CZ111197A3 - Process of enzymatic preparation of chiral esters of alpha tertiary carboxylic acids - Google Patents

Process of enzymatic preparation of chiral esters of alpha tertiary carboxylic acids Download PDF

Info

Publication number
CZ111197A3
CZ111197A3 CZ971111A CZ111197A CZ111197A3 CZ 111197 A3 CZ111197 A3 CZ 111197A3 CZ 971111 A CZ971111 A CZ 971111A CZ 111197 A CZ111197 A CZ 111197A CZ 111197 A3 CZ111197 A3 CZ 111197A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
atcc
nrrl
lipase
rhodococcus
group
Prior art date
Application number
CZ971111A
Other languages
English (en)
Inventor
Fateme Sima Sariaslani
Barry Stieglitz
Vincent G Witterholt
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/457,891 external-priority patent/US5580783A/en
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of CZ111197A3 publication Critical patent/CZ111197A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Dosavadní stav techniky
Mnoho agrochemikálií současnosti označováno diastereomerické směsi, požadovaný fyziologický a farmaceutických chemikálií je v jako racemické nebo nicméně v mnoha případech se účinek chemikálií odvozuje pouze od jednoho enantiomeru/diastereomeru, zatímco druhý enantiomer/diasterecmer je inaktivni nebo dokonce škodlivý či inhibující. Chemické a enzymatické technologie pro oddělení enantiomerů se stávají stále důležitějšími nástroji pro přípravu chemikálií s vysokou enantiomerní čistotou.
Patentový dokument US 4,898,822 popisuje přípravu opticky aktivních indolin-2-karboxylových kyselin, založenou na hydrolýze odpovídajících využívá enzymy nebo stereoselektivní esterázovou racemických esterů,· která mikroorganizmy vykazující účinnost. Substráty popsanými v tomto patentu vzorce:
jsou sloučeniny následujícího obecného (KS) hr^cooR
H ve kterém je chirální střed, kterým je sekundárně substituovaný α-uhlikový atom, označen hvězdičkou.
Patentový dokument US 5,202,260 a článek od Yee a kol., J. Org. Chem.(1992) 57: 3525-3527, popisují přípravu opticky aktivních kyselin a jim odpovídajících esterů částečnou enzymatickou hydrolýzou esterů -α-terciálních karboxylových kyselin, která používá enzymy odvozené od Candida lipolytica. Použitý enzym je odvozen pouze z jediných druhů kvasinek a zcela přetransformovává S-ester racemické směsi na odpovídající S-kyselinu, přičemž ponechává R-ester intaktní.
Feichter a kol. popisuje v J. Chem. Soc. Perkin Trans. (1991) 1: 653-654 stereospeciřickou hydrolýzu racemického meihylaíroiaktátu mimo jiné působením α-chymotrypsinu vedoucí ke vzniku odpovídající R-kyseliny a S-esteru.
Peters a kol. popisuje v Appi. Microbiol. Biotechnoi. (1992) 38'. 334-340 stereospeciřickou redukci keto-kyselin nebo esterů vedoucí ke vzniku jim odpovídajících chirálních hydroxy kyselin nebo esterů. Tyto autoři se specificky zabývají stereospeciřickou ketoesterovou reduktázovou aktivitou Candida parapsilosis a Rhodococcus erythropolis, v důsledku které se racemický acyklický ester β-keto kyseliny síereospeciřicky přetransformuje na jemu odpovídající chirální ester hydroxykyseliny.
Podstata vynálezu
Vynáíez poskytuje způsob obohacení oc-terciální karboxylových kyselin nebo esterů ze směsí esterů karboxylových kyselin uvedením těchto směsí do kontaktu s biokatalyzátorem obsahujícícm celé buňky, nebo částečné popřípadě vysoce čisté enzymatické přípravky.
Enantiomerické esterové sloučeniny se mohou použít jako meziprodukty pro přípravu farmaceuticky a zemědělsky účinných sloučenin. Například WO 92/11249 popisuje methyl 5-chloro-2,3-dihydro-2-hydroxy-1 -oxo-1 H-inden-2karboxylát jako meziprodukt při přípravě určitých artropodicidních karboxanilidů (působící proti členovcům).
Vynález enantiomericky který zahrnuje vzorce !
poskytuje zejména způsob obohaceného esteru karboxylové uvedení směsi enantiomerů esteru přípravy kyseliny, obecného
R1
R2
R3 o
OR4 ve kterém
R1 a R2 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny zahrnující fenylovou skupinu a alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž každá skupina může být případně substituována až 3 členy skupiny obsahující halogen, alkóxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a fenoxyskupinu, za předpokladu, že R1 a R2 jsou vzájemně odlišné; nebo
R1 a R2 a atcm uhlíku, na který jsou navázány společně tvoří skupinu
R5-
přičemž chirální do kontaktu s zahrnující produkty
Chirazyme L-5 lipáse, SP 526 lipáse,SP 539 ve které
X Se zvolí ze skupiny zahrnující C=O, 0, S a NH;
R3 se zvolí ze skupiny zahrnuj ící OH a NH2;
R4 znamená alkylovou skupinu, s 1 až 6 atomy uhlíku; a
R5 se zvolí ze skupiny zahrnující atom halogenu a fíuoroalkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, uhlíkový atom je označen hvězdičkou; biokatalyzátorem zvoleným ze . skupiny IM60 Lipozyme; Chirazyme L-2 lipáse, Chirazyme L-7 lipáse, SP 524 lipáse, proteáse, Lipoiáse Lipáse, CR Lipáse, .Corynebacetium hoagii ATCC 7005, Flavobacterium sp. ATCC 27551; Pseudomonas . oleovorans NRRL-B-3429, Pseudomonas putida ATCC 23973, Pseudomonas sp. NRRL-B11330, Rhodococcus equi ATCC 14887, Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus coprophilus NRRL-B16536, Rhodococcus rhodnii NRRL-B-16535, Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602,. Rhodococcus sp. NRRL-B-1 6535, Rhodococcus sp. NRRL-B-16534, Streptomyces griseus ATCC 6855, Xanthomonas campestris ATCC 21818, Candida guilliermondii ATCC 6260, Candida kefyr ATCC 4135, Candida iropicalis ATCC 46491, Rhodotoruia rub ra ATCC 4557, Yarowia lipolytica ATCC 9773, Aspergiílus alliacrus ATCC 10060, Beauveria bassiana ATCC 26037,Beauveria bassiana ATCC
74292, Beauveria bassiana ATCC 26851, Beauveria bassiana ATCC 38657, Beauveria nivea ATCC 74294, Cunninghamella echinulata ATCC 8688, Lophotrichus maríinii ATCC 11221, Paecilomyces marguandi ATCC 10525, Pestatotia microspora ATCC 11816, Rhizopus oryzae ATCC 10404, Rhizopus oryzae ATCC 22580,
Sporoboiomyces sp. ATCC 20290, Trichophyton concentricum ATCC 74293, Bacillus cereus NRRL-B-1 4591, Nocardia sp. NRRL-B-5646, Pseudomonas putida ATCC 17453, Sacharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034, Schizosaccharomyces ostosporus NRRL-Y-854, Aspergillus alliaceus NRRL-315, Penicillium chrysogenum ATCC 10002,
Peniciliiumnoiatum ATCC 36740, Amycolatopsis rugosa NRRL-B2295, Rhodococcus equi ATCC 13556, Streptomyces endus NRRL-B-2339, Aspergillus candidus ATCC 20022 a Mycophyta microspora ATCC 89821.
Zjistilo se, že některé z výhodných biokatalyzátorů podle vynálezu jsou použitelné pro obohacení dvou specificky výhodných směsí enantiomerů esterů: ethyl amethyl-4-fenoxybenzenacetátu:
OH o ch, och2ch3 ;
a methyl 5-chloro-2,3-dihydro-2-hydroxy-1 -oxo-1 H-inden-2karboxylátu:
o buď o (+) nebo (-) příslušný enantiomer.
Předpokládané mechanizmy podle vynálezu pro enantiospecifickou biotransformaci zahrnují enantiospecifickou hydrolýzu jednoho -enantiomerů směsi α-terciálních esterů vedoucí ke vzniku odpovídající karboxylové kyseliny a v případě směsí enantiomerů esterů keío-kyselin enantiospecifickou redukci ketoskupiny, která vede ke vzniku odpovídajících aterciálních esterů hydroxykyselin.
Vynález se tedy týká způsobu přípravy enantiospecificky obohacených α-terciálních karboxylových kyselin nebo esterů z výchozích substrátů obsahujících směs enatiomerů jim odpovídajících esterů.
Výchozími sloučeninami esterů majících α-terciáIηí následujícího obecného vzorce jsou směsi enantiomerů uhlík, které lze vyjádřit pomocí
R1
R3
OR4
I ve kterém
R1 a R2 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny zahrnující fenylovou skupinu a alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž každá skupina může být případně substituována až 3 členy skupiny obsahující halogen, alkoxyskupinu s i až 3 atomy uhlíku a fenoxyskupinu, za předpokladu, že R1 a R2 jsou vzájemně odlišné; nebo
R1 a R2 a atom uhlíku, na který jsou navázány společně tvoří skupinu
R5-
x ve které
X se zvolí ze skupiny zahrnující C=O, O, S a NH;
R3 se zvolí ze skupiny zahrnující OH a NH2;
R4znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; a
R5 se zvolí ze skupiny zahrnující atom halogenu a fluoroalkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, ořičemž chirální uhlíkový atom fy označen hvězdičkou.
Výhcdnými substráty jsou sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém
R1 znamená fenylovou skupinu připadne substituovanou fenoxyskupinou;
R2 znamená alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku; nebo
R1 a R2 atom uhlíku, na který jsou navázány společně tvoří skupinu
ve které
X znamená C(=O); R3 znamená OH;
' R4 znamená alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku; a
R5 znamená atom halogenu.
Zvláště výhodnými substráty jsou:
ethyl a-hydroxy-a-methyl-4-fenoxybenzenacetát; a methyl 5-chloro-2,3-dihydro-2-hydroxy-1 -oxo-1 H-inden-2-karboxyiát.
Substráty podie vynálezu lze snadno připravit technikami odborníkovi v daném oboru známými. Ethyl a-methyl4-fenoxybenzenacetát lže připravit například níže popsaným způsobem. Do 250 ml baňky, opatřené magnetickým mícháním, vodním chladičem, 125 ml kapačkou, teploměrem a dusíkovým vstupem se umístilo 2,7 g (Í10 mmoly) kovového hořčíku a sušilo - tepiometem za intenzivního proplachování dusíkem. Po ochlazení se do kapačky nalilo 17,5 ml (24,9 g, 100 mmolů) 4-roZtoku 4-bromodifenyietheru v 67 mi suchého THF a 10 ml tohoto roztoku se zavedlo do baňky. Za stálého míchání došlo ke spontální iniciaci Grignárdovy reakce. Zbytek ' bromidového roztoku se do baňky přidal v průběhu následujících 15 minut, během kterých se vnitřní teplota udržovala v rozmezí od 67 do 68°C. Po přidání celého objemu se teplota po dobu 5 minut držela na 68°C. Po uplynutí této doby začala teplota klesat a po 45 minutách dosáhla 30°C. Mezitím se za tepla pod dusíkem zkompletovala 250 ml baňka s magnetickým míchadlem a 125 ml kapačkou, která se sušila v peci, a takto zkompletovaná sestava se nechala vychladnout. Baňka, do které se vsunul nízkoteplotní teploměr, se naplnila 11,5 ml (12,2 g, 105 mmolů) roztoku ethylpyruvátu v 66 ml suchého THF a do kapačky se pomocí injekční stříkačky přemístil roztok Grignardova činidla. Roztok pyruvátu se prudce ochladil na teplotu -10°C. V průběhu 15 minut se do tohoto roztoku za stálého míchání a chlazení, kterým se vnitřní teplota udržovala v rozmezí od -5°C do -10°C, zaváděl Grignardův roztok. Výsledný roztok se míchal a po ošetření 50 ml vody a následně 50 ml nasyceného vodného amoniumchloridu se získaly dvě čiré fáze. Tyto fáze se oddělily a horní fáze se podrobila rotačnímu odpařování s cílem odstranit většinu THF. Přidáním 50 ml dílu vody a methylenchloridu se získaly dvě čiré fáze. Tyto fáze se opět oddělily, přičemž vodná fáze se promyla dalšími 25 ml methylenchloridu a sloučené organické fáze se promyly vodou a solným roztokem a vysušily nad síranem hořečnatým. Po odpaření rozpouštědla se získalo 23,8 g žlutooranžového oleje. K odstranění těkavých příměsí se použila Kugelrohrova destilace prováděná při 140°C/0,1 0,2 mM po dobu 60 minut. Výsledný produkt představovalo 17,1 g (60%) čirého oranžového oleje.
Podobně lze následujícím způsobem připravit methyl 5chloro-2,3-dihydro-2-hydroxy-1 -oxo-1 H-inden-2-karboxylát.
Hydrid sodný (24 g 60% roztoku v oleji, 0,6 molu) se promyl hexany s cílem odstranit přítomný olej. Výsledný promytý hydrid sodný se suspendoval v 200 ml DMF a následně ošetřil roztokem 50 g (0,3 molu) 5-chloro-1-indanonu a 150 ml DMF, přičemž tento roztok se přidával rychlostí, při které zůstala reakční teplota pod 35°C. Výsledná směs se míchala 30 minut a následně ošetřila 38 ml (0,45 molu) dimethylkarbonátu, který se přidával v průběhu 15 minut. Výsledná směs se míchala při pokojové teplotě další 1,5 hodiny a následně nechala přes noc stát. Takto odstátá směs se
100 mi koncentrované
I. A S · t** I · W w* A πυι a pí iuiuiic opairne riama oo 1000 ml ledu. Následně se do této směsi přidalo 500 ml etheru a vodná vrstva se dvakrát extrahovala etherem.
Sloučené organické vrstvy se promyly třemi díly H2O, vysušily (nad MgSO4) a zahustily, čímž se získalo 64,6 g hnědého oleje. Roztok 5,0 g (0.022 molu) výše zmíněného produktu a 70 ml methylenchloridu se při pokojové teplotě ošetřil 10 g (ca. .0,032 molu) 50-60% kyseliny mchloroperbenzoové (Aldrich). Po uplynutí 1 hodiny se reakční směs ochladila na 0°C a zchlazovala opatrným přidáním nasyceného vodného uhličitanu sodného. Tato vrstva se promyla dvakrát nasyceným vodným uhličitanem sodným, jednou nasyceným hydrogensiřičiíanem sodným, vysušila (MgSO4) a po zahuštění poskytla 4,0 g žluté pevné látky.
U jednoho provedení podle vynálezu vede biokatalytické působení enzymů a biologických materiálů podle vynálezu k přeměně nežádoucího enantiomeru na produkty, které lze snadno oddělit od neovlivněného enantiomeru. V rámci vynálezu se účinnost současných způsobů přípravy měřila stanovením 1) stupně izolace a 2) enantiomerické čistoty požadovaných produkt(ů). Stupenem izolace se rozumí procentické množství výchozího substrátu, které zůstane zachováno po biologickém ošetření. Enantiomerická čistota požadovaného produktu se určí vypočtením přebytku požadovaného enantiomeru proti nežádoucímu enantiomeru, který zůstane po provedení biokatalytického ošetření v opět izolovaném substrátu. Tento enantiomerický přebytek (dále jen % e.e.) se vypočte z koncentrace jednotlivých enantiomerů pomocí jedné z následujících rovnic:
%e.e. (+) formy = ([(+)] - [(-)])/([(+)] + [(-)]) x 100 %e.e. (-) formy = ([(-)] - [(+)])/([(-)] + [(+)]) x 100 ve kterých [(+)] a [(-)] jsou koncentrace (+) resp. (-) forem.
Ačkoliv to není podstatným znakem způsobu podle vynálezu, pokud je to žádoucí, může se enantiomericky obohacený esterový produkt (definovaný jako > 50% e.e.) oddělit od biokatalytické reakční směsi pomocí některého z celé řady v daném oboru známých prostředků.
Pro účely vynálezu jsou směsemi enantiomerů, které slouží jako substráty pro způsoby podle vynálezu směsi enantiomerních esterů, ve kterých je % e.e. menší než 50. To nezbytně zahrnuje racemické směsi, ve kterých jsou oba enantiomery zastoupeny stejným dílem, a stejně tak opticky aktivní směsi, ve kterých je jeden enantiomer přítomen v přebytku nad s ním kompiimentárním enantiomerem, ale ve kterých je enantiomerní přebytek nižší než 50%. V druhém případě vede způsob podle vynálezu k přípravě enantiomericky obohaceného esteru karboxylové kyseliny, při které se získal požadovaný enantiomer v enantio;merním přebytku alespoň 50%.
Pro účely vynálezu budou nyní přesně vymezeny některé výrazy, které byly v popisu vynálezu použity.
Výraz „enantiomericky obohacený“ znamená, že požadovaný enantiomer se získá v % e.e. alespoň 50.
Výraz „biokatalyzátor“ zahrnuje enzymatickou aktivitu poskytovanou celou bakterií, kvasinkou, fungálními buňkami nebo buněčnými extrakty nebo produkty; nebo enzymatickou aktivitu ve vyčištěné nebo částečně vyčištěné formě získané z bakterií, kvasinek, fungálních nebo savčích buněk, které enzymaticky katalyzují reakční proces podle vynálezu.
Ty biokatalyzátory, pomocí kterých se dosahuje enantiomerního přebytku vyššího než 50% (tj.více než 3násobný přebytek požadovaného enantiomeřu oproti zbytků * druhých enantiomerních . druhů) jsou ,výhodné. Výhodnější je obohacení vyšší než 90%, ještě výhodnější je obohacení vyšší než přibližně 95% a nejvýhodnější je obohacení vyšší přibližně než 99%.
přihlašovatelé podstatě
V průběhu experimentů přihlašovatelé otestovaly více než čtyřista potencionálních zdrojů biokatalyzátorů. Zde uvedené biokatalyzátory překvapivě vykazují účinnost, o kterou usilovali a kterou hledali. Proto je vynález v charakterizován těmito biokatalyzátory (mikroorganizmy nebo jejich mutanty, nebo enzymy) schopnými provádět enantiospecifickou reakci (reakce). Mezi výhodné biokatalyzátory lze zařadit ty, které jsou odvozeny z následujících mikroorganizmů: Corynebacetium hoagii
ATCC 7005, Flavobacterium sp. ATCC 27551; Pseudomonas oleovorans NRRL-B-3429, Pseudomonas putida ATCC 23973, Pseudomonas sp. NRRL-B-11330, Rhodococcus equi ATCC 14887, Rhodococcus erythropolis ATCC 4277,
Rhodococcus coprophilus NRRL-B-16536, Rhodococcus rhodn//NRRL-B-16535, Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602, Rhodococcus sp. NRRL-B-16535, Rhodococcus sp. NRRL-B16534, Streptomyces griseus ATCC 6855, Xanthomonas campestris ATCC 21818, Candida guilliermondii ATCC 6260, Candida kefyr ATCC 4135, Candida tropicalis ATCC 46491, Rhodotorula rubra ATCC 4557, Yarowia lipolytica ATCC 9773, Aspergillus alliacrus ATCC 10060,
Beauveria bassiana ATCC 26037,Beauveria bassiana ATCC
74292, Beauveria bassiana ATCC 26851, Beauveria bassiana ATCC 38657, Beauveria nivea ATCC 74294, Cunninghamella echinulata ATCC 8688, Lophotrichus martinii ATCC 11221, Paecilomyces marguandi ATCC 10525, Pestalotia microspora ATCC 11816, Rhizopus oryzae ATCC 10404, Rhizopus oryzae ATCC 22580,
Sporobolomyces sp. ATCC 20290, Trichophyton concentricum ATCC 74293, Bacillus cereus NRRL-B-1 4591, Nocardia sp. NRRL-B-5646, Pseudomonas putida ATCC 17453, Sacharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034, Schizosaccharomyces ostosporus NRRL-Y-854, Aspergillus alliaceus NRRL-315, Penicillium chrysogenum ATCC 10002,
Penicilliumnotatum ATCC 36740, Amycolatopsis rugosa NRRL-B2295, Rhodococcus equi ATCC 13556, Streptomyces endus NRRL-B-2339, Aspergillus candidus ATCC 20022 a Mycophyta m/crospora ATCC 89821. Biologický materiál obsahující enantiospecifické enzymy schopné provádět proces podle vynálezu lze izolovat nebo biologicky syntetizovat a použít jako takový, nicméně zpravidla je běžnější použít vhodný mikroorganizmus (mikroorganizmy) přímo.
Rovněž výhodnými jsou čisté přípravky hydrolytických enzymů z následujících zdrojů; α-chymotrypsin (od Bovine Pancreas; Sigma Chemical Co.); β-chymotrypsin (od Bovine Chemical Co.); γ-chymotrypsin (od Bovine Chemical Co.); δ-chymotrypsin (od Bovine
Pancreas; Sigma Chemical Co.); IM60 Lipozyme (Novo Nordisk); Chirazyme L-2 lipase (Boehringer Mannheim); Chirazyme L-5 lipase (Boehringer Mannheim); Chirazyme L-7 lipase (Boehringer Mannheim); SP 524 lipase (Novo Nordisk); SP 526 lipase (Novo
Pancreas; Sigma Pancreas; Sigma
Nordisk); SP 539 protease (Novo Nordisk); Lipolase lipase (Novo Nordisk); a CR Lipase (Altus Biologics, lne.).
Nejvýhodnějšimi jsou biokatalyzátory nalezené v následujících . - mikroorganizmech: Rhodococcus rhodochrous ATCC 55502; Trichophyton concentricum ATCC 74293; Seaveria bassiane ATCC 74292; a Beauveria nivea
ATCC 74294.
U tohoto způsobu obohacování směsí enantiomerů esterů a-terciálních karboxylových kyselin o (+)- nebo (-)enantiomer, se pro biokataiýzu používají účinky jednoho nebo několika enantiospecifických enzymů, které lze běžně získat pěstováním . mikroorganizmu v prostředí vhodném pro přípravu enantiospecifického enzymu. Takto získaný enzym se přidá za účelem selektovního působení do směsi (+)- nebo (-)-esteru α-karboxylové kyseliny, což má za následek obohacení této směsí o přetrvávající (+)- resp. (-)-ester karboxylové kyseliny. Požadovaný produkt (obohacený ester karboxylové kyseliny) lze následně oddělit bd nežádoucích produktů ((+)- nebo (-)-karboxylové kyseliny nebo (+)- nebo (-)esteru hydroxykyseliny) způsoby známými odborníkům v daném oboru pro oddělování esterů karboxylových kyselin od kyselin, esterů keto kyselin od esterů hydroxykyselin a pro oddělování jednotlivých enantiomerů. Je zřejmé, že způsob podle vynálezu by mohl být stejně tak dobře popsán jako způsob enantiomerního obohacení (+)- nebo (-)-a-karboxylových kyselin nebo (+)- nebo (-)-esteru hydroxykyselin prováděný pomoci selektivní biokatalýzy odpovídající směsi enantiomerů esteru α-terciální karboxylové kyseliny.
vynálezu zahrnují biologické bakterií, kvasinek, a buněk hub a se v bakteriích, kvasinkách a biokatalyzátorů bylo dohody v ATCC
Biokatalyzátory podle materiály odvozené od savců, nebo nalézajících buňkách hub a savců. Několik z těchto uloženo podle ustanovení budapešťské (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852) a přijalo následující vstupní čísla:
Biokatalyzátor
Rhodococcus rhodochrous Trichophyton concentricum Beauveria bassiana Beauveria nivea
Vstupní číslo
ATCC 55602 ATCC 74293 ATCC 74292 ATCC 74294
V následující části popisu vynálezu budou použity následující zkratky:
MCIC - methyl 5-chloro-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-inden-2-karboxylát EHPA - ethyl a-hydroxy-a-methyl-4-fenoxybenzenacetát HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie DMF - dimethylformamid
ACN - acetonitril
e.e. - enantiomerní přebytek
SM - Šabourandův maltózový bujón
SBG - Glycerol ze sojových bobů
NB - výživný bujón
PD - Bujón z bramborové dextrózy
Pro určení biokatalytické aktivity se 25 ml vhodného růstového média inkubovalo za použití standardních mikrobiologických technik malou dávkou zmražené nebo lyofilizované zásoby testovaného organizmu. Média použitá v rámci vynálezu a uvedená v popisné části se zvolila z následujících:
SM (Sabouraud Maltose Broth; BBL lne., Cockeysville, MD);
NB (Nutrient Broth; Difco Laboratories, lne., Detroit, Ml);
* PD (Potato Dextrose Broth; Difco Laboratories, lne., Detroit, Ml); .
SBG (qlycerol ze sojových bobů)(pH 7,0) qramv/litr
Glycerol 20,0
Kvasinkový extrakt. , 5.0
Sojová mouka 5,0
Chlorid sodný 5,0
Dihydrogenfosforečnan draselný 5,0.
až 30°C při Růstový stupeň I).
Růstová média použitá pro jednotlivé popsané mikroorganizmy jsou uvedena v tabulkách 1 až 6. Naočkované kultury rostly 72 hodin při teplotě konstantním protřepávání (250 ot/min;
Deset až dvacet procent této výchozí kultury se převedlo do čistého média (25 ml) a inkubace pokračovala dalších 24 hodin (Růstový stupeň II). Buňky se sklidily a resuspendovaly do vhodného pufru (pH 4,5 až 8,5)přičemž konečná koncentrace biokatalyzátoru byla přibližně 10 až 250 mg katalyzátoru (hmotnost sušiny)/ml pufru a konečná koncentrace substrátu byla přibližně
Inkubace prováděná za účelem dosažení pokračovala 4 až 72 hodin při 25 až 50eC za konstantního protřepávání (250 ot/min). Reakční směsi se následně okyselily a extrahovaly pomocí methylenchloridu. Po odpaření CH2CI2 se zbytky resuspendovaly v ACN. Procento takto izolovaného substrátu v ACN roztoku se určilo HPLC s reverzními fázemi a enantiomerní čistota se určila chirální HPLC.
až 200 mM. biotransformace
ANALYTICKÉ POSTUPY
Estery terciálních α-substituovaných karboxylových kyselin a produkty hydrolýzy se měřily pomocí HPLC s reverzními fázemi. Detekce se prováděla pomocí UV světelné absorpce. Pro MCIC se použila Zorbax RX-Cg kolona (4,6 x 250 mM) používající mobilní fázi tvořenou 40% acetonitrilu a 60% H2O + 0,1% triethylaminem (nastaveno na pH 6,5). Pro EHPA se použila Zorbax RX-C18 kolona (4,6 x 250 mM) používající mobilní fázi tvořenou 50% acetonitrilu a 50% H2O okyselené 0,1% H3PO4.Chromatografická identita a množství esterů se určilo na základě porovnání s platnými standardy.
Chirální HPLC pro oddělení enantiomerů se prováděla pomocí α-kyselinové gylkoproteinové kolony získané od společnosti Chromátech (Švédsko). Mobilní fáze pro separaci esterových enantiomerů jsou specifikovány níže.
Enantiomery Mobilní fáze
MCIC 98% 0,01 M fosforečnanový pufr (pH 4,8):2% ethanolu
EHPA 91% H2O + 0,1% triethylamin (Ph 6,0):9% acetonitrilu
Chirální HPLC pro separaci EHPA enantiomerů v příkladu 10 se prováděla pomocí Bakerbond chirální kolony, kterou dodal J. T. Baker. Mobilní fázi pro separaci EHPA enantiomerů bylo 90% hexanu: 10% propanolu.
Enantiomerní složení, čistota a chromatografická identita výše zmíněných esterů se určila na základě porovnání s platnými standardy enantiomerů nebo racemických směsí.
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
Buňky mikrobiálních rodů, jejichž výčet obsahuje tabulka 1, se potom, co byly sklizeny v růstovém stupni II odstředěním, resuspendovaly v 5 ml 50 mM řosforečnanového pufru, pH 6,0 (50-100 mg buněk (hmotnost v mokrém stavu)/ ml pufru). Do pufru se dále přidalo 10 umolů recemického MCIC v 50 μΙ DMF. 1 Po 24 hodinovém inkubování při teplotě 30°C se reakce ukončily (2mM biotransformace), nebo se přidalo dalších 10 μηιοίύ recemického MCIC v 50 μΙ DMF a inkubace pokračovala dalších 24 hodin (4 mM biotransformace). Jak 2 mM tak 4 mM MCIC biotransformace se ukončily okyselením na pH 3 pomocí - 3M H2SO4. Do každého vzorku se přidaly dva objemy methylenchloridu a získané suspenze se 15 minut míchaly. Methylchloridové vrstvy se odstranily a odpařily do sucha pod proudem dusíku. Získané zbytky se resuspendovaly v 10 ml acetonitrilu. Procento takto izolovaného MCIC a (+)-MCIC e.e. se určily pomocí HPLC s reverzními fázemi resp. chirární HPLC, přičemž získané výsledky jsou shrnuty v tabulce Ί.
Příklad 2
Do 2 ml 50 mM fosfátového pufru (pH 6,0) se přidalo 10 mg vzorku každého chymotrypsinového enzymu (Tabulka 1) a následně 4 μιτιο^ racemického MCIC ve 20 μΙ DMF. Podobně se do 50 mM fosfátového pufru pH 6,0 přidalo 20 mg vzorku Chirazyme L-7 lipase a následně 40 μηιοίύ racemického MCIC ve 20 μΙ DMF. Po 24 hodinové inkubaci při 30°C (chymotrypsis) nebo 25°C (L-7) a následné extrakci a analytických procedurách shodných s procedurami prováděnými v příkladu
1, se určilo procentu takto izolovaného MCIC a (+)-MCIC e.e. Získané výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.
. Tabulka 1. Enantiomerické obohaceni ( + )methyl 5-chloro-2,3-dihydro-2hydroxy-1-oxo-1H-inden-2-karboxylátu
Substrát
Rod Růstové médium Inkubačni doba (hod) mM přidaný % izolo- vaný %e.e.
Corynebacetium hoagii ATCC 7005 SM 48 4 53 50
Flavobacterium sp. ATCC 27551 SM 48 4 47 52
Pseudomonas oleovorans NRRL-B-3429 SBG 24 2 19 100
Pseudomonas putida ATCC 23973 NB 24 2 49 60
Pseudomonas sp. NRRL-B-11330 SBG 48 4 14 64
Rhodococcus equi ATCC 14387 NB 48 4 29 80
Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 SBG 48 4 21 82
Rhodococcus coprophilus NRRL-B-16536 SBG 48 4 33 100
Rhodococcus rhodnii NRRL-B-16535 SBG 48 4 15 100
Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602 SBG 48 4 35 98
Rhodococcus sp. NRRL-B-16534 SBG 48 4 14 66
Streptomyces griseus ATCC 6355 SBG 48 4 33 66
Xanthomonas campestris ATCC 21813 SBG 48 4 36 100
Rhodotoruía rubra ATCC 4557 SBG 43 4 37 86
Beauveria bassiana ATCC 74292 PD 48 4 41 92
Beauveria bassiana ATCC 26351 PD 48 4 31 100
Cunninghamella echinulata ATCC 8688 PD 24 2 36 50
Paecilomyces marquandi ATCC 10525 SM 48 4 52 60
Pestaiotia microspora ATCC 11816 PD 48 4 20 50
Rhizopus oryzae ATCC 10404 PD 48 4 49 100
Rhizopus oryzae ATCC 22580 PD 48 4 48 100
Trichophyton concentricum ATCC 74293 PD 48 4 20 92
α-chymotrypsin (Sigma) NAa 24 2 46 100
β-chymotrypsin (Sigma) NA 24 2 45 100
γ-chymotrypsin (Sigma) NA 24 2 30 100
δ-chymotrypsin (Sigma) NA 24 30 60 72
Chirazyme L-7 lipase (Boehringer Mannheim) NA 24 20 34 80
NAa - neaplikovatelné
Příklad 3
Buňky mikrobiálních rodů, jejichž výčet obsahuje tabulka 2 se potom, co byly sklizeny v růstovém stupni II odstředěním, resuspendovaly v 5 ml 50 mM fosforečnanového pufru, pH 6,0 (50-100 mg buněk (hmotnost v mokrém stavu)/ ml pufru). Do pufru se dále přidalo stejným způsobem jako v příkladu 1 10 umolů racemického MCIC v 50 μΙ DMF. Následovala stejná inkubace (4 mM biotransformace), extrakce a analytické procedury jako v příkladu 1, načež se určilo procentu takto izolovaného MCIC a (-)-MCIC e.e. Získané výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 2.
Příklad 4 mg produktu Chirazyme L-2 lipase, 10 mg SP 524 lipase, SP 526 lipase, SP 539 protease nebo 20 mg Chirazyme L-5 lipase (Tabulka 2) se přidalo do 2 ml 50 mM fosfátového pufru pH 6,0. Po 24 hodinové inkubaci při 30°C nebo 25°C a následné extrakci a analytických procedurách shodných s procedurami prováděnými v příkladu 1, se určilo procentu takto izolovaného MCIC a (-)-MCIC e.e. Získané výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 2.
Tabulka 2. Enantiomerické obohaceni (-)methyl 5-chloro-2,3-dihydro-2hydroxy-1 -oxo-1 /-/-inden-2-karboxylátu
Substrát
Rod Růstové médium Inkubační doba (hod) mM přidaný % izolo- vaný %e.e.
Candida guilliermondii ATCC 6260 SM 48 4 33 100
Candida kefyr ATCC 4135 SM 48 1 ND3 50
Candida tropicaiis ATCC 46491 SM 48 4 29 76
Yarowia lipolytica ATCC 9773 SM 48 4 32 50
Aspergillus alliacrus ATCC 10060 SM 48 1 ND 100
Beauveria nivea ATCC 74294 PD 48 4 38 86
Lophotrichus martinii ATCC 11221 PD 48 4 36 100
Sporoboiomyces sp. ATCC 20290 PD 43 4 45 100
SP 524 lipasa (Novo Nordisk) NA° 24 20 16 66
SP 526 lipasa (Novo Nordisk) NA 24 10 22 85
SP 539 proteasa (Novo Nordisk) NA 24 20 40 68
Chirazyme L-2 lipasa (Boehringer Mannheim) NA 24 20 13 100
Chirazyme L-2 lipasa (Boehringer Mannheim) NA 24 20 14 : 80
NDa - Neurčitelné NAb - Neaplikovatelné
Příklad 5 μίτιοίύ racemického MCIC ve 100 μΙ DMF se přidalo do jednotlivých 24 hodinových kultur II stupně (25 ml SBG media) mikrobiálních rodů, jejichž výčet uvádí tabulka 3. Následovalo přidání MCIC, po 8 hodinové nebo 29 hodinové inkubaci při 27°C se z bujónu odebraly 4 ml alikvóty. Do každého vzorku se přidal jeden ml ethylacetátu a suspenze se 10 minut míchaly. Z každého vzorku se oddělilo se 0,2 ml ethylacetátové vrstvy, odpařilo do sucha pod proudem dusíku a zbytky se resuspendovaly ve 3 ml acetonitrilu. Procento takto izolovaného MCIC a (-)-MCIC e.e. se určily pomocí HPLC s reverzními fázemi resp. chirální HPLC a získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3. Enantiomerická obohacení (-)methyl 5-chloro-2.3-dihydro-2hydroxy-1- oxo-1/-/-inden-2-karboxylátu
Substrát
Rod Růstové médium Inkubačni doba (hod) mM přidaný % izolo- vaný %e.e.
Bacillus cereus NRRL-B-14591 SSG 29 1,7- 27 48
Nocardia sp. NRRL-B-5646 SBG 29 1.7 12 60
Pseudomonas putida ATCC 17453 SBG 29 1,7 19 46
Sacharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034 SBG 29 1,7 35 78
Schizosaccharomyces ostosporus NRRL- Y-854 SBG 8 1,7 30 98
Aspergillus alliaceus NRRL-315 SBG 29 1,7 12 64
Peniciílium chrysogenum ATCC 10002 SBG 3 1,7 33 50
Penicillium notatum ATCC 36740 SBG 29 1,7 19 46
Příklad 6
Buňky mikrobiálních rodů, jejichž výčet obsahuje tabulka 4, se potom, co byly sklizeny v růstovém stupni II odstředěním, resuspendovaly v 5 ml 50 mM fosforečnanového pufru, pH 6,0 (50-100 mg buněk (hmotnost v mokrém stavu)/ ml pufru). Do pufru se dále přidalo 10 Limolů racemického MCIC v 50 μΙ DMF. Po 24 hodinovém inkubování při teplotě 30eC se reakce ukončily (2mM biotransformace), nebo se přidalo dalších 10 μτηοΐύ recemického MCIC v 50 μΙ DMF a inkubace pokračovala dalších 24 hodin (4 mM biotransformace). Jak 2 mM tak 4 mM dalších 24 hodin (4 mM biotransformace). Jak 2 mM tak 4 mM okyselením na pH 3 se přidaly dva objemy se 15 minut míchaly.
EHPA biotransformace se ukončily pomocí 3M H2SO4. Do každého vzorku methylenchloridu a získané suspenze
Methylchloridové vrstvy se odstranily a odpařily do sucha pod proudem dusíku. Získané zbytky se resuspendovaly v 10 ml acetonitrilu. Procento takto izolovaného EHPA a (+)-EHPA e.e. se určily pomocí HPLC s reverzními fázemi resp. chirární HPLC, přičemž získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.
Příklad 7
Do 2 ml 50 mM fosfátového pufru pH 6,0 (1 ml pro Lipolásu) se přidalo 20 mg vzorku IM60 Lipozyme, SP 524 lipase nebo 1 ml Lipolase lipase. Následně se do pufru přidalo 20 jimolů racemického EHPA ve 20 μΙ DMF. Po 48 hodinové inkubaci při 30°C (IM60 Lipozyme) nebo 24 hodinové inkubaci při 25°C (SP 525, SP 526, Lipolase), se reakce ukončily okyselením pomocí 3M H2SO4 na pH 3. Potom následovala stejná extrakce a stejné analytické postupy jako v příkladu 6, načež se stanovilo procento EHPA a (+)-EHPA e.e.. Výsledky měření jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4. Enantiomerické obohaceni ( + )ethvl a-hvdroxy-a-methyl-4fenoxybenzenacetátu
í Substrát ί
_ Rod . . ... Růstové médium Inkubační doba (hod) mM ί přidaný I izolo- vaný %Q.Q.
i - Pseudomonas sp. NRRL-B-11330 SBG 24 2 52 86
il·' Rhodococcus equi ATCC 13556 SBG 24 2 40 88
4. Candida tropicaiis ATCC 46491 SM 24 2 87 42
ií Aspergillus candidus ATCC 20022 SM 24 2 48 24
Beauveria bassiana ATCC 26851 PD 24 2 43 90
Beauveria bassiana ATCC 38657 ' PD 24 2 23 100
Mycophyta microspora ATCC 89821 PD 48 . 4 44 40
Tricophyton coňcenirícum ATCC 74293 PD 48 4 39 100
IM60 Lipozyme NAa 48 10 47 84
♦· SP 524 lipase NA 24 10 10 60
SP 526 lipase NA 24 10 36 51
1 1 Lipolase lipase NA 24 10 22 50
Příklad 8
Buňky mikrobiálních rodů, jejichž výčet obsahuje tabulka 5, se potom, co byly sklizeny v růstovém stupni II odstředěním, resuspendovaly v 5 ml 50 mM fosforečnanového pufru, pH 6,0 (50-100 mg buněk (hmotnost v mokrém stavu)/ ml pufru). Stejným způsobem jako v příkladu 5 se do pufru dále přidalo 10 umolů racemického EHPA. Následovala stejní inkubace a analytické postupy jako v příkladu 5, načež se stanovilo procento EHPA a (-)-EHPA e.e.. Výsledky měření jsou uvedeny v tabulce 5.
Tabulka 5. Enantiomerické obohacení (-)ethyl q-bydroxy-a-methyl-4fenoxybenzenacetátu
Substrát
Rod Růstové médium Inkubační doba (hod) mM přidaný % izolo- vaný %e.e.
Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295 SM 24 2 38 50
Streptomyces sndus NRRL-B-2339 SBG 24 2 12 82
Příklad 9
Buňky mikrobiálních rodů, jejichž výčet obsahuje tabulka 6, se potom, co byly sklizeny v růstovém stupni li odstředěním a uloženy v zmrzlém stavu při teplotě -80°C,rozmrazily resuspendovaly v 2 ml 50 mM fosforečnanového pufru, pH 6,0 (150-300 mg buněk (hmotnost v mokrém stavu)/ ml pufru). Suspenze buněk se přidaly do reakčních ampulek obsahujících 100 μιηοΐύ 50% e.e. (+)-MCIC. Po 24 hodinové inkubaci při 30°C se reakce ukončily okyselením pomocí 3M H2SO4. Do každého vzorku methylenchloridu a získané suspenze
Odebraly se poloviny každé methylchloridové vrstvy a odpařily do sucha pod proudem dusíku. Získané zbytky se resuspendovaly v 10 ml acetonitrilu. Procento takto izolovaného MCIC a (+)MCIC e.e. se určily pomocí HPLC s reverzními fázemi resp. chirární HPLC, přičemž získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 6.
na pH 3 se přidalo pět objemů se 15 minut míchaly.
6'
Tabulka 6. Enantiomerické obohaceni 50% e.e.,( + )methyl 5-chloro-2,3dihydro-2-hydroxy-1 -oxo-1 H-inden-2-karboxylatu
Substrát ! I
Rod Růsto- - . VQ. médiu m Konc. Buněk (g/ml) Inkubační doba (hod) mM přidá ný % - izolováný %e.e.
Rhodococcus sp. NRRL-B-16531 SBG 0,30 24 50 67 82
Rhodococcus sp. NRRL-B-16534 SBG 0,30 24 50 82 82
Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602 SBG 0,30 24 50 67 86
Tricophyton concentricum ATCC 74293 PD 0,16 24 50 77 76
Beauveria bassiana ATCC 26037 PD 0,29 24 50 82 . 76
Žádné buňky - 24 50 100 50
Příklad 10 , '
Do 2 ml 50 mM fosfátového pufru pH 6,0 se přidalo 10 mg produktu CR lipase (Altus Biologics lne., Cambridge, MA) a následně 10 umolů racemického EHPA ve 20 p.molech DMF. Po 24 hodinové inkubaci při 30°C se reakce ukončily okyselením na pH 3 pomocí 3M H2SO4. Do každého vzorku se přidalo pět objemů methylenchloridu a získané suspenze se 15 minut míchaly. Odebraly se poloviny každé methylchloridové vrstvy a odpařily do sucha pod proudem dusíku. Získané zbytky se resuspendovaly v 10 ml acetonitrilu. Procento takto izolovaného MCIC a (+)-MCIC e.e. se určily pomocí HPLC s reverzními fázemi resp. chirární HPLC, přičemž získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 7.
Tabulka 6. Enantiomerické obohacení (-)ethyl a-hydroxv-a-methyl-4f enoxy benzen acetátu
Substrát
Enzym Inkubač- ní doba (hod) mM přidá ný % izolo- vaný %e.e.
CR lipase (Altus Biologics) 24 5 38 90

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy enantiomericky obohaceného esteru karboxylové kyseliny, vyznačený tím, že zahrnuje uvedení směsi enentiomerú esteru obecného vzorce I ve kterém
    R1 a R2 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny zahrnující fenylovou skupinu a alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž každá skupina může být případně substituována až 3 členy skupiny obsahující halogen, alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a fenoxyskupinu, za předpokladu, že R1 a R2 jsou vzájemně odlišné; nebo
    R1 a R2 a atom uhlíku, na který jsou navázány společně tvoří skupinu ve které
    X se zvolí ze skupiny zahrnující C=O, 0, S a NH; R3 se zvolí ze skupiny zahrnující OH a NH2;
    R4 znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; a
    R5 se zvolí ze skupiny zahrnující atom halogenu a fluoroalkoxyskupinu přičemž chirální do kontaktu s zahrnující produkty
    Chirazyme L-5 lipáse, s 1 až 3 atomy uhlíku, uhlíkový atom je označen hvězdičkou; biokatalyzátorem zvoleným ze skupiny IM60 Lipozyme; Chirazyme L-2 lipáse, Chirazyme L-7 lipáse, SP 524 lipáse,
    SP 526 lipáse,SP 539 proteáse, Lipoláse Lipáse, CR Lipáse, Corynebacetium hoagii ATCC 7005, Flavobacterium sp. ATCC 27551; Pseudomonas oieovorans NRRL-B-3429, Pseudomonas putida ATCC 23973, Pseudomonas sp. NRRL-B11330, Rhodococcus equi ATCC 14887, Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus coprophilus NRRL-B16536, Rhodococcus rhodniiNRRL-B-16535, Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602, Rhodococcus sp. NRRL-B-16535, Rhodococcus sp. NRRL-B-16534, Streptomyces griseus ATCC 6855, Xanthomonas campestris ATCC 21818, Candida guilliermondii ATCC 6260, Candida kefyr ATCC 4135, Candida tropicalis ATCC 46491, Rhodotorula rubra ATCC 4557, Yarowia lipolytica ATCC 9773, Aspergilius atliacrus ATCC 10060, Beauveria bassiana ATCC 26037 .Beauveria bassiana ATCC 74292, Beauveria bassiana ATCC 26851, Beauveria bassiana ATCC 38657, Beauveria nivea ATCC 74294, Cunninghamella echinulata ATCC 8688, Lophotrichus martinii ATCC 11221, Paecilomyces marguandi ATCC 10525, Pestalotia microspora ATCC 11816, Rhizopus oryzae ATCC 10404, Rhizopus oryzae ATCC 22580,
    Sporobolomyces sp. ATCC 20290, Trichophyton concentricum ATCC 74293, Bacillus cereus NRRL-B-14591, Nocardia sp. NRRL-B-5646, Pseudomonas putida ATCC 17453,
    Sacharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034, Schizosaccharomyces ostosporus NRRL-Y-854, Aspergillus aliiaceus NRRL-315, Penicillium chrysogenum ATCC 10002,
    Penicilliumnotatum ATCC 36740, Amycolatopsis rugosa NRRL-B2295, Rhodococcus equi ATCC 13556, Streptomyces endus NRRL-B-2339, Aspergillus candidus ATCC 20022 a Mycophyta microspora ATCC 89821.
    <»
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím , že v obecném vzorci I,
    R1 znamená fenylovou skupinu případně substituovanou fenoxyskupinou;
    R2 znamená alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku; nebo
    R1 a R2 atom uhlíku, na který jsou navázány společně tvoří skupinu r5- ve které
    X znamená C(=O);
    R3 znamená OH;
    R4 znamená alkylovou skupinu s uhlíku; a
    R5 znamená atom halogenu.
    1 až 3 atomy
  3. 3. Způsob podle nároku směsí enantiomernfch esterů
    2, vyznačený obecného vzorce tím , že I je' methyl 5I chloro-2,3-dihydro-2-hydroxy-1 -oxo-1 H-índen-2-karboxy lát, enantiomericky obohaceným esterem karboxylové kyseliny je (+)-enantiomer a biokatalyzátor se zvolí ze skupiny zahrnující hoagii ATCC 7005, Ftavobacterium Pseudomonas oleovorans NRRL-B-3429,
    Corynebacetium sp. ATCC 27551;
    Pseudomonas putida ATCC 23973, Pseudomonas sp. NRRL-B11330, Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 16536, Rhodococcus equi ATCC 14887, Rhodococcus Rhodococcus coprophiius NRRL-Brhodnii NRRL-B-16535, Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602, Rhodococcus sp. NRRL-B-16535, Rhodococcus sp. NRRL-B-16534, Streptomyces griseus ATCC 6855, Xanthomonas campestris ATCC 21818, Rhodotorula rubra ATCC 4557, Beauveria bassiana ATCC 26037,
    Beauveria bassiana ATCC 74292, Beauveria bassiana
    ATCC 26851, Beauveria nivea ATCC 74294, Cunninghamella echinulata ATCC 8688, Pestaíotia microspora ATCC 11816, Rhizopus oryzae ATCC 10404, Rhizopus oryzae ATCC 22580, Trichophyton concentricum ATCC 74293, a produkt Chirazyme L-7 lipase.
  4. 4. Způsob podle nároku 2, v y z n a č e ný tím , že směsí enantiomerních esterů obecného vzorce I je methyl 5chloro-2,3-dihydro-2-hydroxy-1 -oxo-1 H-inden-2-karboxylát, enantiomericky obohaceným esterem karboxylové kyseliny je (-)-enantiomer a biokatalyzátor se zvolí ze skupiny zahrnující Candida guilliermondii ATCC 6260, Candida kefyr ATCC 4135, Candida tropicalis ATCC 46491, Yarowia lipolytica ATCC 9773, Aspergillus alliacrus ATCC 10060, Beauveria nivea ATCC 74294, Lophotrichus martinii ATCC 11221,
    Sporoboiomyces sp. ATCC 20290, Bacillus cereus NRRL-B32
    14591, Nocardia sp. NRRL-B-5646, Pseudomonas pt/b'da ATCC 17453, Sacharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034, Schizosaccharomyces ostosporus NRRL-Y-854, Aspergillus alliaceus NRRL-315, Penicillium chrysogenum ATCC 10002, Penicillium notatum ATCC 36740, a produkty SP 524 lipase, SP 526 lipase, SP 539 protease, Chirazyme L-2 lipase a chirazyme L-5 lipase.
  5. 5. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím , že směsí enantiomerních esterů obecného vzorce I je ethyl echy droxy-ct-m ethyl-4-fe noxy benzen acetát, enantiomericky obohaceným esterem karboxylové kyseliny je (+)-enantiomer a biokatalyzátor se zvolí ze skupiny zahrnující Pseudomonas sp. NRRL-B-11330, Rhodococcus equi ATCC 13556, Candida tropicalis ATCC 46491, Aspergillus candidus ATCC 20022, Beauveria bassiana ATCC 26851, Beauveria bassiana ATCC 38657, Mycophyta microspora ATCC 89821, Tricophyton concentricum ATCC 74293, a produkty IM60 Lipozyme, SP 524 lipase, SP 526 lipase, Lipolase lipase a CR Lipase.
  6. 6. Způsob podle nároku .2, vyznačený tím , že směsí enantiomerních esterů obecného vzorce I je ethyl ahydroxy-a-methyl-4-fenoxybenzenacetát enantiomericky obohaceným esterem karboxylové kyseliny je (-)-enantiomer a biokatalyzátor se zvolí ze skupiny zahrnující Amycoiatopsis rugosa NRRL-B-2295 a Streptomyces endus NRRL-B-2339.
    Jft· ..
    '· ' iťt.
  7. 7. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím , že dále zahrnuje oddělení enantiomericky obohaceného esteru karboxylové kyseliny od biokatalytické reakční směsi.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím , že uvedené oddělení se provede extrakcí nebo separací fází.
  9. 9. Způsob přípravy enantiomericky obohaceného esteru karboxylové kyseliny, vyznačený tím , že zahrnuje uvedení směsi enantimerních esterů methyl 5-chloro-2,3dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1 H-inden-2-karboxylátu do kontaktu s biokatalyzátorem, přičemž enantiomericky obohaceným esterem karboxylové kyseliny je (+)-enantiomer a biokatalyzátor se zvolí ze skupiny zahrnující a-chymotrypsin, β-chymotrypsin, γchymotrypsin, a δ-chymotrypsin.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, v yznačený tím , že dále zahrnuje oddělení enantiomericky obohaceného esteru karboxylové kyseliny od biokatalytické reakční směsi.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím , že uvedené oddělení se provede extrakcí nebo separací fází.
    Zastupuje:
CZ971111A 1994-10-12 1995-10-04 Process of enzymatic preparation of chiral esters of alpha tertiary carboxylic acids CZ111197A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32149694A 1994-10-12 1994-10-12
US08/457,891 US5580783A (en) 1994-10-12 1995-06-01 Enzymatic process for the preparation of chiral α-tertiary carboxylic acid esters
PCT/US1995/013225 WO1996012035A1 (en) 1994-10-12 1995-10-04 Enzymatic process for the preparation of chiral-alpha-tertiary carboxylic acid esters

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ111197A3 true CZ111197A3 (en) 1997-07-16

Family

ID=26982998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ971111A CZ111197A3 (en) 1994-10-12 1995-10-04 Process of enzymatic preparation of chiral esters of alpha tertiary carboxylic acids

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0786012B1 (cs)
JP (1) JP3794702B2 (cs)
CN (1) CN1160421A (cs)
AU (1) AU3832995A (cs)
CZ (1) CZ111197A3 (cs)
DE (1) DE69506900T2 (cs)
DK (1) DK0786012T3 (cs)
ES (1) ES2128093T3 (cs)
IL (1) IL115594A (cs)
WO (1) WO1996012035A1 (cs)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2732679B1 (fr) * 1995-04-07 1997-04-30 Synthelabo Procede de preparation enzymatique d'un intermediaire de synthese de la befloxatone
CN1328387C (zh) * 2000-07-13 2007-07-25 三共株式会社 氨基醇衍生物
AR046583A1 (es) * 2003-11-14 2005-12-14 Ucl Biomedica Plc Uso de una composicion inmunomoduladora
CN1948499B (zh) * 2006-05-26 2010-12-08 江南大学 生物催化制备(r)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法
CN102719496B (zh) * 2012-06-21 2014-08-06 浙江工业大学 一种微生物转化苯甲酰甲酸乙酯制备(s)-(+)-扁桃酸乙酯的方法
CN103290072B (zh) * 2013-02-28 2014-10-22 南京工业大学 一种酶法不对称还原制备(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法
CN104313064A (zh) * 2014-10-01 2015-01-28 青岛科技大学 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法
CN105838772A (zh) * 2016-05-27 2016-08-10 苏州汉酶生物技术有限公司 (s)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1h-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法
CN105969815B (zh) * 2016-06-07 2021-02-26 苏州汉酶生物技术有限公司 一种(s)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1h-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法
CN110527646B (zh) * 2019-08-20 2021-05-11 浙江工业大学 热带芽孢杆菌wzz018及其应用
CN112345663B (zh) * 2020-10-22 2022-10-21 京博农化科技有限公司 一种5-氯-2-甲氧羰基-1-茚酮酯含量的分析方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4668628A (en) * 1985-04-01 1987-05-26 Stauffer Chemical Company Resolution of racemic mixtures of aliphatic acid esters
EP0197474B1 (en) * 1985-04-01 1991-07-10 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for preparing optically active indoline-2-carboxylic acid
IL91453A0 (en) * 1988-09-02 1990-04-29 Tanabe Seiyaku Co Preparation of optically active 3-phenyl-glycidic acid esters
CA2068038A1 (en) * 1991-05-08 1992-11-09 Christopher Yee Enzymatic resolution of .alpha.-tertiary carboxylic acid esters
US5202260A (en) * 1991-05-08 1993-04-13 Genzyme Corporation Resolution of α-tertiary carboxylic acid esters using lipase from Candida lipolytica

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10507360A (ja) 1998-07-21
AU3832995A (en) 1996-05-06
DE69506900D1 (de) 1999-02-04
DK0786012T3 (da) 1999-08-23
DE69506900T2 (de) 1999-07-22
JP3794702B2 (ja) 2006-07-12
EP0786012A1 (en) 1997-07-30
CN1160421A (zh) 1997-09-24
IL115594A (en) 2000-01-31
EP0786012B1 (en) 1998-12-23
IL115594A0 (en) 1996-01-19
WO1996012035A1 (en) 1996-04-25
ES2128093T3 (es) 1999-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5391495A (en) Stereoselective reduction of ketones
US11441133B2 (en) Acinetobacter and use thereof in production of chiral 3-cyclohexene-1-carboxylic acid
CZ111197A3 (en) Process of enzymatic preparation of chiral esters of alpha tertiary carboxylic acids
US7465842B2 (en) Enantioselective biotransformation for preparation of protein tyrosine kinase inhibitor intermediates
EP0149674B1 (en) Process for biochemical optical resulution of cyclopentenolone derivative
Buisson et al. A study of the stereocontrolled reduction of aliphatic β-ketoesters by Geotrichum candidum
Zheng et al. Enantioselective synthesis of (S)-3-cyano-5-methylhexanoic acid by a high DMSO concentration tolerable Arthrobacter sp. ZJB-09277
US5580783A (en) Enzymatic process for the preparation of chiral α-tertiary carboxylic acid esters
Singh et al. Enantioselective transesterification of (RS)-1-chloro-3-(3, 4-difluorophenoxy)-2-propanol using Pseudomonas aeruginosa lipases
Mangone et al. Chemo-and stereoselective reduction of β-keto esters by spores and various morphological forms of Mucor rouxii
US5493063A (en) Process for optical resolution of 1,2-diol derivatives
Xue et al. Concurrent obtaining of aromatic (R)-2-hydroxyacids and aromatic 2-ketoacids by asymmetric oxidation with a newly isolated Pseudomonas aeruginosa ZJB1125
Goswami et al. Microbial reduction of α-chloroketone to α-chlorohydrin
EP0687305B1 (en) Esterase and its use in biotransformation
CN100554403C (zh) 氧化微杆菌以及利用该氧化微杆菌制备光学纯手性芳基仲醇的方法
US5834261A (en) Method for the production of chiral vicinal aminoalcohols
JP2005117905A (ja) 光学活性１−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法
US5986095A (en) Enantioselective preparation of halophenyl alcohols and acylates
US6242243B1 (en) Trichosporon sp RRLY-15 (DSM 11829) and its use to prepare S(+)-6-methoxy-methyl-2-naphthalene acetic acid
JP2006050990A (ja) 光学活性２−置換−３−（４−置換オキシフェニル）プロピオン酸およびその対掌体エステルの製造方法
JP3932926B2 (ja) 光学活性ヒドロキシケトエステルの製造法
US5861304A (en) Process for the enzymatic separation of enantiomers of rac-2-oxotricyclo 2.2.1.0 3,5! heptane-7-carboxylic acid and of rac-2-oxotricyclo 2.2.1.0 3,5! heptane-7-carboxylic esters
JP4000263B2 (ja) （３ｒ，５ｓ）−（ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類の製造方法
EP3063281B1 (en) Process for the chiral resolution of acetates to (r)-alcohols employing fusarium proliferatum
EP0751224A1 (en) Process for producing (r)-2-amino-1-phenylethanol or halogenated derivative thereof, process for producing optically active phenylserine or halogenated derivative thereof, and novel compound 3-(3-chlorophenyl)serine