň b). Získá se 490 mg soli, která se rozpustí ve 30 ml formamidu. Potom se provede parciální Ν,Ο-sulfatace postupem po-psaným v příkladu 4/1) Chemické modifikace šarže B, stupeň c,první odstavec/.
Ze 490 mg soli, která se uvede v reakci s 2,25 g kom- plexu oxidu sírového a pyridinu se získá 406 mg N,O-sulfátovar 59 ného heparosanu.
Stupeň d - Celková N-sulfatace a gelová filtrace 372 mg produktu získaného ve výše uvedeném stupni serozpustí v 15 ml roztoku uhličitanu sodného (5%) a získanýroztok se po přidání 372 mg komplexu oxidu sírového a trimethyl-aminu zpracuje postupem popsaným v příkladu 4/2) Chemické mo-difikace šarže A, stupeň c/.
Produkt získaný po celkové N-sulfataci se potom frakcionu-je gelovou filtrací za použití sloupce Sephacrylu S 300 HR(2,5 cm x 100 cm) a již popsané metodiky. Frakce mající molekulo-vou hmotnost v rozmezí od 6000 do 20000 Da se sloučí, zahustív rotační odparce Rotavapor, extenzivně dialyzují proti- ultra-čisté studené vodě a lyofilizují. Tímto způsobem se získá 260 mgΝ,Ο-sulfátovaného heparosanu označeného jako šarže E1. Charakte-ristiky tohoto produktu jsou uvedeny v následující tabulce XIII.
Tabulka XIV uvádí rozdělení molekulových hmotností ře-tězců, které tvoří šarži E1.
Tento Ν,Ο-sulfátovaný heparosan obsahuje asi 75 % hmot-nosti řetězců s molekulovou hmotností od 1500 do 15000 Da aasi 65 % hmotnosti řetězců majících molekulové hmotnosti vrozmezí od 7700 do 15000 Da.
Tabulka XIII
Charakteristiky produktu odpovídajícího šarži E1
Obsah kyseliny uronové(/Umol/mg) Obsah Stupeň NH^ deacetylace (/Umol/mg) (%) Stupeň sulfatace (poměr sulfát/karboxyl) Šarže E1 1,35 0,01 40 3 60
Tabulka XIV
Rozdělení molekulových hmotností produktu odpovídajícího šar-ži E1 PMo PM] pm2 pm3 Šarže El 31238 19671 12029 7748 Definice symbolů PMo, PM^, PM2 a PM 3 jsou stejné jako v pří pádě tabulky III. Příklad 8 Příprava dvou šarží 80% N-deacetylovaných derivátů N,O-sulfá- tovaného heparosanu majících stupeň sulfatace 2,25 a 2,4
Použitou výchozí látkou (šarže F) je šarže N-acetyl-heparosanu připraveného postupem popsaným v příkladu 2.
Stanovení rozdělení molekulových hmotností řetězců, které tvoří tuto sloučeninu, bylo provedeno exkluzní chromato-grafií postupem popsaným v příkladu 1.
Studium elučního profilu vede k závěru, že šarže Fobsahuje 92 % hmotnosti řetězců, jejichž molekulová hmotnostleží v rozmezí od 1500 do 15000 Da. Majoritní pík se nacházív oblasti 4800 Da. Hmotnostní frakce šarže F alespoň rovná80 % má molekulovou hmotnost v rozmezí od 2400 do 10000 Da.
Obsah kyseliny uronové v tomto produktu je roven 2,4/Umol/mg.
Stupeň a Parciální deacetylace 61
Postupuje se stejně jako v příkladu 5 (stupeň a), přičemžse použije 2,5 g šarže F a 50 ml 2N roztoku NaOH. Tímto způso-bem se získá 1,6 g produktu, který je z 80 % N-deacetylován.
Stupeň deacetylace byl vypočten na základě stanovení obsahuvolných aminových skupin.
Stupně bac - N-sulfatace a tvorba tetrabutylamoniové soli
Tyto dva stupně jsou stejné jako stupně bac popsanév příkladu 5. Získá se 4,7 g tetrabutylamoniové soli.
Stupeň d - O-sulfatace 2,9 g soli získané v předcházejícím stupni se rozpustíve 290 ml formamidu a k získanému roztoku se přidá 17,4 g komplexuoxidu sírového a pyridinu. Použije se postup, který byl popsánve stupni d příkladu 5. Centrifugační koláč získaný po druhémodstředění se rozpustí v ultračisté vodě, získaný roztok se dia-1-yzuje proti ultračisté vodě a lyofilizuje. Získá se 3,68 gproduktu.
Stupeň e -Gelová filtrace
Produkt získaný v předcházejícím stupni se rozpustí v0,5M roztoku chloridu sodného a získaný roztok se zavede nasloupec Sephacrylu S 300 HR, který byl uveden do rovnováhy s0,5M roztokem chloridu sodného. Eluát opouštějící kolonu sejímá do automatického sběrače frakcí.
Frakce mající molekulovou hmotnost v rozmezí od 1400 Dado 10000 Da se sloučí a zahustí v rotační odparce Rotavapor.Přidají se 4 objemy ethanolu, vyloučená sraženina se odstředí,vyjme ultračistou vodou a získaný roztok se dialyzuje extenziv-ně proti ultračisté vodě, lyofilizuje a vysuší. Získá se 1,6 gΝ,Ο-sulfátovaného heparosanu označeného jako šarže F1.
Frakce odpovídající molekulových hmotnostem v rozmezíod 5000 do 35000 Da se sloučí, zahustí v rotační odparce Rota- 62 vapor a k takto získanému roztoku se přidají 4 objemy ethanolu.Vyloučená sraženina se odstředí, vyjme vodou, dialyzuje proti ultračisté vodě a lyofilizuje. Získaný lyofilizát se potom podrobínové frakcionaci za použití postupu uvedeného na začátku toho-to stupně.
Rozdělení molekulových hmotností jednotlivých frakcíse stanoví exkluzní chromatografií za použití postupu, který bylpopsán v příkladu 1. Sloučí se frakce tvořící N,0-sulfátovanéheparosany a mající molekulovou hmotnost v rozmezí od 2000 do26000 Da. Vysrážení se provede přidáním 4 objemů ethanolu. Vylou-čená sraženina se odstředí a opětovně rozpustí v destilovanévodě, načež se získaný roztok dialyzuje a lyofilizuje. Tímtozpůsobem se získá 0,6 g N,O-sulfátovaného heparosanu označenéhojako šarže F2.
Charakteristiky šarží F1 a F2 jsou uvedené v následují-cí tabulce XV. Výsledky odvozené z elučních profilů jsou shrnu-ty v tabulce XVI.
Tabulka XV
Charakteristiky Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů odpovídajícíchšaržím F1 a F2
Obsah kyseliny uronové (/Umol/mg) Obsah NH2 (/Umol/mg) Stupeň deacetylace (%) Stupeň sulfatace (poměr sul:karboxyl) Šarže F1 1,58 menší než 80 2,4 0,01 Šarže F2 1,58 menší než 80 2,25 0,01 63
Tabulka XVI
Rozdělení molekulových hmotností produktů odpovídajících šar- žím F1 a F2 PMo PM1 pm2 pm3 Šarže F1 10700 7700 5800 3300 Šarže F2 24400 16325 8600 6900 Definice ky III. PMo, PMp PM2 a PM^ jsou stejné jako v případě tabul N, O-sulfát0vany heparosan šarže F1 obsahuje asi 99 % hmotnosti řetězců majících molekulové hmotnosti v rozmezí od1500 do 15000 Da, zatímco Ν,Ο-sulfátovaný heparosan šarže F2obsahuje asi 84,6 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotnostív'rozmezí od 1500 do 15000 Da a asi 70 % hmotnosti řetězců mámolekulovou hmotnost v rozmezí od 6900 do 13500 Da.
Nukleární magnetickorezonanční spektrum (NMR)
Protonové a 1^C-nukleární magnetickorezonanční spektrumΝ,Ο-sulfátovaného heparosanu šarže F1 se získá za použitíspektrometru AMX 500, přičemž se jako rozpouštědla'použije D2OStudium protonového spektra a zejména poměru intenzit protonůcukrů k protonům deacetylovaných jednotek vede k závěru, žeasi 20 % glukosaminových jednotek je N-acetylováno.
Studium 1^C-nukleárního magnetickorezonančního spektrapotvrzuje, že glukosaminová jednotka je skutečně N-sulfátovánaKyselina glukuronová není ve většině strukturních disachariďo-vých jednotek O-sulfátována v polohách 2 a 3. 64
Preparáty
Preparát A Příprava N-acetylheparosanu majícího převážně vysokou moleku- lovou hmotnost (způsob I) 1) Kultivace kmene Escherichia coli (K5) a separace filtrátuobsahujícího N-acetylheparosan 400 ml kultivačního prostředí D, jehož přesné složeníje uvedeno v dále uvedené tabulce XVII, se naočkuje kmenemEscherichia coli SEBR 3282 a naočkované kultivační prostředíse potom inkubuje za míchání při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Získaná předkultura se potom převede do fermentoru oobsahu 18,5 1 obsahujícího 11 litru kultivačního prostředí C,jehož přesné složení je uvedeno v následující tabulce XVII, atoto kultivační prostředí se potom inkubuje po dobu 6 hodin a30 minut při pH rovném 7,2 a za míchání, přičemž se udržujeparciální tlak kyslíku 5,32 kPa regulováním přítoku vzduchu(až 20 1/min). Potom se přidá glycerol tak, že se kontinuálněpřivádí sterilní roztok obsahující 500 g/1 glycerolu v'množství18 g/h po dobu 16 až 17 hodin. V kultivaci se pokračuje za stejné teploty, hodnotypH a parciálního tlaku kyslíku až do okamžiku, kdy je téměřspotřebováno veškeré množství glycerolu. Sledování DO (vlnovádélka 600 nm) kultivační suspenze po ukončení přidávání glyce-rolu ukazuje stacionární stav.nebo mírnou lyži až do přeruše-ní kultivace po 28 až 30 hodinovém prodlení ve fermentoru.
Kultivační břečka se potom ochladí na teplotu 25 °C apotom zfiltruje přes membránu s velikostí pórů 0,22/um. Tímtozpůsobem se získá asi 12 litrů filtrátu obsahujícího N-acetyl-heparosan mající převážně vysokou molekulovou hmotnost. 65
Tabulka XVII
Složení a příprava kultivačního prostředí C a D
Kultivační prostředí C V 900 ml ultračisté vody se rozpustí v následujícím pořadí: NTA (kyselina nitrilotrioctová) 1000 mg k2hpo4 700 mg kyselina glutamová 11000 mg MgCl2.6H2O 500 mg K2SO4 450 mg FeSO. -7H-0 4 2 18 mg CaCl2.2H2O 2 mg NaCl 500 mg KC1 5000 mg roztok oligo-prvků (viz tabulka II, př.1) 1 ml glycerol 10000 mg.
Hodnota pH získané směsi se nastaví na 7,2 koncentrovaným roztokem hydroxidu draselného (hustota 1,38), směs se doplní naobjem 1000 ml ultračistou vodou a sterilizačně zfiltruje přesmembránu s velikostí pórů 0,2/um.
Roztok glycerolu 50 g glycerolu se rozpustí v adekvátním množství ultračisté vody, načež se objem získaného roztoku nastaví stejnýmrozpouštědlem na 1000 ml. Roztok se sterilizačně zfiltrujepřes membránu s velikostí póru 0,2/um. Přísadou proti tvorběpěny, která byla použita v průběhu fermentace, je Strktol J673 (komerčně dostupná u firmy Achill a Seilacher).
Kultivační prostředí D Příprava kultivačního prostředí D je stejná jako pří-prava kultivačního prostředí C s tím rozdílem, že je vhodnépo přidání přísady proti tvorbě pěny navíc přidat ještě pufr(pH 7,2) tvořený kyselinou 3-morfolinopropansulfonovou. 2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu majícího převážně vy-soko molekulovou hmotnost N-Acetylheparosan mající převážně vysokou molekulovouhmotnost byl izolován a vyčištěn postupem popsaným v příkladu2/2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu majícího převážněnízkou molekulovou hmotnost, stupeň a-stupeň f/. 3) Charakterizace získaného N-acetylheparosanu
Stanovení rozdělení molekulových hmotností exkluzní chromato- grafií
Vzhledem k současně používaným etalonům bylo stanovenírozdělení molekulových hmotností provedeno aproximativně. Získaný N-acetylheparosan je tvořen řetězci s molekulo-vou hmotností mezi 20000 a 500000 Da, přičemž střední mole-kulová hmotnost se nachází v oblasti 100000 až 200000 Da.
Stanovení uronových kyselin
Obsah kyseliny uronové vyčištěného produktu získanéhona výstupu z finálního stupně činí 2,2/umol/mg.
Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti světla
Na základě získaného spektra lze tvrdit, že tato šaržeobsahuje alespoň 0,5 % ADN. 67
Stanovení celkového obsahu proteinů
Celkový obsah proteinů v uvedeném produktu je nižší než 0,5 %.
Stanovení volných aminových skupin (NH^)
Obsah volných aminových skupin v uvedeném produktu jenižší než 0,1/mol/mg.
Preparát B Příprava N-acetylheparosanu majícího převážně vysokou moleku- lovou hmotnost (způsob II) 1) Kultivace kmene Escherichia coli (K5)
Kultivace kmene Escherichia coli SEBR 3282 byla prove-dena postupem popsaným v rámci preparátu A. Získá se asi 12 1kultivačního prostředí obsahujícího N-acetylheparosan majícípřevážně vysokou molekulovou hmotnost. 2) Předběžné čištění
Postupuje se stejně jako v příkladu 3/2) Předběžnéčištění/ a ve stupni d se použije patrona s dutými vlákny Ami-Con se separačním prahem 30000 Da nebo jiný ekvivalentní pro-středek. 3) Izolace a čištění N-acetylheparosanu majícího převážně vy-sokou molekulovou hmotnost
Postupuje se stejně jako v příkladu 3 /3) Izolace ačištění N-acetylheparosanu majícího převážně nízkou molekulo-vou hmotnost/.
Preparát C
Chemické modifikace N-acetylheparosanu majícího převážně vy- 68
sokou molekulovou hmotnost získaného v rámci preparátu A
Jako výchozí produkt pro různé chemické modifikace se po-užije N-acetylheparosan označený jako šarže G1 a připravený způ-sobem popsaným v rámci preparátu A.
Obsah uronové kyseliny v tomto produktu činí 2,41/umol/mg
Stupeň a - Parciální deacetylace 1,9 g šarže G1 se rozpustí ve 38,5 ml 2N roztoku hydro-xidu sodného. Roztok se zahřeje na teplotu 50 °C a při této te-plotě se ponechá reagovat pod atmosférou dusíku po dobu 8 hodin.Potom se pH roztoku nastaví na hodnotu 8,25 přídavkem nezbytné-ho množství 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové, načež se roztokdialyzuje proti ultračisté vodě a potom lyofilizuje. Získá se1,60 g produktu.
Stupeň N-deacetylace
Stanovený obsah volných aminových kyselin (NH^) ukazuje,že N-acetylheparosan byl N-deacetylován z 80 %.
Stupeň b - N-Sulfatace 1,3 g produktu získaného v předcházejícím stupni serozpustí v 57 ml ultračisté vody, načež se k získanému rozto-ku přidá 1,9 g uhličitanu sodného a 1,9 g komplexu oxidu sí-rového a trimethylaminu a směs se potom zahřívá na teplotu55 °C po dobu 20 hodin. Vodivost roztoku se potom nastaví navodivost 0,5M roztoku chloridu sodného přidáním nezbytnéhomnožství demineralizované vody a roztok se vysráží přidáním4 objemů ethanolu. Vyloučená sraženina se odstředí, opětovněvyjme 0,5M roztokem chloridu sodného, znovu vysráží přidáním4 objemů ethanolu a odstředí.
Centrifugační koláč se rozpustí v ultračisté vodě azískaný roztok se dialyzuje proti ultračisté vodě postupem 69 popsaným v příkladu 1 a potom lyofilizuje. Tímto způsobem sezíská 1,809 g N-sulfátovaného heparosanu.
Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli 800 mg produktu připraveného v předcházejícím stupnise rozpustí ve 100 ml vody. Tento roztok se zavede na sloupeciontoměničové pryskyřice Dowex 50 W 8 a dále se postupuje stejně jako v příkladu 4/1) Chemické modifikace šarže B, stupeňb/. Po lyofilizaci se získá asi 1,3 g požadované soli.
Stupeň d - O-Sulfatace Výše uvedeným způsobem získaná sůl se rozpustí v 80 mlformamidu a k získanému roztoku se potom přidá 5,6 g komplexuoxidu sírového a pyridinu. Směs se ponechá reagovat po dobu 6hodin při teplotě 30 °C, načež se k ní přidá 16 ml 2M roztokuchloridu sodného. pH směsi se upraví na hodnotu 7 a přidají se2 objemy ethanolu. Vyloučená sraženina se vyjme 0,5M roztokemchloridu sodného, opětovně vysráží 2 objemy ethanolu, dialyzujproti ultračisté vodě a zahustí v rotační odparce Rotavar.
Stupeň e - Gelová filtrace
Koncentrovaný roztok získaný v předcházejícím stupnise frakcionuje gelovou filtrací na sloupci Sephacrylu S 300 HRpřičemž se jako eluční roztok použije 0,5M roztok chloridusodného.
Izolují se frakce, které odpovídají molekulovým hmot-nostem v rozmezí od 10000 do 500000 Da. Přidají se 2 objemyethanolu a provede se zahuštění. Vodivost roztoku se potomnastaví na vodivost 0,5M roztoku chloridu sodného přidánímpotřebného množství vody.
Zopakuje se frakcionace gelovou filtrací a jímají sefrakce obsahující Ν,Ο-sulfátovaný heparosan tvořený řetězcimajícími střední molekulové hmotnosti v rozmezí od 100000 do 70 200000 Da, jakož i frakce obsahující Ν,Ο-sulfátovaný heparo-san tvořený řetězci majícími střední molekulové hmotnosti asi50000 až asi 12000 Da.
Ke každé z těchto tří frakcí se přidá 5 objemů ethanolu,podrobí se dialýze proti ultračisté vodě a roztoky získané podialýze se lyofilizují. Tímto způsobem se získají 3 šarže Ν,Ο-sulfátovaného he-parosanu: - šarže G1 je Ν,Ο-sulfátovaným heparosanem tvořeným ře-tězci majícími střední molekulovou hmotnost od 100000do 200000 Da; izoluje se 0,140 g této šarže; - šarže G2 je Ν,Ο-sulfátovaným heparosanem tvořeným ře-tězci majícími střední molekulovou hmotnost asi 50000Da; izoluje se 0,350 g tohoto Ν,Ο-sulfátovaného heparosánu; - šarže G3 je Ν,Ο-sulfátovaným heparosanem tvořeným ře-tězci majícími střední molekulovou hmotnost 12000 Da;izoluje se asi 0,100 g této poslední šarže. . Charakteristiky těchto tří šarží Ν,Ο-sulfátovaného hepa-rosanu popsaných v tomto příkladu jsou shrnuty v tabulce XVIII.
Tabulka XVIII
Charakteristiky N,O-sulfátovaných heparosanů odpovídajících šaržím G1, G2 a G3 Obsah Obsah Stupeň Stupeň kyseliny nh2 deacetylace sulfatace uronové(/Umol/mg) (yumol/mg) (%) (poměr sulfát/karboxyl) Šarže G1 1,48 menší než0,01 80 2,6 71
Tabulka XVIII (pokračování) Šarže G2 1,45 menší než 80 2,6 0,01 Šarže G3 1,45 menší než 80 2,6 0,01
Claims (35)
- - 72 - PATENTOVÉ NÁROKY 1. Ν,Ο-Sulfátované heparosany tvořené řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da majícímiopakovanou disacharidovou strukturu obecného vzorce I ch2ogJ-O COOH O OG OG (I) NHE OG ve kterém E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanú acetylovou skupinu a vezbývajících disacharidových jednotkách sulfátovou sku-pinu a případně atom vodíku a G znamená atom vodíku a sulfátovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli uvedených Ν,Ο-sulfátovanýchheparosanú.
- 2. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1 ve kterých E znamená acetylovou skupinu a sulfátovou skupinu. 73
- 3. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle některého z nároků 1 a 2 mající stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/kar-boxyl, 1,5 až 3,0.
- 4. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené ře- tězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a15000 Da, majícími opakovanou disacharidovou strukturu obecné-ho vzorce Ive kterém E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů acetylovou skupinu a vezbývajících disacharidových jednotkách sulfátovou sku-pinu a případně atom vodíku, a G znamená atom vodíku a sulfátovou skupinu, přičemž jejich stupeň sulfatace,vyjádřený jako poměr sulfát/kar-boxyl,je roven 1,5 až 3,0 a oba konce, redukční a neredukční,řetězců uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů jsou sulfátova-nými nebo nesulfátovanými uronovými jednotkami, sulfátovanýmnebo nesulfátovaným glukosaminem nebo sulfátovaným nebo nesul-fátovaným N-acetylglukosaminem, a . farmaceuticky přija- telné soli uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů. - 74
- - 5. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle některého z nároků 1až 4, ve kterých je acetylová skupina přítomna v míře nižšínebo rovné 60 %.
- 6. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle některého z nároků 1 až 5, které obsahují alespoň 90 % hmotnosti řetězců s molekulo-vou hmotností nižší než 11000 Da.
- 7. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, které obsahujíméně než 0,2/umol/mg aminových skupin (NH^)-
- 8. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle některého z nároků' 1až 5 tvořené řetězci se střední molekulovou hmotností asi 4000až 7000 Da a mající stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sul-fát/karboxyl, rovný 1,7 až 3.
- 9. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené ales- poň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 5000a 7000 Da a mající stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sul-fát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupina jepřítomna v míře nižší nebo rovné 20 %.
- 10. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené ales-poň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 10000a 12000 Da a. majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměrsulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupinaje přítomna v míře nižší nebo rovné 20 %.
- 11. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 6000 75 a 8000 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměrsulfát/karboxyl, rovný 2,0 až 2,8, přičemž acetylová skupinaje přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.
- 12. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 2300a 7200 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměrsulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupinaje přítomna v míře menší nebo rovné .20 %.
- 13. Ν,Ο-sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 3300a 7700 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměrsulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupinaje přítomna v míře nižší nebo rovné 20 %.
- 14. Ν,Ο-sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 6900a 13500 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměrsulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupinaje přítomna v míře menší nebo rovné 20 %.
- 15. Ν,Ο-sulfátované heparosany podle nároku 1 tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 4000a 10300 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměrsulfát/karboxyl, rovný 2,0 až 2,8, přičemž acetylová skupinaje přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.
- 16. Kompozice Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu, vyznače-ná t í m , že obsahuje alespoň 70 % hmotnosti Ν,Ο-sulfáto-vaného heparosanu podle některého z nároků 1 až 15. 76
- 17. Způsob přípravy kompozice obsahující 70 až 100 % N,O-sulfátovaného heparosanu podle nároku 1 , vyznačenýtím, že zahrnuje sled následujících stupňů: - stupeň a: kultivace kmenes Escherichia coli (K5), - stupeň b: izolace a čištění, kterému případně předchází před- běžné čištění, vytvořeného N-acetylheparosanu za úče-lem získání kompozice obsahující 70 až 100 % N-acetylheparosanu tvořeného řetězci nebo směsí řetězců smolekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da, majícíchopakovanou disacharidovou strukturu vzorce II:- stupeň c: parciální deacetylaci této kompozice N-acetylhe-parosanu za účelem získání kompozice obsahující70 až 100 % heparosanu tvořeného řetězci nebo smě-sí s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da,majících opakovanou disacharidovou strukturu vzor-ce IIINHR 'I OH (lil) 77 ve kterém R” znamená v O až 80 % disacharidovýchjednotek acetylovou skupinu a ve zbývajících disa-charidových jednotkách atom vodíku, - stupeň d:-buá parciální Ν,Ο-sulfatace této heparosanové kom-pozice, -nebo parciální sulfatace této heparosanové kompozicenásledovaná stupněm celkové N-sulfatace, -nebo celková N-sulfatace nebo parciální N-sulfatacenásledovaná stupněm celkové nebo parciální O-sulfa-tace, a zahrnuje případně jeden nebo několik stupňů frakcionace mo-lekulových hmotností provedeného, popřípadě provedených po ukon-čení stupňů a, b, c nebo d.
- 18. Způsob podle nároku 17,vyznačený tím,že kmenem Escherichia coli (K5) je kmen SEBR 3282 uložený uCNCM Pasteurova ústavu v Paříži pod číslem 1-1013 nebo jehospontánní nebo indukovaný mutant.
- 19. Způsob podle nároku 17,vyznačený tím, že v kultivaci kmene Escherichia coli se pokračuje ještě ales-poň dvě hodiny po zastavení růstu biomasy.
- 20. Způsob podle nároku 17,vyznačený tím,že izolace a čištění N-acetylheparosanu zahrnují alespoň je-den stupeň srážení alkoholem a alespoň jeden stupeň iontomě-ničové chromatografie.
- 21 Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že izolace a čištění N-acetylheparosanu se provádí způsobem,zahrnujícím sled následujících stupňů: 78 - stupeň a1: srážení ethanolem, - stupeň b1: dialýza, - stupeň c^: srážení ethanolem, potom dehydratace a vysušení, - stupeň d1: čištění aniontoměničovou chromatografií, - stupeň e^: srážení eluátu získaného ve stupni d^ ethanolem, dehydratace, sušení a drcení,přičemž stupně a1 nebo c^ mohou být vypuštěny.
- 22. Způsob podle nároku 17,vyznačený tím, žeizolace a čištění N-acetylheparosanu se provádí způsobem za-hrnujícím sled následujících stupňů: - stupeň a' - stupeň b^ - stupeň c' - stupeň d' - stupeň e ’ - stupeň f' dialýza, čištění v kyselém prostředí, odstranění nerozpust-ných nečistot ve vodných roztocích s pH 3,5 a pH1,8, srážení ethanolem, potom dehydratace a sušení,alkalická hydrolýza a dialýza,čištění aniontoměničovou chromatografií,čištění exkluzní chromatografií.
- 23. Způsob podle nároku 17,vyznačený tím,že se N-acetylheparosan získaný kultivací kmene Escherichiacoli (K5) ještě před izolací a čištěním podrobí předběžnémučištění, které se provádí způsobem zahrnujícím sled následují-cích stupňů: - stupeň a"odstředění suspenze získané po ukončení kultivace, - stupeň b"^ uvedení do styku supernatantu s alkalickým rozto- kem, - stupeň c"^: předběžná filtrace, - stupeň d”1: koncentrace na membráně se stanoveným separač- ním prahem, - stupeň e": dialýza, 79 přičemž stupeň e'^ může být vypuštěn.
- 24. Způsob podle nároku 17,vyznačený tím, že po stupni parciální Ν,Ο-sulfatace se provede celková N-sulfatace působením komplexu oxidu sírového a organické báze vevodném rozpouštědle s alkalickou hodnotou pH.
- 25. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím,že po stupni N-sulfatace se provede frakcionace molekulovýchhmotností.
- 26. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím,že jako účinnou látku obsahuje Ν,Ο-sulfátovaný heparosan podlněkterého z nároků 1 až 15 ve spojení nebo ve směsi s farmaceticky přijatelnou inertní pomocnou látkou.
- 27. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím,že jako účinnou látku obsahuje kompozici N,0-sulfátovanéhoheparosanu podle nároku 16 ve spojení nebo ve směsi s farma-ceuticky přijatelnou inertní pomocnou látkou.
- 28. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 nebo 27 použi-telná pro regulaci krevní koagulace.
- 29. Kmen Escherichia coli (K5) SE3R 3282 uložený u CNCMPasteurova ústavu v Paříži pod číslem 1-1013.
- 30. N-Acetylheparosany tvořené směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da majících opakovanou disachari- 80 dovou strukturu vzorce IIpřičemž oba konce, redukční i neredukční, uvedeného N-acetyl-heparosanu jsou uronovými jednotkami nebo N-acetylglukosaminem.
- 31. N-Acetylheparosan podle nároku 30, ve kterém ve většiněřetězců je neredukční konec uronovou jednotkou vzorce a :
- 32. Kompozice N-acetylheparosanu, vyznačená tím,že obsahuje alespoň 70 % hmotnosti N-acetylheparosanu podle ná-roku 30. 81
- 33. Heparosany tvořené směsí řetězců s molekulovou hmotnos-tí mezi 1500 a 15000 Da majícími opakovanou disacharidovoustrukturu obecného vzorce IIIve kterém R znamenátylovou skupinu a vemená atom vodíku. v 0 až 80 % disacharidovýchzbývajících disacharidových jednotek ace-jednotkách zna-
- 34. Heparosany podle nároku 33 , ve kterých je acetylováskupina přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.
- 35. Kompozice heparosanu, vyznačená tím, žeobsahuje alespoň 70 % hmotnosti heparosanu podle některéhoz nároků 33 a 34. Zasypu je:
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR909015114A FR2669932B1 (fr) | 1990-12-03 | 1990-12-03 | Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS366891A3 true CS366891A3 (en) | 1992-09-16 |
| CZ279081B6 CZ279081B6 (en) | 1994-12-15 |
Family
ID=9402838
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5550116A (cs) |
| EP (1) | EP0489647B1 (cs) |
| JP (1) | JPH051101A (cs) |
| KR (1) | KR100214752B1 (cs) |
| AR (1) | AR248429A1 (cs) |
| AT (1) | ATE150033T1 (cs) |
| AU (1) | AU646112B2 (cs) |
| BG (1) | BG60479B1 (cs) |
| BR (1) | BR9105239A (cs) |
| CA (1) | CA2056878A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ279081B6 (cs) |
| DE (1) | DE69125109T2 (cs) |
| DK (1) | DK0489647T3 (cs) |
| ES (1) | ES2099145T3 (cs) |
| FI (1) | FI103050B (cs) |
| FR (1) | FR2669932B1 (cs) |
| GR (1) | GR3023541T3 (cs) |
| HU (1) | HU214986B (cs) |
| IE (1) | IE914197A1 (cs) |
| IL (1) | IL100229A (cs) |
| MX (1) | MX9102353A (cs) |
| MY (1) | MY109669A (cs) |
| NO (1) | NO300277B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ240838A (cs) |
| PL (1) | PL167668B1 (cs) |
| PT (1) | PT99671B (cs) |
| RU (1) | RU2099353C1 (cs) |
| SI (1) | SI9111886B (cs) |
| SK (1) | SK280642B6 (cs) |
| TW (1) | TW216396B (cs) |
| YU (1) | YU48680B (cs) |
| ZA (1) | ZA919518B (cs) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2254083A (en) * | 1991-03-28 | 1992-09-30 | Italfarmaco Spa | Anticoagulants from e.coli saccharide |
| FR2684385B1 (fr) * | 1991-11-28 | 1997-08-01 | Sanofi Elf | Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. |
| US5696100A (en) * | 1992-12-22 | 1997-12-09 | Glycomed Incorporated | Method for controlling O-desulfation of heparin and compositions produced thereby |
| FR2709132B1 (fr) * | 1993-08-17 | 1995-11-17 | Sanofi Elf | Fragment d'ADN portant le gène codant pour l'enzyme de fragmentation du N-acétylhéparosane et les séquences adjacentes permettant son expression, enzyme recombinée et son utilisation. |
| IT1282994B1 (it) * | 1996-05-10 | 1998-04-03 | Inalco Spa | Derivati del polisaccaride k5 aventi elevata attivita' anticoagulante |
| IT1284143B1 (it) * | 1996-09-06 | 1998-05-08 | Istituto Scient Di Chimica E B | Eparansolfati semi-sintetici ad elevata attivita' antimetastica e ridotto rischio emorragico |
| IT1289613B1 (it) * | 1997-02-07 | 1998-10-15 | Inalco Spa | Polisaccaridi batterici o-solfatati |
| IT1290814B1 (it) * | 1997-03-24 | 1998-12-11 | Istituto Scient Di Chimica E B | Glicosaminoglicani aventi elevata attivita' antitrombotica |
| US6329351B1 (en) * | 1997-08-28 | 2001-12-11 | Istituto Scientifico Di Chimica E Biochimica “G. Ronzoni” | Semi-synthetic sulphaminoheparosansulphates having high anti-metastatic activity and reduced haemorrhagic risk |
| US6190875B1 (en) * | 1997-09-02 | 2001-02-20 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Method of screening for potential anti-metastatic and anti-inflammatory agents using mammalian heparanase as a probe |
| US20040213789A1 (en) * | 1997-09-02 | 2004-10-28 | Oron Yacoby-Zeevi | Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies |
| US20030161823A1 (en) * | 1998-08-31 | 2003-08-28 | Neta Ilan | Therapeutic and cosmetic uses of heparanases |
| US6177545B1 (en) * | 1997-09-02 | 2001-01-23 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications |
| US6699672B1 (en) | 1997-09-02 | 2004-03-02 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use research and medical applications |
| US20020088019A1 (en) * | 1997-09-02 | 2002-07-04 | Oron Yacoby-Zeevi | Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos |
| US20010006630A1 (en) * | 1997-09-02 | 2001-07-05 | Oron Yacoby-Zeevi | Introducing a biological material into a patient |
| RU2138269C1 (ru) * | 1997-12-04 | 1999-09-27 | Ашмарин Игорь Петрович | Антитромботическое средство |
| EP1074631B1 (en) * | 1998-04-30 | 2005-08-24 | Maruha Corporation | Compounds having glucuronic acid derivatives and glucosamine derivatives in the structure, process for producing the same and utilization thereof |
| US20030217375A1 (en) * | 1998-08-31 | 2003-11-20 | Eyal Zcharia | Transgenic animals expressing heparanase and uses thereof |
| EP1157118A4 (en) | 1999-03-01 | 2002-07-17 | Insight Strategy & Marketing | POLYNUCLEOTID ENCODING A POLYPEPTIDE WITH HEPARANASE ACTIVITY AND ITS EXPRESSION IN GENETICALLY MODIFIED CELLS |
| ITMI991465A1 (it) * | 1999-07-02 | 2001-01-02 | Inalco Spa | Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli |
| RU2175552C1 (ru) * | 2000-03-16 | 2001-11-10 | Тюменская государственная медицинская академия | Способ получения антикоагулянта из сапропеля |
| US20020062019A1 (en) * | 2000-03-30 | 2002-05-23 | Pasqua Oreste | Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation |
| IT1318432B1 (it) * | 2000-03-30 | 2003-08-25 | Inalco Spa | Glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride k5 aventi elevataattivita' anticoagulante ed antitrombotica e processo per la loro |
| US8227449B2 (en) * | 2000-03-30 | 2012-07-24 | Glycores 2000 S.R.L. | Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation |
| US20050027117A1 (en) * | 2000-12-18 | 2005-02-03 | Pasqua Oreste | Anticoagulant and antithrombotic LMW-glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide and process for their preparation |
| US6671189B2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-12-30 | Minebea Co., Ltd. | Power converter having primary and secondary side switches |
| AU2003242881A1 (en) * | 2002-06-18 | 2003-12-31 | Glycores 2000 S.R.L. | Low molecular weight oversulfated polysaccharide |
| US8513407B2 (en) | 2002-06-18 | 2013-08-20 | Glycores 2000 S.R.L. | Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained |
| AU2003279430B2 (en) * | 2002-09-23 | 2008-09-11 | Aventis Pharma S.A. | Method of determining specific groups forming heparins |
| FR2845686B1 (fr) * | 2002-10-10 | 2013-08-30 | Aventis Pharma Sa | Melanges de polysaccharides derives d'heparine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant |
| US20060269552A1 (en) * | 2003-06-09 | 2006-11-30 | Oron Yacoby-Zeevi | Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monclonal antibody and other anti-heparanase antibodies |
| FR2857971B1 (fr) * | 2003-07-24 | 2005-08-26 | Aventis Pharma Sa | Melanges d'oligosaccharides derives d'heparine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant |
| ITMI20031618A1 (it) * | 2003-08-06 | 2005-02-07 | Inalco Spa | Derivati polisaccaridici dotati di alta attivita' |
| FR2874931B1 (fr) * | 2004-09-08 | 2006-11-24 | Aventis Pharma Sa | Procede de production de polysaccharide k5 |
| KR101515892B1 (ko) * | 2009-09-01 | 2015-05-04 | 렌슬러 폴리테크닉 인스티튜트 | Ｋ5 헤파로산 발효 및 정제 |
| CN111725495B (zh) * | 2020-06-04 | 2021-07-02 | 大连理工大学 | 一种含n、o原子的网状聚合物的自支撑锂硫正极材料及其制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3211616A (en) * | 1961-12-17 | 1965-10-12 | Yosizawa Zensakn | N, o-sulfated neutral-mucopolysaccharide |
| FR2538404B1 (cs) * | 1982-12-28 | 1985-08-23 | Anic Spa | |
| DE3422518A1 (de) * | 1984-06-16 | 1985-12-19 | B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen | Heparin-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende arzneimittel und ihre verwendung bei der behandlung von fettstoffwechselstoerungen |
| FR2584728B1 (fr) * | 1985-07-12 | 1987-11-20 | Choay Sa | Procede de sulfatation de glycosaminoglycanes et de leurs fragments |
| FR2614026B1 (fr) * | 1987-04-16 | 1992-04-17 | Sanofi Sa | Heparines de bas poids moleculaire, a structure reguliere, leur preparation et leurs applications biologiques |
| EP0333243A3 (en) * | 1988-03-10 | 1989-09-27 | Akzo N.V. | Sulphated k5 antigen and sulphated k5 antigen fragments |
| IT1217458B (it) * | 1988-05-02 | 1990-03-22 | Crinos Ind Farmacoriologica S | Sulfoamino derivati di condroitin solfati,del dermatan solfato e dell' acido ialuronico e loro proprieta' farmacologiche |
| FR2634485B1 (fr) * | 1988-07-21 | 1992-02-28 | Sanopi | Glycosaminoglycanes selectivement o-acyles, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
| NZ226835A (en) * | 1988-11-04 | 1992-10-28 | Andrew Boyle | Weather proof lamp housing: adjustable angle retained by interengaging teeth |
-
1990
- 1990-12-03 FR FR909015114A patent/FR2669932B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-12-02 RU SU915010449A patent/RU2099353C1/ru active
- 1991-12-03 MY MYPI91002233A patent/MY109669A/en unknown
- 1991-12-03 ES ES91403272T patent/ES2099145T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-03 IE IE419791A patent/IE914197A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-12-03 DE DE69125109T patent/DE69125109T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-03 KR KR1019910022172A patent/KR100214752B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-03 PL PL91292624A patent/PL167668B1/pl unknown
- 1991-12-03 AT AT91403272T patent/ATE150033T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-03 YU YU188691A patent/YU48680B/sh unknown
- 1991-12-03 DK DK91403272.7T patent/DK0489647T3/da active
- 1991-12-03 IL IL100229A patent/IL100229A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-12-03 FI FI915697A patent/FI103050B/fi active IP Right Grant
- 1991-12-03 CZ CS913668A patent/CZ279081B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-12-03 MX MX9102353A patent/MX9102353A/es not_active IP Right Cessation
- 1991-12-03 CA CA002056878A patent/CA2056878A1/en not_active Abandoned
- 1991-12-03 PT PT99671A patent/PT99671B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-12-03 HU HU913776A patent/HU214986B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-12-03 AU AU88361/91A patent/AU646112B2/en not_active Ceased
- 1991-12-03 NO NO914751A patent/NO300277B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-12-03 JP JP3319357A patent/JPH051101A/ja active Pending
- 1991-12-03 NZ NZ240838A patent/NZ240838A/xx unknown
- 1991-12-03 SK SK3668-91A patent/SK280642B6/sk unknown
- 1991-12-03 BG BG95567A patent/BG60479B1/bg unknown
- 1991-12-03 SI SI9111886A patent/SI9111886B/sl unknown
- 1991-12-03 BR BR919105239A patent/BR9105239A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-12-03 ZA ZA919518A patent/ZA919518B/xx unknown
- 1991-12-03 EP EP91403272A patent/EP0489647B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-03 AR AR91321298A patent/AR248429A1/es active
- 1991-12-12 TW TW080109743A patent/TW216396B/zh active
-
1995
- 1995-02-15 US US08/389,618 patent/US5550116A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-05-23 GR GR970401191T patent/GR3023541T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS366891A3 (en) | N,o-sulfated heparosanes, process of their preparation and pharmaceuticalcompositions containing said n,o-sulfated heparosanes | |
| US5384398A (en) | High molecular mass N,O-sulphated heparosans, process for their preparation and the pharmaceutical compositions which contain them | |
| US5013724A (en) | Process for the sulfation of glycosaminoglycans, the sulfated glycosaminoglycans and their biological applications | |
| NZ206697A (en) | Depolymerised and supersulphated heparin and pharmaceutical compositions | |
| JP4267916B2 (ja) | 多糖体ｋ５から誘導された高度のアンチトロンビン活性を有するグリコサミノグリカン及びその製法 | |
| JP2007501305A (ja) | 血漿中で高度の抗血栓活性を有する多糖類誘導体 | |
| RU2283319C2 (ru) | Гликозаминогликаны, производные к5-полисахарида, обладающие высокой антикоагулянтной и антитромботической активностью, и способ их получения | |
| AU2003240190B2 (en) | Epimerized derivatives of K5 polysaccharide with a very high degree of sulfation | |
| EP1694714B1 (en) | Low molecular weight polysaccharides having antithrombotic activity | |
| RU2333222C2 (ru) | Эпимеризованные производные полисахарида к5 с высокой степенью сульфатирования | |
| HRP920795A2 (en) | Heparosan-n, o-sulfates, the process for obtaining them and pharmaceutical preparations containing the same | |
| AU2002222358B2 (en) | Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high antithrombin activity and process for their preparation | |
| CN116535532A (zh) | 一种小球藻甘露半乳聚糖或其硫酸酯化合物和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20001203 |