CS593690A3 - Application of difficult to dissolve salt of a hetero-polyacid for the determination of analyte, determination method and agent therefor - Google Patents

Description

Z I ' , trwe-fr?

Vynález se týká použití těž-ko rozpustné soli heteropolykyseliny ke stanov ení|ana-lytu. Kromě toho se vynález týká způsobu stanovení ana-lytu pomocí tvorby modrého barviva na basi heteropoly-kyseliny, jakož i Činidla, které je vhodné pro totostanovení. Konečně se vynález týká také použití těž-ko rozpustné soli heteropolykyseliny pro výrobu činid-la pro stanovení analytu tvorbou modrého barviva na ba-si heteropolykyseliny.

Heteropolykyseliny jsou anor -ganické polykyseliny s alespoň dvěma různými centrál-ními atomy. Vznikají z vícebasických kyslíkatých ky-selin kovu, jako je molybden, wolfram a vanad a neko-vu nebo kovu, jako je fosfor, křemík, arsen, jod, že-lezo, mangan a kobalt jako parciální směsné anhydridy.Jako příklady je možno uvést kyselinu fosformolybde-novou nebo fosforvolfrámovou. Heteropolykyseliny jsouve vodě rozpustné. Jsou však stabilní pouze v kyselýchroztocích. - 3 -

Heteropolykyseliny molybdenua wolframu jsou již dlouhou dobu známé reagencie. Je-jich analytické použití se váže na stanovení fosforeč-nanů a také na důkaz arseničnanů nebo kremičitanů zatvorby odpovídajících heteropolykyselin s molybdenanemnebo wolframanem a za následující redukce heteropoly-kyseliny na modré barvivo, takzvanou heteropolymodř.Zbarvení spočívá v absorpci světla přechodem elektro-nů mezi pětimocným a šestimocným molybdenem nebo wolf-ramem. Heteropolymodř na basi heteropolykyselin jevždy barvivo s vysokou extinkcí, které má v závislostina vlnové délce velmi široké absorpční maximum. Totoje typické pro absorpční pásy transferu náboje.

Heteropolykyseliny pro dů-kaz redukujících sloučenin za tvorby heteropolymodřijsou známé. V publikaci "Spot Tests in OrganicAnalysis” F. Fiegl, Elsevier Publishing Company, 5.vydání, 1956, str. 128 až 129 , je popsáno, že se ky-selina 12-molybdofosforečná redukuje mnoha redukují-cími látkami na molybdenovou modř. Vzhledem k tomu,že tato důkazní reakce je nespecifická, doporučuje sepro docílení určité selektivity, aby se zkoušené vzor-ky zalkalizovaly a potom se extrahovaly etherem.Etherový extrakt obsahuje potom především aromatické - 4 - dusíkaté base a stfesxxEké v etheru rozpustné neutrálnílátky. Kyselé látky zůstávají rozpuštěné ve vodnéfázi. Z pmblikace P.B. Issopou-los, Pharm. Acta Helv. 64 , 82 (1989) je známo, že určitá léčiva, obsahující o-hydrochinonovou struktu-ru, jako například methyldopa působí v roztoku v kyse-lině sírové redukčně na kyselinu molybdofosforečnou azpůsobují tvorbu molybdenové modři. V publikaci M. L. Matheke a kol., Clin. Chem. 53, 2109 - 2110 (1987) je popsá- no použití kyseliny fosforvolframové pro důkaz kyselinymočové. Reduktivní tvorba volframové modři slouží ja-ko indikátor pro přítomnost kyseliny močové. Důkazníreakce je rušena přítomností redukčně působících lé-čiv. Z publikace B. Klein a kol.,Clin. Chem. 12 , 816 - 825 (1966) je známé stanove- ní glukózy v seru nebo plasmě, které spočívá v násle-dujících reakčních krocích :

Glukóza se oxiduje pomocí hexakyanoželezitanu drasel-ného, přičemž vytvořený hexakyanoželeznatan draselný - 5 - působí redukčně na kyselinu fosformolybdenovou a způ-sobuje tvorbu molybdenové modři. Vzhledem k tomu, žesérum a plasma může obsahovat různá množství kyselinymočové, léčiv nebo dalších redukčně působících látek,jako je například bilirubin a glutathion, je jejich rušivý vliv při tomto postupu předprogramován.

Nevýhoda všech známých ana-lytických metod, které využívají reduktivní tvorbu he-teropolymodři z heteropolykyselin, spočívá předevšímv nespecifitě těchto důkazních reakcí. Velmi mnohoredukujících substancí může působit rušivě, nebočrovněž vedou ke tvorbě heteropolymodři. Kromě tohojsou heteropolykyseliny stabilní pouze v kyselém pro-středí. Toto velice silně omezuje rozsah použití.

Dosud není známé obzvláště spojení tvorby heteropolymodři s enzymatickými reakčními kroky pro specifický důkaz a pro specifické stano-vení látek. Přímo pro důkaz součástí tělních tekutin,jako je krev, sérum, plasma, moč a podobně, jsou všakčasto zapotřebí enzymatické způsoby stanovení. úkolem předloženého vynále-zu tedy bylo využít tvorby heteropolymodři jako reakce - 6 - pro důkaz a stanovení látek, obzvláště látek obsaže-ných v tělních tekutinách, a obzvláště v kombinaci senzymatickými reakčními kroky» Při tom neiaají působitrušivě redukčně působící doprovodné látky a reakce prodůkaz a pro stanovení mají probíhat při hodnotách pH,potřebných pro enzymatické reakce. Kromě toho má býtmožné provádět reakce pro důkaz a pro stanovení rych-le. Výše uvedený úkol byl vyře-šen použitím těžko rozpustných solí heteropolykyselinpro stanovení analytu.

Bylo zjištěno, že těžko roz-pustná sůl heteropolykyseliny se může výhodně použítpro stanovení analytu, obzvláště tehdy, když analyt jena elektrony bohatý amin nebo k takovému společně sdalšími látkami vede.

Způsob podle předloženého vynálezu ke stanovení analytu za pomoci tvorby hetero-polymodři je vyznačený tím, že se analyt nechá reago-vat s látkou, která vede ke tvorbě na elektrony boha-tého aromatického aminu, který se potom kontaktuje stěžko rozpustnou solí heteropolykyseliny. Samozřejměse může způsob podle předloženého vynálezu použít také - 7 - pro stanovení na elektrony bohatého aromatického ami-nu samotného tak, že se roztok tohoto aminu uvede dostyku s těžko rozpustnou solí heteropolykyseliny. Výše uvedený úkol byl kromě toho vyřešen použitím těžko rozpustné soli heteropoly-kyseliny pro výrobu činidla na stanovení analytu po-mocí tvorby heteropolymodři.

Podle předloženého vynále-zu se dává k disposici činidlo pro stanovení analytuza pomoci tvorby heteropolymodři, jehož podstata spo-čívá v tom, že obsahuje látku, která s analytem posky-tuje na elektrony bohatý aromatický amin a kromě to-ho těžko rozpustnou sůl heteropolykyseliny nebo látky,tuto sůl při kontaktu poskytující. Když má činidlopodle předloženého vynálezu sloužit přímo ke stanove-ní aromatického aminu bohatého na elektrony, postačuje,když obsahuje těžko rozpustnou sůl heteropolykyselinynebo látky takovouto sůl při kontaktu poskytující, vkapalném mediu nebo ve formě vázané na nosiči.

Podle předloženého vynálezuse může těžko rozpustná sůl heteropolykyseliny použítke stanovení analytu. Jako těžko rozpustná sůl hete- ropolykyseliny se ve smyslu předloženého vynálezu ro-zumí taková sůl heteropolykyseliny, která je ve voděnebo vodných mediích, jako jsou pufry nebo tělní teku-tiny, jako je například krev, plasma, sérum, moč nebosliny, zcela nerozpustná nebo pouze velmi málo rozpustná a taková také zůstává podmínek testu a tvorby zbar-vení. Obzvláště je sůl heteropolykyseliny tak špatněrozpustná, že maximálně rozpustitelné množství v kapalném vzorku samotné nestačí pro stanovení v něm obsa-ženého anolytu. Překvapivě se ukázalo, že takováto těžko rozpustná sůl heteropolykyseliny jestabilní nejen v kyselém prostředí, ale také v neutrální a basické oblasti pH , obzvláště až asi pH 10 oMůže se tedy používat v oblastech pH , ve kterých jeaktivní většina enzymů a tím se může využít tvorba he-teropolykyseliny v kombinaci s enzymatickými reakcemi.Především v nerozpustném stavu jsou těžko rozpustnésoli heteropolykyselin podle vynálezu stabilní taképři zvýšených teplotách. Přes špatnou rozpustnost seukázalo, že analyt se dá pomocí soli heteropolykyseli-ny podle předloženého vynálezu velice rychle, to zna-mená během několika málo sekund až několika málo minutdokázat a stanovit v důsledku tvorby heteropolymodři. Při tom je možné selektivní stanovení bez rušení ji-nými redukčně působícími látkami. Toto dovoluje ci-tlivá měřící metoda, která kx obzvláště také kvůli ši-rokému absorpčnímu maximu, které dosahuje od asi 550až přes 1100 nm , nemá žádné zvláštní požadavky naměřící přístroje a dá se také dobře vizuelně sledo-vat.

Podle vynálezu použitelné soli heteropolykyselin jsou soli heterokyselin molyb-denu, molybdenu a wolframu, vanadu a molybdenu nebo va-nadu a molybdenu a wolframu s fosforem, arsenem, kře-míkem nebo germaniem jako heteroatomy. Obzvláště vý-hodné jspu heteropolykyseliny molybdenu s fosforem ne-bo arzenem. Fosfor je jako nekovový atom nejvýhodněj-ší. Jako kovový atom je nejvýhodnější molybden. Zvláště vhodné jsou těžko rozpustné soli kyseliny 12-mo-lybdofosforečné , kyseliny 18-molybdodifosforečné ,kyseliny 12-molybdoarseničné , kyseliny 18-molybdo-diarseničné , kyseliny 11-molybdo-l-vanadofosforečné,kyseliny 10-molybdo-2-vanadofosforečné a kyseliny9-molybdo-5-vanadofosforečné, přičemž jako obzvláštěvýhodnou je třeba hodnotit na základě jejího vysokéhobarevného výtěžku při redukci na bolybdenovou modž ky-selinu 18-molybdodifosforečnou. - 10 -

Těžko rozpustné soli hetero-polykyselin jsou takové, kejichž katianty jsou většínež amoniový iont NH^+ « Jako výhodné je možno uvéstkationty obecného vzorce I R1R2R5R4X+ (I), ve kterém jsou R^ , R2 , R^ $ R4 stejné nebo rozdíl-né a značí alkylovou skupinu,arylovou skupinu nebo aralkylovouskupinu, nebo vodíkový atom, když nejsou všech-ny zbytky stejné, nebo kdye dvazbytky tvoří společně alkyleno-vou skupinu a X značí atom fosforu nebo atom kye-líku . V alkylové skupině a aralky-lové skupině značí alkyl přímý nebo rozvětvený alkylovýzbytek s 1 až 22 uhlíkovými atomy, výhodně s 1 až6 uhlíkovými atomy. Aryl v arylové skupině nebo aralky-lové skupině značí aromatický zbytek se 6 až 10 - 11 uhlíkovými atomy, Obzvláště výhodná je fenylová nebo naftylová skupina.

Jako aralkylová skupina jeobzvláště výhodná benzylová skupina.

Alkylenová skupina je tvo-řena nasyceným nebo nenasyceným uhlovodíkovým řetěz-cem se 4 až 6 uhlíkovými atomy, výhodně se 4 nebo 5uhlíkovými atomy, který je oběma svými konci vázán naX . Kationt obecného vzorce I může obsahovat dvatakovéto alkylenové zbytky, výhodně však je přítomenpouze jeden alkylenový zbytek. V obecném vzorci I značí X výhodně dusíkový atom. Rovněž tak mohou být výhod-né kationty v těžko rozpustných solích heteropolykyse-liný vybrané ze skupiny dusíkatých heteroaromátů, ob-sahujících kvartérní dusíkový atom. Jako příklady jemožno uvést pyridin nebo chinolin, které na svém du-síkovém atomu nesou alkylovou skupinu, arylovou skupi-nu nebo aralkylovou skupinu, přičemž pro definici těch-to zbytků rovněž přísluší významy, uvedené pro zbytky 12 3 4. R , R , R·2 a R · v obecném vzorci I 0 - 12

Nerozpustná sůl heteropoly-kyseliny podle předloženého vynálezu se může napříkladzískat reakcí heteropolykyseliny s odpovídající basic-kou substancí. Zpravidla se k tomu používá jedna lát-ka ve formě roztoku, výhodně ve formě vodného rozto-ku. Mohou se ale obě komponenty soli přidávat v pevnéformě do kapaliny, obzvláště vodné kapaliny, nebo na-opak.

Jako analyt se označuje sta-novovaná látka. Jako obzvláště vhodný se vynález uká-zal pro látky, které se vyskytují rozpuštěné v kapali-ně, obzvláště vodné kapalině. Obzvláště výhodně mohoubýt použity těžko rozpustné soli heteropolykyselinpro stanovení určitých látek v tělních tekutinách, ja-ko je například krev, plasma, sérum, moč nebo sliny.Jako možné analyty jsou v tomto smyslu například glu-kóza, cholesterol, laktát, NADH nebo ethylalkohol.Zásadně mohou být podle předloženého vynálezu stanove-ny všechny sloučeniny, které mohou být zreagovány sjednou nebo několika jinými sloučeninami na takové látky, nebo jsou samy takovými látkami, které jsou s tovzhledem ke svému redox potenciálu a vzhledem ke svékinetice, redukovat těžko rozpustnou sůl heteropoly-kyseliny během několika málo sekund až několika minut,výhodně v době méně než tři minuty, na heteropolymodř. - 13 - Překvapivě se ukázalo, že na elektrony bohaté aromatic-ké aminy jsou tohoto schopné. Především je překvapivé,že při tom je možné selektivní stanovení, bez rušení ji-nými redukčně působícími sloučeninami.

Pod pojmem na elektrony bo-hatý aromatický amin se rozumí sloučenina, která je naelektrony bohatší než anilin a představuje tedy sil-nější redukční činidlo než je anilin. Na elektrony bo-haté aromatické aminv- mají redox potenciál menší než0,6 V , výhodně menší než 0,45 V» proti normální vo-díkové elektrodě. Velikost redox potenciálu samotné-ho však není rozhodující. Kromě toho je důležité, abyodpovídající látka redukovala rychle, to znamená zaméně než asi tři minuty, těžko rozpustnou sůl heteropo-lykyseliny na heteropolymodř. V úvahu přicházejí na-příklad všechny anilinové deriváty, které nesou jedennebo několik +1 a/nebo +M substituenty, jako je hy-droxylová skupina, alkj^lová skupina, alkoxylováskupina,aryloxyskupina, alkylthioskupina, arylthioskupina,aminoskupina, monoalkylaminoskupina a dialkylaminosku-pina.

Alkylová skupina, alkoxylováskupina, alkylthioskupina, monoalkylaminoskupina a di-alkylaminoskupina jsou zbytky, ve kterých značí alkyl uhlo-vodíkový zbytek s 1 až 6 uhlíkovými atomy, x^erý muže 14 - být substituován hydroxylovou skupinou, aminoskupinou,která je popřípadě jednou nebo několikrát substituova-ná alkylovou skupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy, dá-le skupinou POýÍ2 , skupinou SO^H nebo skupinouCO^H . Zbytky kyselin ?0^Ho , SOyí a qqOH Se ra0“hou vyskytovat jako takové nebo ve formě solí, obzvláš-tě jako amonné soli, soli s alkalickými kovy nebo s ko-vy alkalických zemin.

Aryloxyskupiny a arylthiosku-piny jsou zbytky se 6 až 10 uhlíkovými atomy, přičemžobzvláště výhodné jsou fenoxyskupina a fenylthioskupi-na.

Pod pojmem deriváty anilinuse rozumí sloučeniny, které nesou na aromatickém kru-hovém systému nesubstituovanou aminoskupinu nebo ami-noskupinu jednou nebo několikrát substituovanou alky-lovou skupinou, přičemž tento aromatický kruhový systémje substituován jedním nebo několika aromatickými a/nebo alicyklickými kruhy. Jako aromatické kruhy při tompřicházejí v úvahu jak uhlovodíkové aromatické kruhovésystémy, tak také heteroaromáty. Jako příklady je mož-no uvést anelované benzenové nebo naftalenové kruhynebo anelovaný pyridinový kruh. 15 -

Pod pojmem alicyklické kruhyse rozumí nasycené nebo nenasycené cykloalifatickékruhy s 5 až 7 uhlíkovými atomy, výhodně s 5 nebo 6uhlíkovými atomy.

Jako možné substituenty alky-lové aminoskupiny mohou být například uhlovodíkovézbytky s 1 až 6 uhlíkovými atomy, které jsou substi-tuovány hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, která jejednou nebo několikrát substituovaná alkylovou skupinous 1 až 6 uhlíkovými atomy, skupinou PO^H^ , skupinouSO^H nebo skupinou COgH . Kyselinové zbytky se mohouvyskytovat jako takové nebo ve formě solí jako soliamonné, soli, s alkalickými kovy nebo s kovy alkalických zemin. 16 -

Obzvláště vhodné jsou jako

na elektrony bohaté aromatické aminy sloučeniny obec-ného vzorce II

N R* /11/, ve kterém značí R^ hydroxylovou skupinu nebo amino-skupinu, přičemž aminoskupina jepopřípadě jednou nebo dvakrát substituovaná alkylovou skupinou aalkylová skupina je popřípadě substituovaná hydroxylovou skupinouaminoskupinou, substituovanou po-případě jednou nebo několikrát alkýlovou skupinou, dále skupinouPO^H0 , skupinou SO^H nebo sku-pinou C0oH , 17 - 6 7 R a R které jsou stejné nebo růz-né , vodíkový atom nebo alkylo-vou skupinu, přiěemž alyklováskupina je popřípadě sub-stituovaná hydroxylovou sku-pinou , aminovou skupinou, po-případě jednou nebo několi-krát substituovanou alkylovouskupinou, skupinou PO^H^ ,skupinou SO^H nebo skupinouCOgH a R®, R"' , R"LQ a R-l které jsou stejné nebo různé, značí vodíkový atom, alkylovouskupinu, alkoxylovou skupinu, alkyl-thioskupinu, aryloxyskupinu, arylthio-skupinu, atom halohgenu, karboxylovouskupinu, karboxyalkylovou skupinu ne-bo alkoxykarbonylovou skupinu.

Alkylové skupiny a alkyly valkylthioskupině, karboxyalkylové skupině a alkoxykar-bonylové skupině představují uhlovodíkové zbytky s1 až 6 uhlíkovými atomy. Obzvláště výhodné jsou zbytkys 1 až 3 uhlíkovými atomy. 18

Alkoxylové zbytky obsahují rovněž 1 až 6 uhlíkových atomů, obzvláště výhodné jsoualkoxylové zbytky s 1 až 3 uhlíkovými atomy. Aryloxy-skupiny a arylthioskupiny jsou zbytky se 6 až 10 uhlí-kovými atomy, přičemž obzvláště výhodná je fenoxysku-pina a fenylthioskupina. Atom halogenu představujechlor, fluor, brom nebo jod. Jako halogenové substi-tuenty jsou výhodně chlor a brom. SO^H nebobo ve forměkovy nebo s

Zbytky kyselin , CO2H se mohou vyskytovat jako takové ne-solí jako soli amonné, soli s alkalickýmikovy alkalických zemin.

Amonné soli jsou takové, kte-ré obsahují amoniový iont , nebo takové, které obsahují amoniové kationty, jednou nebo několikrát sub-stituované alkylovou skupinou, arylovou skupinou neboaralkylovou skupinou. Alkyl v alkylové^ a aralkylovéskupině značí uhlovodíkový zbytek s 1 až 6 uhlíkovýmiatomy. Aryl v arylově skupině a aralkylové skupiněznačí aromatický kruhový systém se 6 až 10 uhlíkovýmiatomy, přičemž výhodná je fenylová skupina. Výhodnýaralkylový zbytek je Benzylová skupina. - 19 -

Jako soli s alkalickými ko-vy je možno jmenovat obzvláště soli lithné, sodné adraselné. Výhodné soli s kovy alkalických zemin jskousoli horečnaté a vápenaté.

Na elektrony bohaté aroma-tické aminy je možno bezprostředně stanovit za pomo-ci těžko rozpustné soli heteropolykyseliny tvorbou he-teropolymodři. l«ohou se stanovit látky, které se che-mickou nebo enzymatickou reakcí s dalšími látkamistechiometricky převedou na aromatický amin bohatý naelektrony. Například se mohou jako reakční sloýky po-užít takové látky, které již v sobě základní struktu-ru na elektrony bohatého aromatického aminu obsahují,přičemž se tento amin z uvedené látky chemickou neboenzymatickou reakcí se stanovovaným analytem může uvol-nit. Výhodně se pod takovýmito látkami rozumí takovésloučeniny, které hydrolýzou poskytují na elektrony bo-hatý aromatický amin. Jako příklady je možno uvéstamidy, estery nebo glykosidy na elektrony bohatých aro-matických aminů.

Anályty, které mají být sta-novovány, jsou výhodně enzymy, které katalyzují re-akce odpovídajících substrátů na aromatické aminy bo- - 20 - haté na elektrony, obzvláště hydrolázy. Jako příkladyje možno jmenovat enzymy štěpící amidové vazby a/ne-bo peptidové vazby, esterové vazby, což jsou vazbykarboxylových kyselin, kyseliny fosforečné nebo kyse-liny sírové a enzymy Štěpící glykosiaické vazby. Dále se jedná také o transferázy, které katalyzujípřenos skupin, jako je například gama-glutamyltrans-feráza. Dále je také možno napří-klad stanovovat látky, které se mohou enzymaticky oxi-dovat, přičemž se jako akceptory elektronů používajítakové sloučeniny, které redukcí poskytují na elektronybohaté aromatické aminy. - Především pro látky, obsa-žené v tělních tekutinách, jako je krev, plasma, sérum,moč nebo sliny, je znám velký počet oxidoreduktáz,které vždy specificky určité látky rozeznají a v pří-tomnosti akceptoru elektronů tyto látky oxidují.

Jako příklady je možno uvéstna flavinu závislé oxidázy, jako je oxidáza L a Daminokyselin, cholesterol*oxidáza , glukózooxidáza, glycerol-5-fosfátoxidáza, laktátoxidáza nebo pyruvátoxi-dáza a na NAD(P) nezávislé dehydrogenázy, jako je napyrrolochinolin-chinonu závislá glukosodehydrogenáza,nebo také diaforázu (NADH: dye-oxidoreduktáza) „ - 21 V případě oxidoreduktáz, obzvláště u oxidáz a na NAD(P) nezávislých dehydro-genáz, je možno pro enzymatickou oxidaci pouužít ak-ceptory elektronů, které se enzymatickou oxidací en-zymového substrátu redukují na aromatický amin, boha-tý na elektrony. Tak se mohou dokázat a stanovit po-tom takové látky, které se enzymaticky oxidují, uve-dením vzniklého aromatického aminu bohatého na elektro-ny do styku s těžká rozpustnou solí heteropolykyseli-ny za vzniku heteropolymodři.

Jako výhodné akceptory elektronů ve smyslu předloženého vynálezu je možno vtéto souvislosti jmenovat obzvláště aromatické nitro-sosloučeniny, oximy a hydroxylaminy. Obzvláště výhod-né jsou aromatické nitrososloučeniny a oximy. Zcelazvláště výhodné jsou takové nitrososloučeniny a oximy,které jsou popsané v EP přihlášce č. EP-A-0554 441 .

Pro provádění stanovení analytu 'tvorbou heteropolymodři podle předloženého vy-nálezu postačí, když se analyt výše popsaným způsobemnechá reagovat se sloučeninou na aromatický amin bo-hatý na elektrony, načež se tento kontaktuje s těžko - 22 rozpustnou solí heteropolykyseliny. Když je na elek-trony bohatý aromatický amin samotný bezprostředněstanovovaným B±xk±XB analytem, uvádí se tento bez před·ehozí chemické nebo enzymatické reakce ve átyk s těž-ko rozpustnou solí heteropolykyseliny.

Zpravidla se alespoň nako-nec vyskytuje na elektrony bohatý aromatický amin, pů-sobící na těžko rozpustnou sůl heteropolykyseliny, vrozpuštěné formě, výhodně ve vodném roztoku, napříkladrozpuštěný ve vodě, v pufru nebo v tělní tekutině. Výhodně je v případě, že stanovovaný analyt není sám naelektrony bohatým aromatickým aminem, sloučenina nut-ná společně s analytem k přípravě aromatického aminu,bohatého na elektrony, rozpustná ve vodných kapali-nách. Vodná kapalina se může přidávat ke vzorku předkontaktováním s těžko rozpustnou solí heteropolyky-seliny. Může se ale také uvést do kontaktu teprve spoléčně s těžko rozpustnou solí hetropolykyseliny nebodokonce nakonec se zkoumaným vzorkem. Jaké pořadí servolí je závislé na jednotlivých případech a může býtodborníky zvoleno v závislosti na prováděném analytic-kém stanovení na základě všeobecných odborných poznat-ků nebo na základě provedených orientačních pokusů.Látka, potřebná pro přípravu na elektrony bohatého - 25 aromatického aminu, se může do vodného vzorku přidávatv pevné nebo rozpuštěné formě. Látka, poskytující společně se stanovovaným analytem na elektrony bohatý aromatic-ký amin, se musí se vzorkem kontaktovat v tak velikémmnožství, aby se mohl veškerý analyt přivést k reakci.Výhodně se se tato látka přidává ve dvou až desetiná-sobném přebytku. Těžko rozpustná sůl hetero-polykyseliny se může uvádět do kontaktu se zkumanýmvzorkem ve formě pevné látky. Může se ale také pou-žít ve formě suspenze v kapalině, výhodně ve vodné ka-palině, přičemž se potom pro provádění stanovení ta-to suspenze smísí se zkoumaným vzorkem. Za přítomnostistanovovaného analytu se tvoří ve vodě těžko rozpust-ná heteropolymodř, která je na základě svého intenziv-ního zbarveni zjistitelná.

Pro kvantitativní stanoveníje možné oddělit ve vodě těžko rozpustnou heteropoly-modř, jakož i nezreagovanou sůl heteropolykyseliny, odkapaliny, například centrifu^ací, potom ji rozpustitve vhodném rozpouštědle, jako je například dimethyl- - 24 sufoxid, a fotonetričky měřit koncentraci barviva na basi heteropolymodři za použití standardních roztoků nebo kalibrační křivky a tím konečně stanovit koncen- traci zjišťovaného analytu. Těžko rozpustná sůl hetero-polykyseliny musí být přítomna v tak velikém množstvíaby ve vzorku přítomný nebo vytvořený na elektronybohatý aromatický amin byl všechen převeden na heteropolymodř, která je v kvantitativní souvislosti s množstvím stanovovaného analytu, popřípadě aromatickéhoaminu bohatého na elektrony. Zásadně se proto musípřidat tolik těžko rozpustné soli heteropolykyseliny,aby až k nejvyšší relevantní koncentraci amxHX aroma-tického aminu bohatého na elektrony zvýšené množství » aminu vedlo ke zvětšení množství heteropolymodři. činidlo podle předloženéhovynálezu, pro stanovení analytu tvorbou heteropoly-modři obsahuje látku, která reakcí s analytem vede karomatickému aminu bohatému na elektrony, a těžko rozpustnou sůl heteropolykyseliny. Takovéto činidlo semůže používat například ve formě suspenze nebo jakolyofilizát, práškovitá směs nebo jako směs slisovanádo tablet. Jednotlivé sučásti se mohou vyskytovat - 25 vedle sebe nebo odděleně, přičemž se každá ze součás-tí může zpracovávat ve své nejúčelnější formě. Je ta-ké možné, že činidlo podle předloženého vynálezu ne-obsahuje přímo ve vodě těžko rozpustnou sůl hetero-polykyseliny, ale obsahuje odděleně pouze nutné kompo-nenty pro přípravu této soli, totiž například hetero-polykyselinu a kationtickou nebo basickou sloučeninu,které se uvedeou ve styk teprve bezprostředně před re-akcí probíhající při stanovení podle vynálezu, po-tom teprve poskytují odpovídající sůl heteropolykyse-liny. Obzvláště výhodné je, když činidlo podle před-loženého vynálezu obsahuje těžko rozpustnou sůl heteropolykyseliňy v jemně rozmělněné formě, takže má velkýreaktivní povrch. Činidlo podle předloženého vyná-lezu může popřípadě obsahovat ještě další reagencie,například pufry a pomoché látky, jako jsou smáčedla,stabilizátory a podobně. Když je stanovovaným analy-tem samotný na elektrony bohatý aromatický amin, ne-ní pro činidlo podle předloženého vynálezu potřebnásamozřejmě žádná látka, která by. teprve s analytem vedla k aromatickému aminu bohatému na elektrony.

Obzvláště výhodné se uká-zalo provedení stanovení podle předloženého vynálezuza použití takzvaného suchého testu, uařízení, Která 26 jsou vhodná pro provádění tohoto suchého testu, jsounapříklad popsána v EP-A 16 587 , DE-A 52 47 608 ,EP-A 262 445 nebo EP-A 256 806 · Mohou být ozna-čována jako nosič testu. Při tom se uloží látky po-třebné pro provádění testu v suché formě, to znamenáne rozpuštěné v kapalině, například do nebo na savýmateriál, jako je například papír, otevřený film po-dle SP-A 16 587 , rouno ze skleněných vláken neboporézní plastová membrána, aby se jmenovaly alespoňněkteré možné materiály, nebo do nebo na botnavý materiál, jako je například odpovídající plastový film,želatina nebo celulóza. Při nanesení ns zkoušené ka-paliny na nosič testu nebo při namočení nosiče testu dozkoušené kapaliny se v nosiči testu vytvoří kapalnéprostředí, ve kterém probíhá důkazní reakce. Reakcízpůsobená tvorba barviva se může vyhodnotit vizuelněnebo fotometričky, například pomocí reflexní fotome-trie.

Pro výrobu činidla podle předloženého vynálezu ve formě zabudované do nosičese vhodný nosný materiál, jako je například filtračnípapír, celulóza nebo rouno z plastových vláken, im- - 27 - pregnuje roztoky a/nebo suspenzemi sloučenin, potřebných pro přípravu tohoto činidla, v lehce těkavýchrozpouštědlech, jako je například voda, methylalkohol,nebo aceton. Toto se může provádět při všech impreg-načních krocích. Často je účelné provádět impregnacive více krocích, přičemž se používají roztoky a/ne-bo suspenze, které vždy obsahují pouze část složek ho-tového činidla. Tak se může například v pivním stup-ni nanést na nosný materiál suspenze těžko rozpustnésoli heteropolykyseliny a ve druhém stupni se naneseroztok látky, která se stanovovaným analytem poskytu-je na elektrony bohatý aromatický amin, jakož i popří-padě pufr a jiné přísady. Takto zpracovaný nosný ma-teriál se může použít jako takový nebo se známým způ-sobem nalepí na držátka nebo proužky plastové folie,aby byl lépe použitelný.

Namísto několikanásobné im-pregnace stejného nosného materiálu se mohou slouče-niny činidla podle předloženého vynálezu rozdělit narůzné nosné materiály, které se při provádění analy-tického stanoveni uvedou do kontaktu, umožňujícího vý-měnu kapaliny.

Pro výrobu testovacích č 28 - nidel zabudovaných na nosiči je možno namísto impreg-novaných nosičů také vyrobit roztoky z filmotvornýchprostředků, to znamená z polymerů nebo z disperzí po-lymerů, které jsou tak viskozní, že se z nich pomocíznámých způsobů, jako je stírání, navalování a podob-né, dají vyrobit filmy. Do těchto roztoků se zabudu-jí složky činidla a popřípadě pufry a pomocné látky.Získaná hmota se nanese na nosnou folii, usuší a hotový film se například zpracuje na testovací proužky. Příklady výhodných testů na nosiči jsou znázorněny na obr. 1 a 6 . Na ostatních obrázcích 2 až 5 a 7 jsou znázorněny diagramy zá-na vislosti reflexe v procentech Času, vlnové délky neboanalytické koncentrycž, dosažené pomocí testů na nosiči podle obr. 1 , popřípadě 6 .

Jednotlivě uvedené obrázky znázorňují : obr. 1 průřez výhodným testem na nosiči, obr. 2 diagram, ukazující závislostreflexe v procentech na čase v sekundách - 29 - obr. 5 obr. 4 obr. 5 obr. 6 obr. 7 po nanesení vzorku na test na nosiči podle obr. 1 pro vzorky a) až f) se vždy různou koncentrací glukózy ; diagram závislosti reflexev procentech na měřené vlnové délce v nano-metrech pro vzorky a) až f) s různýmikoncentracemi glukózy při použití testu nanosiči podle obr. 1 ; diagram závislosti reflexev procentech na koncentraci glukózy při mě-ření s testem na nosiči podle obr. 1 ; diagram závislosti reflexev procentech na koncentraci NADH při mě-ření hh s testem na nosiči podle obr. 1 ; průřez dalším výhodným tes-tem na nosiči a diagram závislosti reflexev procentech na koncentraci ethylalkoholupři měření s testem na nosiči podle obr. 6 . - 50 - Následující příklady prove-dení ukazují některé možnosti způsobů stanovení ana-lytu tvorbou heteropolymodři. Neznamenají však žádnéomezení vynálezu na tyto formy provedení. Obrázkyjsou v příkladech blíže objasněny.

- 31 - Přikladl Důkaz glukózy 18-molybdodifosfátem

Vyrobí se test na nosiči po-dle obr. 1 . Sestává z polyesterové folie o tlouštce350 /um /Melinex, ICI, Frankfurt, SRN/ jako nosnéfolie /1/ o rozměrech 2 x 3 cm . V centru folie senachází otvor o průměru 6 mm . Pomocí transferníholepidla 2 se upevní nosič 6 reagencií, sestávají-cí z 200 /um silné transparentní polykarbonátové fo-lie 5 /Pokalon, Lonza, Rheinfelden, SRl·;/» první rea-genční vrstvy 4 a druhé reagenční vrstvy J , přesotvor nosné folie _1 tak, aby vzorek kapaliny, nanáše-ný přes tento otvor, přišel do styku nejprve se druhoureagenční vrstvou J . Nosič J$ reagencií má rozměr2 x 1 cm . Výroba nosiče 6 reagenciíprobíhá následujícím způsobem : 32 první reagenční vrstva : 113 g dvakrát destilované vody 36»3 g 2% xantanu /hmot./ /Keltrol F, Kelco, Oklaho-21a, USA/ ve 0,2 M citrátovém pufru , gH 7,0 , 69 g Propiofanu /BASU, Ludwigshafen, SRN/ 15 ml 15% /hmot/ nonylsulfátu sodného ve vodě , 6 g propylvinylpyrrolidonu /Kollidon 25 , BASF ,

Ludwigshaf en, SR:'/ , 3,9 g tetrabutylamoniumchloridu , 12 g kyseliny 18-molybdodifosforečné /vyrobena podle G. Bauer, ,:Handbuch der práparativen an-organischen Chemie” , Enkev¥erlag, Stuttgart,1954/ v 15 g vody a 63 g Celatomu LíW 25 /Sagle Picher, Cincinnati,

Ohio, USA/ se rozmíchá do homogenní hmoty a rozetře se na tloušt-ku I50 /um daatransparentní folia 5 · Tato vrstvase nechá usušit přiteplotě 60 °C po dobu jedné hodi-ny.

Druhá reagenční vrstva : 33 - 20 g dvakrát destilované vody , $L6 g oxidu titaničitého RN 56 /Kronos-Titan GmbH,Leverkusen, SRN/ , 36,3 g 2% /hmot./ Keltrolu P /Kelco, Oklahoma, USA/v 0,2 Lí citrátovém pufru, pH 6,0 , 69 § Propiofanu 70 D /BASP, Ludwigshafen, SRN/ ,15 ml 15% /hmot./ nonylsulfátu sodného ve vodě , 6 g Kollidonu 25 /BASP , Ludwigshafen, SRN/ , 188 g vody , 63 g Celatomu 25 UW /Eagle-Picher, Cincinnati,

Ohio, USA/ , 400 mg N,N-bis-/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilinu xx HC1 ve 20 g vody a 2 g glukozaoxidázy /200 U/mg/ ve 12 g vody , se rozmíchá na homogenní směs a rozetře se v tlouštice400 /um na první reagenční vrstvu. Vzduchové bublinyse odstraní a druhá vrstva se suší při teplotě 60 °Cpo dobu jedné hodiny. V čase t = 0 se na výše po-psaným způsobem vyrobený test na nosiči nanese lidská 34 - plasma s a/ O mg glukózy/dcl , b/ 47,5 mg glukózy/ /dl , c/ 108,7 mg glukózy/ml , d/ 200,8 mg glukózy/ /dl , e/ 392,3 mg glukózy/dl a f/ 766 mg glukózy/ /dl . Při 950 nm se měří reemise v % . První měře·ní se provádí po osmi sekundách, další měření ve čtyř-sekundových intervalech, Při vynesení remise /R/v procentech proti době /t/ v sekundách se získá diagram podle obr. 2 . Tvorba barvy a pokles remise jejiž při prvním měření prakticky úplný. Výsledkem jestabilní konečná hodnota, která se může naměřit prak-ticky v libovolné době po startu.

Když se použije test na nosi-či podle obr. 1 , vyrobený způsobem popsaným výše avzorky s koncentrací glukózy a/ 0 mg/dl , b/ 100mg/dl , c/ 240 mg/dl a d/ 800 mg/dl se měří přirůzných vlnových délkách a nanese se remise /R/ vprocentech proti vlnové délce /lambda/ v nm do diagramu, získá se obr. 3 · Jak již bylo řečeno, mohouse pro měření koncentrace glukózy použít libovolné vl-nové délky v rozmezí 550 až více než 1100 nm .

Kvůli velmi plochému spektru je tolerance pro výkyvyměření vlnové délky velmi vysoká. 35 - Příklad. 2

Specifita důkazu glukózy s 18-molybdodifosfátem

Rušivé látky, uvedené v tabul-ce 1 se v udaných koncentracích přidají do lidsképlasmy s a/ 0 mg glukózy/dl /cqiu = 0/ ab/ 110 mg glukózy/dl /CGlu = 110 mg/dl/ . Když setakováto lidská plasma zkouší pomocí testu na nosičipodle obr. 1 , který je popsán a vyroben podle příkladu1 , zjistí se re^misní hodnoty v procentech /% R/ ,měřeno při 660 nm , které jsou uvedené v tabulce 1 .

VO (p

I rušivá látka konečná konc. = 0 Ck,-, = 110 ms/dl

Glu Glu o LP •v C\J co t>- O o co •s ·* •K ·* »v ΓΆ CM CM C\J CM C\J ολ *4- xr M-

Cp cp LP rd c- C\l o LP ΓΡ O op op o op o o i—1 OP <o Ln LP Ό LP <o <O VO LP

i—1 rd i—l i—t Ό Ό i—1 i—1 Td X) nd xi bO bO 'p. bO bO S s bO bO S S o o S s fc=-4 'g txzj O O o o O o i—1 OJ i—1 OP i—1 OJ I—i LP 'ti

O ÍH 05 e •H 3 tí o •rl x! -P co a Ή -P 'tú *81 i—1 'CÚ fj d íd ÍS l-r-l t-M O -P •rd -p Ťd jS O ra rd 3 'tú \RI Cú ÍP> c3 •rd i—1 >n >jg 3 yl r—1 £2 bO b- <Ό

I /pokračování/ rtí 03 I—i d &amp; ctí

Eh i—1 Ti bO S o i—1 i—1 II d i—1 i—1 03 O rtí O H Pí r\ « ·> •X <» o Γ’Ά OJ i—1 00 OJ OJ o "=J- d- '-~r '<1 *^2 ‘ o II d LT\ o kO co o i—1 Pí ** ** •X ·* e» e> co σ\ co co co O O LO to LO LO uo kO ' · o d o i—1 i—1 r—1 1—1 rH 'ctí Ti Ti Ti Ti r—i ctí Pí \ \ \ \ Ti >o bD bD bD bD \ bD ω a a a a bO g ň g o o o o o O Λ1 r-1 o OJ LíO LÍO kO 1—1 'Ctí > O 1 ra i—1 •H !>3 P P ctí d CD dl o O P ctí bO ctí 'ctí 'Ctí O, P !> i—1 o ctí ctí ctí o Ti rtí d d i—1 'ctí 1—1 r^5 •H •H >5 > 02 rtí rtí O •H rd O O CD Ή >q P d> 02 02 I—1 d O O >i Ctí a Ti Já 02 i—1 Ti \ bO a o 1—1 1—1 ctí o >CD a 02 ctí H • Ό Ή d dí CD «2 >02 Ti d •H d rH > Ή d >s . P d N ctí Ό dl dá •H d i—1 •rl bO d •H bD •H O ra Ctí d 'CD P d d Ti CD 'ctí o >N d o O Λ4 d ctí ><D P d >02 CD •rl •Γ-3 i—1 02 •H O > I—1 'ctí ró [S3 T) t® CD PP d 38 - S testem na nosiči podle obr. 1 , který byl vyroben analogicky jako je popsánov příkladě 1 , a který je identický s tam popsanýmtestem na nosiči až na přídavek tetrabutylamoniumchlo-ridu, který je pro srovnávací test na nosiči vynechán,se dosáhne těžko reprodukovatelných a silně rozptýle-ných výsledků. Použitá kyselina 18-molybdofosforečnáse totiž při pH vyšším než 5,5 rozkládá. Kromě tohozde způsobují redukující látky další rušivé zbarvení. Příklad 3

Test na nosiči pro důkaz glukózy na basi 12-molybdo- fosfátu

Když se v receptuře z příkla-du 1 nahradí kyselina 18-molybdodifosforečná stej-ným množstvím kyseliny 12-molybdofosforečné /Fluka,Buchs, Švýcarsko/ , tak se získá test na nosiči se slab-ší tvorbou barvy za přítomnosti glukózy, coz je ob-zvláště vhodné pro vyšší koncentrace glukózy. Při po- Λ užití vzorků o různé, ale známé, koncentraci glukózy/0/ a když se měří vždy rernise /2/ v procentech při6p0 nm , získá se křivka podle obr. 4 . Když se měří - 39 - remise při 950 nm , získá se identická křivka.·

Podobné výsledky se získají s12-molybdoarzeničnanem , 18-molybdodiarzeničnanem ,11-molybdo-l-vanadofosforečnanem , 10-molybdo-2-vana-dofosforečnanem a 9-molybdo-3-vanadofosforečnanem ,přičemž všechny tyto sloučeniny je možno připravit po-dle G. Brauer, "Handbuch der pr&amp;parativen anorganischenChemie” , Bnke-Verlag, Stuttgart /1954/ · V následují-cí tabulce 2 jsou uvedeny názvy a vzorce heteropoly-kyselin, jakož i absorpční maxima odpovídajících hete-ropolymodří. o d-

•H • >Sh« dctí oS £ sd 3

CM m

kO Ή Pí

>O P4

ÍH

O 03 d ctí r—IOft

O řd 03 -í-> 0) d o 03 g

O

fcO !> ctí 1 £2 3 g 1 in cd O CM m O o CM σ\ d" r- kO CM co kO co kD kO kO c- o o CM I CM W o j !"T< o o CM O ! o CM CO CM ‘-r* CM j CM CM d CM Otí H~t t K •Μ- Pí 1 Pí Pí ň 1 PÍ Η M I K \ N K 1 M \ CM CM kO \ O \ kO o O o d" O O O d- 00 "kr o d d- CO o d O CM O O r-1 CM O > > cd CM O d I—1 O > 1-‘ dd O CM d i—l σ> O '“oj 03 O o o PM Fra •ď ~i d. S K d kO kD \ cd Ctí CO ,otí d- m to. w f=H hr-t Η—1 rd heteropolymodř z různých heteropolykyselin 'cd Pí >C3 0)

ÍM

O d

M

O

**CtJ ň >o 03 Í4

O d 03

O 'ctí Pí >C3 03

Pl

O d 03 >5 tq' o443 i—Itú 'Ctí S>5 d d O řtí Pí Pí '>1 o O d 3C3 d 1—1 Pí d d O ctí 03 O 03 d ctí ctí d d μ 03 03 o ň Pí ctí d o Ctí 03 ctí ctí Pi •rl d Pí Fh í> > ctí pi 03 Ctí d Pi 1 1 !> •rl o Pí Ctí i—1 CM 1 >C3 d >C3 pí Pi 1 1 cd o 03 3 >o o o 1 O Ή R Pi •rl d d o d d O >03 Pi d d d Ή >s d •rl 03 >5 d Pí d 03 Pí . CM d d id >o O O 03 ' (H O O d 44 ctí g «Η tO Ctí S s O 3 44 1 •rl ÍH •rl 1 1 S d +> CM d Ctí d d o 1 03 'Ctí i—1 o O o i—1 1—1 Cd ÍH r—1 d d d Ctí d d d Ctí ctí ctí o Ή Pí >s >5 i>5 Pi Pi Pí í—1 ES3 •H d d 1—1 •rl •rl •rl 'Ctí O d O O o d d d S d 03 5 g g 03 03 03 O . 03 Γ 1 1 03 03 03 '!>s 33 CM co t--.r i r3> id Λί d d i—1 4<J v* 44 ctí b/ mnoho redukčního činidla /glukózy/ 41 - Příklad 4

Test na nosiči pro stanovení RAD/P/H

Když se v receptuře podle příkladu 1 nahradí glukózaoxidáza stejným množstvímdiaforázy, získá se test na nosiči pro stanoveníIIAL/P/H . Ze vzorků o známé koncentraci KADH a měře-ní reakce v procentech při 660 nm se získá křivka,znázorněná na obr. 5 · Tato křivka může sloužit jakokalibrační křivka pro stanovení neznámých koncentracíRADH .

Metody pro tvotbu RAD/P/Hz RAD/P/ - závislé dehydrogenázy, odpovídající sub-strát a RAD/P/ jsou známé. Po odpovídající předběžnéreakci se může test na nosiči použít pro důkaz substrá-tů dehydrogenázy nebo k důkazu dehydrogenáz samotných. Příklad 5

Test na nosiči pro stanovení ethylalkoholu pomocí al-koholdehydrogenázy a diaforázy, jakož i 18-molybdodi- fosforečnanu 42 - a/ Výroba testu na nosiči

Vyrobí se test na nosiči podleobr. 6 . Tento test je sestaven tak, ze indikátorovýmsystémem, sestávajícím z 4 ml 0,2 LI citrátového pufru, pH 6 , 10 ml 10% /hmot./ nonylsulfátu sodného ve vodě , 60 mg tartazinu , 0,1 g N,N-bis-/2-hydroxyeťnyl/-p-nitrosanilinu x HC1 , 6,8 ml 20% /hmot./ kyseliny 18-molybdodifosforeč-né ve vodě , 1 g 25% /hmot./ tetraethylamoniumchloridu ve vodě , 72 g 5% /hmot./ Kollidonu 25 /BASF, Ludwigsha- fen, SRN/ v 50 mlď citrátového pufru, pH 6,0 , je napuštěn savý papír /Langfaser, Schoeller, Germsbach,SRN/ a tento je potom po dobu 30 minut při teplotě40 °C usušen.

Enzymy se nacházejí na zvlášt-ním papíře /Langfaser, Schoeller, Germsbach, SRN/ .

Tento papír je nasycen roztokem, sestávajícím z 43 - 50 g 0,2 M fosfátového pufru , pH 7»0 48 g vody , 2 ml 10% /hmot./ nonylsulfátu sodného .ve vodě , 6g diaforázy /15 U/rag lyofilizátu/ a 2 g alkoholdehydrogenázy a potom vysušen po dobu 20 minut při teplotě 40 °G.Takto vyrobený indikátorový papír 13 a enzymový pa-pír 12 se nastříhají na proužky o velikosti 14 x 6 mm .

Na polyesterovou folii o síle350 /um , délce 9,8 cm a šířce 0,6 cm /Melinex, ICI, Frankfurt, SRN/ se pomocí proužku tavného lepid-la 18 připevní 16 mm dlouhý, 6 mm široký a 0,25 mmsilný pásek rouna ze skleněných vláken o plošné hmot-nosti 25 g/m^ jako transportní rouno /14/ > dále 6 mm široký, 6 mm dlouhý a 700 /um silný proužek rou-o na ze skleněných vláken o plošné hmotnosti 60 g/m'1’jako oddělovací rouno /15/ erythrocytů a cochrannámřížka 16 ze Scrynelu PE280HC rot /Ztiricher Beutei-tuchfabrik AG, RUschlikon, Švýcarsko/ o rozměrech6 x 8 mm a velikosti ok 280 ^um , jak je znázorněnona obr. 6 . Enzymový papír 12 a indikátorový papír 44 - 13 se společně s 200 /Um silnou, 15 mm dlouhou a6 mm širokou transparentní polykarbonátovou folií 11/Pokalon, Lonza, Rheinfelden, SRN/ připevní pomocí kap-ky tavného lepidla 19 na nosnou folii 17 tak ,aby polykarbonátová folie 11 , enzymový papír 12a indikátorový papír 13 nebyly ve styku, tlakem všakse mohou dostat jak do vzájemného styku, tak do kontak-tu s kapalinou, která se nachází v transportním rou-nu 14 . b/ Stanovení ethylalkoholu

Na testu na nosiči, připra-veném podle odst. a/ a znázorněném na obr. 6 , sena ochrannou mřížku 16 nanese 32 /Ul krve. Pouplynutí 60 sekund se tlakem na transparentní folii 11přitlačí enzymový papír 12 a indikátorový papír .12na transportní rouno 14 a na zde se nacházející sérum.Po 120 sekundách se přes transparentní folii 11změří remise v procentech při 642 nm . Při použitíznámých ale různých koncentrací ethylalkoholu v krvi sezíská křivka podle obr. 7 · Tato křivka může sloužitjako kalibrační křivka pro stanovení neznámých koncen-trací ethylalkoholu ve vzorku. 45 -

Stanovení beta-galaktozidázy /EC 3.2.1.23/ Příklad roztoky

Používají se následující pufr : substrát neutralizátor indikátor enzym 0,1 M HEPES , 20 mil chlorid horečna-tý, pH 6,8 , 50 mid p-aminofenyl-beta-galaktozid/vyrobený z p- nitro feny 1- bet a-D-ga-laktozidu hydrogenací vodíkem na pa-lladiu na uhlí podle "Organikum" , VEB Deutscher Verlag der Wissenschaf-ten, 15. vydání, Berlín 1976/ ve vodě 1 N hydroxid sodný , 100 mg/ml kyseliny 18-molybdodifos-forečné a 50 mg/ml íenyl-trimethyl-amoniumchloridu ve vodě a 180 U/ml v pufru /udávaná enzynováaktivita se vztahuje na použití o-nitrofen-pl-galaktozidu jako substrá-tu/ . - 46 -

Pro provedení testu se v jedné reakční nádobě smísí : pufr 780 /ul indikátor 100 /Ul neutralizátor 20 /u! enzym a/ 0 , e/ 4 , b/ 1 , c/ 2 , d/ 3f/ 5 /ul .

Po inkubaci poje po dobu 30se rozpustí vextinkce /E/. dobu 4 1/2 minuty se směs zcentrifugu-sekund, horní vrstva se slije, sediment1 ml dimethylsulgoxidu a ihned se změří Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3

Tabulka B yul enzymu U/ml enzymu E /800 nm/ 0 0 0,065 1 0,18 0,571 2 0,36 1,245 3 0,54 1,697 4 0,72 2,350 5 0,30 2,907 47 -

Hodnoty vyplývající z této kalibrační křivky mohou být použity pro zjištování ob-sahu beta-galaktozidázy v neznámých vzorcích. Příklad 7

Stanovení alkalické fosfatázy /EC 3.1.3·1·/

Když se v receptuře podle příkladu 6 použije jako substrát 50 míví p-aminofe-nylfosfát /vyrobený podle L. H. De Riemer, C. P.Meares, Biochemistry 20 , 1606 /1981// a jako pufr1M diethanolamin, 1 mM choridu horečnatého, 0', 1 mMchloridu zinečnatého při pH 9,8 , potom se může uve-deným způsobem stanovovat enzym alkalická fosfatáza.Pomocí známých koncentrací enzymu se zjistí jako v pří-kladu 6 lineární souvislost mezi koncentrací enzymua extinkcí při 800 nm . Příklad 8

Test na nosiči pro důkaz gama-glutamyltransferázy/EC 2.3.2.2/ 48 -

Test na nosiči se zhotoví ana-logicky jako je popsáno v příkladě 1 , avšak s násle-dujícími změnami :

Ve druhéik reagenční vrstvě se pufr /2 m hmotnostní Keltrolu P ve 0,2 H citráto-vém pufru, pH 6/ nahradí 2 % hmotnostními Keltrolu Pve vodě a h,K-bis-/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilin xx HC1 a glukozaoxidáza se vypustí. Mezi transfernílepidlo 2 a druhou reagenční vrstvu _3 θθ zařadí pa-pír napuštěný substrátem, připravený následujícím způ-sobem : z v 2

Jemný savý papír /papír na čajové pytlíky//l2 g/m /se nasytí roztokem 250 mM glycylglycinu a 20 mMgama-L-glutaniyl-3-karboxyl-l,4-fenylendiaminu .. /připra-veného podle - EP-A 103 823/ ve 250 mM tris-pufru pH 7,6 , načež se potom po plotě 50 °C . dobu 20 minut suší při te- V 0,1 M tris-pufru s 10 mg/ml albuminu z hovězího sera o pH 7,5 se připraví zřeďo- vací řada gama-glutamyltransferázy. 10 /Ul tohoto roztoku se nanese na výše popsaný test na nosiči. Pojedné minutě se při teplotě 37 °C neměří hodnoty re- 49 - mise v procentech při vlnové délce 950 mm , uvedené v následující tabulce 4 .

Tabulka 4 koncentrace enzymuU/ml remise při 950 nm v % 0 50,0 0,245 57,0 0,471 55,5 1,31 52,7 2,77 49,7 4,93 45,8 7,39 42,2 9,85 39,0 • Tímto způsobem získaná křivkase může využít ke stanovení neznámých obsahů gama-glu-tamyltransferázy v kapalinách. 50 - Příklad. 9

Test na nosiči pro důkaz kyselé fosfatázy /EC 3·1·3·2/

Analogicky jako v příkladě 8se získá test na nosiči pro důkaz kyselé fosfatázy,když se jemný savý papír nasytí 10 ml p-aminofenyl-fosfátu /vyrobeného podle L. ΙΊ. De Riemer, C. E. leares, Biochemistry 20 , 1606 /1981// v 0,1 M citráto-vého pufru, pH 5,0 :

Claims (15)

1. 51 - 1. patentové nároky

   solí heteropolykyselin pro stanovení analytu.
2. 2. Použití těžko rozpustné soli heteropolykyseliny podle bodu 1 , vyznačující se tím, že analytem jena elektrony bohatý aromatický amin nebo látka, kteráv předběžné reakci s jednou nebo několika dalšími lát-kami, popřípadě enzymy, k takovémuto aminu vede.
3. 3. Způsob stanovení analytu po-mocí tvorby heteropolymodři, vyznačující se tím, že se analyt ne-chá zreagovat s látkou, která vede k na elektrony bo-hatému aromatickému aminu, se kterým se uvede do stykutěžko rozpustná sůl heteropolykyseliny.
4. 4. Způsob podle bodu 3 > 52 - vyznačující se tím, že se použijetěžko rozpustná sůl heteropolykyseliny molybdenu, mo-lybdenu a wolframu, vanadu a molybdenu nebo vanadu amolybdenu a. wolframu s fosforem, arsenem, křemíkem ne-bo germaniem jako heteroatomy.
5. 5. Způsob podle bodů 3 a 4 , vyznačující se tím, že se jako těž-ko rozpustná sůl heteropolykyseliny použije taková sůl,jejíž kationt je větší než amoniový iont. b.
6. Způsob podle bodů 3 až 5 > vyznačující se tím, že se jako těž-ko rozpustná sůl heteropolykyseliny použije taková sůl,jejíž kationt odpovídá obecnému vzorci I rVrW /1/ , ve kterém « R^" , R^ , R^ a R^ jsou stejné nebo růz- né a značí alkylovou skupinu, arylo-vou skupinu nebo aralkylovou skupinu,nebo značí vodíkový atom když nejsouvšechny zbytky stejné, nebo dva zbytky společně tvoří alky-lenovou skupinu a 53 - X značí atom fosforu nebo dusíku .
7. 7. Způsob podle bodů 3 až 5 ,vyznačující se tím, že se jako těž-ko rozpustná sůl heteropolykyseliny použije takovásůl, jejíž kationt -je ze skupiny dusíkatých heteroaro-mátů .
8. 8. Způsob stanovení na elektro-ny bohatého aminu pomocí tvorby heteropolymodři,vyznačující se tím, že se roztokstanovovaného na elektrony bohatého aromatického aminuuvede do styku s těžko rozpustnou solí heteropolyky-seliny.
9. 9· XSSSíXSX Činidlo pro stanove- ní analytu za tvorby heteropolymodři, vyznačující se tím, že obsahuje lát-ku, vytvářející s analytem na elektrony bohatý aroma-

   - 54 - tický amin a těžko rozpustnou sůl heteropolykyseliny,nebo k tomu potřebné substance.
10. 10. Činidlo podle bodu 9 ,vyznačující se tím, že obsahujetěžko rozpustnou sůl heteropolykyseliny molybdenu, mo-lybdenu a wolframu, vanadu a molybdenu nebo vanadu, mo-lybdenu a wolframu a fosfor, arsen, křemík nebo germa-nium jako heteroatomy.
11. 11. Činidlo podle bodů 9 a 10 ,vyznačující se tím, že jako těžkorozpustnou sůl heteropolykyseliny obsahuje takovou sůl,jejíž kationt je větší než amonný iont.
12. 12. Činidlo podle bodů 9 až 11 ,vyznačující se tím, že jako těžkorozpustnou sůl heteropolykyseliny obsahuje takovou sůl,jejíž kationt odpovídá obecnému vzorci I R1R2R3R4X+ /1/, ve kterém R1 , R2 , R^ a R4 jsou stejné nebo rozdíl- né a značí alkylovou skupinu, arylo- - 55 - vou skupinu nebo aralkylovou skupinu, nebo značí vodíkový atom když nejsou všechny zbytky stejné, nebo dva zbytky společně tvoří alkeny- lovou skupinu a X značí atom fosforu nebo dusíku .
13. 13. Činidlo podle bodů 9 až 11 , vyznačující se tím, že jako těžkorozpustnou sůl heteropolykyseliny obsahuje takovou sůl,jejíž kationt je ze skupiny kvarterních dusíkatých he-teroaromátů.
14. 14. Činidlo pro stanovení na ele- ktrony bohatého aromatického aminu tvorbou heteropoly-modři, vyznačující se tím, že obsa-huje těžko rozpustnou sůl heteropolykyseliny nebo projejí vznik potřebné substance v kapalném mediu nebo veformě vázané na nosič.
15. 15. Použití těžko rozpustné soli heteropolykyseliny pro výrobu prostředku na stanoveníanalytu tvorbou heteropolymodři.