CZ111595A3

CZ111595A3 - Dithiokarbamáty pro ošetřování aterosklerózy a jiných kardiovaskulátních a zánětlivých chorob

Info

Publication number: CZ111595A3
Application number: CZ951115A
Authority: CZ
Inventors: Russel M. Medford; Margaret K. Offermann; Wayne R. Alexander
Original assignee: Emory University
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-11-01
Publication date: 1998-07-15
Also published as: BG99604A; NO951616D0; JP3254486B2; CA2147881A1; GR3031368T3; CA2147881C; ATE183089T1; SK56095A3; NO951616L; BG62682B1; DK0666741T3; US5380747A; BR9307337A; HUT73440A; ES2136186T3; AU5665394A; HU9501229D0; DE69326014D1; JPH08506798A; WO1994009772A1

Description

Dithiokarbamáty pro ošetřování aterosklerózy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob

Oblast techniky

Tento vynález je z oblasti způsobů a prostředků pro ošetřování aterosklerózy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob.

Dosavadní stav techniky

Adheze leukocytů k endotelu (buněčné výstelce) představuje podstatný a časný příznak u široce rozmanitých zánětlivých stavů včetně aterosklerózy, chorob autoimunity a bakteriálních a virových infekcí. Tento proces je zčásti zprostředkován vyvolanou expresí povrchových adhezních molekul buněčné výstelky, jako je ICAM-1 (intracelulární adhezní molekula-1), VCAM-1 (vaskulární adhezní molekula-1) a ELAM-1 (endothelní leukocytová adhezní molekula-1). Tyto adhezní molekuly se váží k buňkám způsobujícím imunitu, které vyvolávají a šíří protizánětlivou odezvu. Jedna z adhezních molekul, VCAM-1, hraje zvláště důležitou roli při vázání raonocytů. Násobné signály vyvolávají expresi povrchových adhezních molekul buňky.

v,

Ateroskleróza je chronická zánětlivá choroba arteriální intimy, kterou charakterizují ohniska akumulace leukocytů, buněk hladkého svalstva, lipidů a extracelulární základní hmoty. Středovým znakem a jedním z nejdříve stanovitelných příznaků v patogenezi aterosklerotických plátů je adheze jednojaderných leukocytů k odděleným segmentům z arterální buněčné výstelky přes proteiny VCAM-1 na povrchu vaskulární buněčné výstelky. Po připojení k buněčné výstelce se jednojaderné leukocyty přemění na makrofágy zatížené” lipidy nebo pěnové buňky. Ateroskleróza začíná jako vysoce ohniskové poškození ve vaskulární stěně, obvykle v oblasti, kde se normální, laminární tok krve rozděluje, jako se rozděluje při průtoku do cév. Tyto oblasti nízkého střihového napětí jsou charakterizovány abnormální místní akumulací oxidativně modifikovaného lipoproteinu o nízké hustotě (ox-LDL).

Byl vysloven předpoklad, že časné příznaky v patogenezi aterosklerózy jsou zprostředkovány liproteiny o nízké hustotě, které se konvergují látkami reaktivními s kyslíkem na oxidativně modifikované lipoproteiny o nízké hustotě (Steinberg a kol., Beyond cholesterol: Modifications of low density lipoprotein that increase its atherogenicity, N. Engl. J. Med. 320, 915-924 /1989/, Parthasarathy a kol., Probucol inhibits oxidative modification of low density lipoprotein, J. Clin. Invest. 77(2), 641-664 /1986/). Není jasné, proč mechanizmus LDL je oxidován bud' intracelulárně nebo extracelulárně.

Současná terapie kardiovaskulárních chorob a zvláště aterosklerózy neošetřuje příčinu choroby, ale místo toho ošetřuje příznaky choroby nebo méně rizikové faktory spojené s chorobou. Farmaceutické prostředky předepisované pro tyto stavy zahrnují přípravky snižující lipidy, jako je probucol a kyselina nikotinová, aspirin (který zabraňuje slepování krevních destiček), antitrombotické přípravky, jako je kumadin, blokátory vápníkových kanálků, jako je varapamil, dilthiazem a nifedipin,angiotensin konvertující enzymové (ACE) inhibitory, jako je captopril a enalopril, a β-blokátory, jako je propanalol, terbutalol a labetalol. Protože terapeutické přípravky nejsou selektivní, mohou nepříznivě ovlivňovat řadu rozdílných orgánů a mají významné vedlejší účinky. V současnosti tyto přípravy nejsou léčivými látkami, které jsou zaměřeny na inhibici vázání monocytů k povrchovým adhezním molekulám buněk, jako je VCAM-1.

Uvádí se, že kardiovaskulární choroby jsou v současné době hlavní příčinou úmrtí ve Spojených státech amerických a 90 % kardiovaskulárních chorob je nyní diagnostikováno jako aterosklerózao Proto vzniká silná potřeba rozpoznat nové způsoby a získat nové farmaceutické prostředky k jejich ošetřování.

Dithikarbamáty jsou transitní chelátory kovů, které se klinicky používají při otravách těžkými kovy (R. C. Baselt a kol., Comparisons of antidotal efficacy of sodium diethyldithiocarbamate, D-penicillamine and triethylenetetramine upon acute toxicity of nickel carbonyl in rats, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 18(4) , 677-688 /1977/, T. Menne a K. Kaaber, Treatment of pompholyx due to nickel allergy with chelating agents, Contact Dermatitis 4(5), 289-290 /1978/, F. W. Sunderman, Clinical response to therapeutic agents in poisoning from mercury vapor, Ann. Clin. Lab. Sci. 8(4), 259-269 /1978/, F. W. Sunderman, Efficacy of sodium diethyldithiocarbamate (dithiocarb) in acute nickel carbonyl poisoning, Ann. Clin. Lab. Sci. 9(1). 1-10 /1979/, G. R. Gale a kol., Diethyldithiocarbamate in treatment of acute cadmium poisoning, Ann. Clin. Lab. Sci. 11(6) . 476-483 /1981/, Μ. M. Jones a M. G. Cherian, The search for chelate antagonists for chronic cadmium intoxication, Toxicology 62(1). 1-25 /1990/, S. G. Jones a kol., A comparison of diethyldithiocarbamate and EDTA as antidotes for acute cadmium intoxication, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 38(2). 271-278 /1982/, A. Pages a kol., Dithiocarbamates in heavy methal poisoning: complexes of N,N-di-(1-hydroxyethyl)dithiocarbamate with Zn(II), Cd(II), Hg(II), CH₃Hg(II), and C₆H₅Hg(II), J. Inorg. Biochem.

25(1). 35-42 /1985/, S. K. Tandon a kol., The lead-chelating effects of substituted dithiocarbamates, Biomed. Environ. Sci. 3(3). 299-305 /1990/).

Dithiokarbamáty se také podpůrně používají při chemoterapii cis-platinou, aby se zabránilo renální toxicitě (Μ» Ρ» Hacker a kol., Effect of disulfiram (tetraethylthiuram disulfide) and diethyldithiocarbamate on the bladder toxicity and antitumor activity of cyclophosphamide in mice, Cancer Res. 42(11). 4490-4499 /1982/, Bodenner, Selected protection against cis-diamminedichloroplatinum (II)

- induced toxicity in kidney, gut, and bone marrow by diethyldithiocarbamate, Canc. Res. 46, 2751-2755 /1986/). Cheláty přechodných kovů by měly mít účinek blokující tvorbu hydroxyskupin intracelulární cestou pomocí Haber-WeissFentonovy reakce (M. Saran a kol., Radical reactions in vivo-an overview, Radiat. Environ. Biophys. 29(4) , 249-262 /1990/).

Dikarbamát, který se v současnosti používá při ošetřování závislosti na alkoholu, je disulfiram, co je dimer diethyldithiokarbamátu. Disulfiram inhibuje jaterní aldehyd-dehydrogenázu (K. Inoue a kol., Effect of disulfiram and its reduced metabolite, diethyldithiocarbamate on aldehyde dehydrogenase of human erythrocytes, Life Sci.

30(5). 419-424 /1982/).

Je popsáno, že dithiokarbamáty inhibují replikaci HIV viru a také zvyšují dozrávání specifických subpopulací T buněk. To vedlo ke klinickým zkouškám diethyldithiokarbamátu u pacientů trpících .AIDS (E. Reisinger a kol., Inhibition of HIV progression by dithiocarb, Lancet 335, 679 /1990/.

Podstata vynálezu

Předmět tohoto vynálezu se proto týká způsobu ošetřování aterosklerózy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob.

!

Jiný předmět tohoto vynálezu se týká farmaceutických prostředků pro ošetřování aterosklerozy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob.

Ještě jiný předmět tohoto vynálezu se týká způsobů a prostředků k blokování schopnosti buněk podílet se na expresi genových produktů, o kterých je známo, že jsou odpovědné za ulpívání leukocytů na těchto buňkách, a k aktivaci buněk.

Dále se popisuje shrnutí tohoto vynálezu.

Bylo nalezeno, že dithiokarboxyláty a zvláště dithiokarbamáty blokují vyvolanou expresi povrchové adhezní molekuly buněčné výstelky VCAM-1, a tak jsou vhodné pro ošetřování aterosklerozy, postangioplastické restenózy, koronárních arteriálních chorob, angíny a jiných kardiovaskulárních chorob, stejně jako nekardiovaskulárních zánětlivých chorob, které jsou zprostředkovány VCAM-1.

Je důležité, že určité dithiokarbamáty, jako natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát (dále též PDTC), neblokují významně vyvolanou expresi jiných povrchových adhezních molekul buněčné výstelky, jako je ICAM-1 nebo ELAM-1, a proto nemají nepříznivý účinek na zánětlivé odezvy, které nezprostředkuje VCAM-1. Bylo také nalezeno, že natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát neprojevuje preferenční toxicitu k proliferujícím nebo abnormálně dělícím se buňkám hladkého svalstva. Jiný dithiokarbamát, natrium N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát také inhibuje expresi VCAM-1, aniž by měl významný účinek na ICAM-1, ale neinhibuje preferenční toxicitu pro abnormálně dělící se vaskulární buňky hladkého svalstva. Schopnost jiných aktivních dithiokarbamátů selektivně inhibovat expresi VCAM-1 (aniž by došlo k inhibici exprese ELAM-11 nebo ICAM-1) a projevovat preferenční toxicitu k abnormálně dělícím se buňkám hladkého svalstva, se hodnotí podle zde dále uvedených způsobů.

Dithiokarbamáty, které jsou vhodné přo ošetřování aterosklerózy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob, zahrnují, aniž by na ně byly omezeny, sloučeniny obecných vzorců

R¹SC(S)NR²R³ nebo R²R³N(S)CS-SC(S)NR²R³, ve kterých

R¹ znamená atom vodíku, farmaceutický přijatelný kation včetně sodného a draselného, aniž by na ně byl omezen a skupinu vzorce NR⁴R⁵R⁶R⁷, kde R⁴, r5, r⁶ a R⁷ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, přímou, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu S 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, na které jedna nebo větší počet hydroxyskupin je umístěn na libovolném atomu uhlíku, nebo arylovou skupinu a

R² a R³ znamenají nezávisle na sobě přímou, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku, skupinu vzorce -(CHOH)_n(CH₂)_n0H, kde n značí číslo 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6,

-(CH₂)_nCO₂R¹, -(CH₂)_nCO₂R⁴ nebo hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo

R² a R³ tvoří dohromady můstek, jako -(CH₂)_m-, kde m znamená číslo 3 až 6 a

R⁴ znamená alkylovou, arylovou, alkarylovou nebo aralkylovou skupinu včetně acetylové, propionylové a butyrylové skupiny.

Aktivní dithiokarboxyláty a zvláště dithiokarbamáty, zahrnuté do tohoto vynálezu, se mohou používat pro ošetřování akutních a chronických zánětlivých chorob zprostředkovaných VCAM-1, včetně revmatizmu, osteoartritidy, astmatu a dermatitidy, na které však výčet není omezen a mohou být prospěšné při ošetřování rozptýlené sklerózy.

Sloučeniny jsou vhodné jak pro prvotní, tak podpůrné lékařské ošetřování kardiovaskulárních chorob. Sloučeniny se mohou používat při podpůrné terapii v kombinaci s přípravky, které se podávají ke snížení rizika onemocnění snížením LDL a sérového cholesterolu. Způsob představuje významnou výhodu při ošetřování kardiovaskulárních chorob, při kterém se jde za současné terapeutické návrhy jednoduše tím, že se brání šíření choroby, a pokud se sloučeniny příslušně používají, poskytuje se možnost lékařsky podrobit léčení aterosklerózu tím, že se brání novému poškození z pokračující choroby a již vzniklé poškození se přivádí k ústupu. Sloučeniny se mohou podávat k ošetřování chorob malých cév, u kterých ošetření není možné provést chirurgicky, nebo angioplastů nebo jiných cévních chorob, u kterých není možné vybrat k léčení chirurgii. Sloučeniny se mohou také používat ke stabilizaci pacientů před revaskularizační terapií.

Aktivní sloučenina nebo směs sloučenin se podává libovolným vhodným způsobem, včetně orálního a intravenozního podání, na které však nejsou omezeny. Obecné rozmezí dávky bude od 0,5 do 500 mg/kg tělesné hmotnosti s rozpisem dávky od jedné každý den do dvakrát denně. Délka dávkování bude v rozmezí od jediné dávky podané pouze jednou až dvakrát za den až po dávku podávanou v průběhu dvou až šesti měsíců.

Sloučeniny se mohou podávat přímo do vaskulární stěny za použití perfusních katetrů s balónkem ve směru k, oblasti koronární nebo k jiné arteriální angioplastické oblasti nebo do těchto oblastí. Jako příklad se uvádí podání 2 až 5 ml fyziologicky přijatelného roztoku, který obsahuje přibližně 1 až 500 μτηοΐ sloučeniny. Směs sloučenin se podává při jednonásobku až pětinásobku atmosférického tlaku. V průběhu následujících šesti měsíců, během období maximálního rizika restenózy, se aktivní sloučeniny podávají jinými vhodnými cestami a podle rozpisu dávek.

Relativně krátké období ošetřování aktivními sloučeninami se používá k tomu, aby se způsobilo zmenšené poškození, které je vyvoláno koronární artériální chorobou, jež nemůže být ošetřena bud' angioplasticky nebo chirurgicky. Příkladem krátkého období ošetřování je dva až šest měsíců, při dávkovém rozmezí od 0,5 do 500 mg/kg tělesné hmotnosti, podávané v rozmezí intervalu od jednou každý den do třikrát denně, přičemž tento příklad nemá být pokládán za omezením možných ošetření.

Aktivní sloučeniny se mohou podávat v období bezprostředně před a po koronární angioplasticitě, jako opatření ke snížení nebo vyloučeni abnormální proliferace a zánětlivé odezvy, která současně vede ke klinicky signifikantní restenóze.

Delší období ošetřování se může používat k zabránění vývoje postupujícího onemocnění u vysoce rizikových pacientů. Dlouhé období ošetřování může trvat léta, s dávkami v rozmezí od 0,5 do 500 mg/kg tělesné hmotnosti, při podávání v intervalu od jednou každý den do třikrát denně.

Aktivní sloučeniny se mohou také podávat v časovém období bezprostředně před a po koronárním angioplastickém ošetření, jako prostředek ke snížení nebo vyloučení abnormální proliferace nebo zánětlivé odezvy, která.současně vede ke klinicky významným restenózám.

Aktivní sloučeniny se mohou podávat současně s jinými léčivy používanými pro ošetřování kardiovaskulárních chorob, včetně přípravků snižujících lipidy, jako je probucol a kyselina nikotinová, inhibitorů shlukování krevních destiček, jako je aspirin, antitrombotických přípravků, jako je kumadin, blokátorů vápníkových kanálků, jako je varapamil, dilthiazem a nifedipin, angiotensin konvertujících enzymových (ACE) inhibitorů, jako je captopril a enalopril, a β-blokátorů, jako je propanalol, terbutalol a labetalol. Sloučeniny se také mohou podávat v kombinaci s nesteroidními protizánětlivými prostředky, jako je ibuprofen, indomethacin, fenoprofen, kyselina mefanamová, kyselina flufenamová nebo sulindac, nebo s kotikosteroidyo

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je ilustrací autoradiogramu mRNA, získané jak je popsáno dále, hybridizované bud' na ³²P-značené lidské VCAM-1 specifické cDNA (obdélník A), E-selektinové (ELAM-1) specifické cDNA (obdélník B) nebo ICAM-1 specifické cDNA (obdélník C). Po předchozím zpracování během 30 minut s 50 μιηοΐ natrium pyrrolidindithiokarbamátu (PDTC) se buňky HUVE (z lidské pupečníkové žíly) vystaví působení 10 jedn./ml IL-lb za nepřetržité přítomnosti 50 μιηοΐ natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu. Souběžná kontrolní stanovení se provádějí stejným způsobem s tím rozdílem, že natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát není přítomen. V uvedených časových intervalech se veškerá RNA izoluje a materiál rozdělený na velikost 20 μg se denaturuje 1,0% agarózovým gelem, obsahujícím formaldehyd, pro elektroforézu a přenese se do nitrocelulózy, hybridizuje jak je popsáno výše a vizualizuje autoradiograficky. Pruh 1-0 hodin, pruhy 2, 4, 6,. 8 - OL-1 samotný pro 2, 4, 8 a 24 hodiny, pruhy 3, 5, 7, 9 - IL-1 s PDTC pro 2, 4, 8 a 24 hodin.

Obr. 2 je ilustrací autoradiogramu mRNA, získané jak je popsáno dále, hybridizované bud' na ³²P-značené lidské VCAM-l specifické cDNA (obdélník A), E-selektinové (ELAM-1) specifické cDNA (obdélník B) nebo ICAM-1 specifické cDNA obdélník C). Buňky HUVE se předem zpracují uvedenými koncentracemi natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu, potom se vystaví IL-lb v přítomnosti natrium pyrrolidin-N-dithiokarba mátu na dobu 4 hodin a zkoušejí se na nahromadění VCAM-l na mRNA pomocí Northern filter hybridizačni analýzy. Pruh 1

- kontrolní stanovení, pruh 2 - IL-1 (10 jedn./ml), pruh 3 - IL-lb + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (0,05 μιηοΐ), pruh 4 IL-1 LB + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (0,5 μιηοΐ), pruh 5 - IL-lb + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (5,0 μπιοί), pruh 6 - IL-lb + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (50,0 μπιοί), pruh 7 - IL-lb + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (100 μπιοί).

Obr. 3 je ilustrací autoradiogramu mRNA, získané jak je popsáno dále, hybridizované bud' na ³²P-značené lidské VCAM-l specifické cDNA /obdélník A), E-selektinové (ELAM-1) specifické cDNA (obdélník B) nebo ICAM-1 specifické cDNA (obdélník C). Buňky HUVE se předem zpracují jak je popsáno v souvislosti s obr. 1 s 50 μπιοί natrium pyrrolidin-N-dithio karbamátu, vystaví se na dobu 4 hodin přípravkům uvedeným dále a zkouší se na nahromadění VCAM-l (obdélník A) a ICAM-1 (obdélník B) mRDA. Pruh 1 - TNFa (100 jedn./ml), pruh 2

- TNFa + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát, pruh 3

- lipopolysacharid (LPS) (100 ng/ml), pruh 4 - LPS + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát, pruh 5 - poly(I:C) (100 mg/ml), pruh 6 - poly(I:C) + natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát.

Obr. 4 je grafem relativní povrchové exprese,buněk VCAM-1 a ICAM-1 v přítomnosti (tmavý pás) nebo nepřítomnosti (světlý pás) natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu a v přítomnosti většího počtu typů indukujících stimulaci. Soutokové (confluent) buňky HUVE se předem zpracují nebo předem nezpracují (pouze CTL) během 30 minut s 50 μπιοί natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu a potom po uvedené časové období vystaví expozici zmíněných přípravků v přítomnosti nebo nepřítomnosti (pouze CTL) natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu. Exprese povrchových buněk se stanovuje primárním vázáním s VCAM-1 specifickými (4B9) a ICAM-1 specifickými (84H10) myšími monoklonálními protilátkami, s následujícím sekundárním vázáním s protimyším IgG kozy, značeným peroxidázou z křenu selského. Stanovení množství se provádí určením kalorimetrické konverze TMB při 450 nm. Obr. 4 ukazuje, že násobné regulátorové signály vyvolává VCAM-1, však nikoli ICAM-1 obecnou cestou sensitivity dithiokarbamátu v lidské vaskulární buněčné výstelce.

Obr. 5 je grafem relativní exprese povrchových VCAM-1 buněk (optická hustota, O.D., 595 nmol) v buněčné výstelce z pupečníkové žíly člověka, aktivovaných TNFa, proti koncentracím různých antioxidantů. (PDTC je natrium N-pyrrolidindithiokarbamát, DETC je natrium N,N-diethyl-N-karbodithioát, také označovaný jako natrium diethyldithiokarbamát, NAC je N-acetylcystein a DF je desferroximin).

Obr. 6 je grafem relativní exprese povrchových VCAM-1 buněk (optická hustota 595 nmol) v buněčné výstelce z pupečníkové žíly člověka, aktivovaných TNFa, v přítomnosti specifického množství antioxidantu. (PDTC je natrium N-pyrrolidindithiokarbamát, DiDTC je natrium N,N-diethyl-N-karbodithioát, SarDTC je natrium N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát, IDADTC je trinatrium N,N-di(karboxymethyl)-N-karbodithioát, MGDTC je natrium N-methyl-D-glukamin-N-karbodithioát, MeOBGDTC je natrium N-(4-methoxybenzyl)-D-glucamin-N-karbodithioát, DEDTC je natrium N,N-diethyl-N-karbodithioát, Di-PDTC je natrium N,N-diisopropyl-N-karbodithioát a NAC je N-acetylcystein )·.

Obr. 7 je grafem procentuálního obsahu buněk Molt-4 vázajících se k buňkám HUVE bud' ne stimul ováným nebo stimulovaným TNFa v množství 100 jedn./ml po dobu 6 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu.

Obr. 8 ilustruje chemickou strukturu těchto dithiokarbamátů:

natrium N-pyrrolidin-N-karbodithioát, natrium N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát, trinatrium N,N-di(karboxymethyl)-N-karbodithioát, natrium N-methyl-D-glukamin-N-karbodithioát, natrium N,N-diethyl-N-karbodithioát (natrium diethyldithiokarbamát), natrium N,N-diisopropyl-N-karbodithioát a natrium N-(4-methoxybenzyl)-D-glucamin-N-karboditioát.

Nyní se uvádí detailní popis vynálezu.

Výraz alkyl, pokud se zde používá a není jinak upřesněn, se týká nasycené přímé, rozvětvené nebo cyklické uhlovodíkové skupiny s 1 až 10 atomy uhlíku a jednotlivě zahrnuje methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, terč.-butyl, pentyl, cyklopentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl, cyklohexyl, 3-methylpentyl, 2,2-dimethylbutyl a 2,3-dimethylbutyl.

Výraz alkenyl, pokud se zde používá a není jinak upřesněn, se týká přímé, rozvětvené nebo cyklické uhlovodíkové skupiny se 2 až 10 atomy uhlíku, která obsahuje alespoň jednu dvojnou vazbu.

Výraz alkinyl, pokud se zde používá a není jinak upřesněn, se týká přímé nebo rozvětvené uhlovodíkové skupiny se 2 až 10 atomy uhlíku, která obsahuje alespoň jednu trojnou vazbu.

Výraz aralkyl se vztahuje k arylové skupině s alespoň jedním alkylovým substituentem.

Výraz alkaryl se vztahuje k alkylové skupině, která má alespoň jeden arylový substituent.

Výraz halogen(alkyl, alkenyl nebo alkinyl) se týká alkylové, alkenylové nebo alkinylové skupiny, ve které alespoň jeden z atomů vodíku ve skupině je nahrazen atomem halogenu.

Výraz aryl, pokud se zde používá a není jinak upřesněn, se týká fenylové skupiny nebo substituované fenylové skupiny, ve kterých fenylový kruh obsahuje alespoň jeden z těchto substituentů; hydroxyskupina, karboxyskupina nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, CO₂(alkylová) skupina, alkoxyskupina, alkylová skupina nebo glukaminový zbytek.

Výraz alkoxyskupina, pokud se zde používá a není jinak upřesněn, se týká části o struktuře -0-alkyl.

Výraz halogen, který se zde používá, zahrnuje atom fluoru, chloru, bromu a jodu.

Výraz hydroxyalkyl, který se zde používá, se týká alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, ve které alespoň jeden z atomů vodíku, připojený k libovolnému z atomů uhlíku, je nahrazen hydroxyskupinou.

Výraz thiolový antioxidant se vztahuje ke sloučenině obsahující síru, která zabraňuje oxidaci.

Výraz farmaceuticky přijatelný derivát se vztahuje k derivátu aktivní sloučeniny, která je po podání příjemci schopna přímo nebo nepřímo poskytnout základní sloučeninu, která má sama aktivitu.

I. Aktivní sloučeniny

Bylo nalezeno, že dithiokarboxyláty jsou vhodné pro ošetřování aterosklerozy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob. Dithiokarboxyláty včetně dithiokarbamátů se mohou používat k blokování schopnosti buněk, včetně buněčné výstelky, způsobit expresi VCAM-1, co je genový produkt, o kterém je známo, že je odpovědný za přilnavost leukocytů k buňkám. Skutečnost, že dithiokarboxyláty včetně dithiokarbamátů inhibují genovou expresi VCAM-Í, významně podporuje důležitost oxidace jako počátečního signálu při změněných interakcích vaskulárních-zánětlivých buněk.

Zvláštní molekulární mechanizmus, kterým dithiokarboxyláty působí při inhibici genové exprese VCAM-1, není znám.

Alespoň jedna ze sloučenin, natrium pyrrolidindithiokarbamát (PDTC), inhibuje genovou expresi VCAM-1 při koncentraci nižší než 1,0 μπιοί. Tato sloučenina tak projevuje preferenční toxicitu k proliferujícím nebo abnormálně dělícím se vaskulárním buňkám hladkého svalstva. Bylo nalezeno, že natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát neblokuje významně expresi ELAM-1 nebo ICAM-1, a proto ošetřováni touto sloučeninou nemá nepříznivě působící stránky na zánětlivou odezvu zprostředkovanou ELAM-1 nebo ICAM-1. Tak se obecně vyhne potlačení imunity. Tím se může vyhnout systémovým komplikacím z obecného potlačení adhezních molekul u řady jiných typů buněk, známých k jejich expresi.

Dithiokarboxyláty jsou sloučeniny struktury obecného vzorce

A-SC(S)-B, které jsou členy obecné skupiny sloučenin známých jako thiolové antioxidanty, a které se jinak uvádějí ve vztahu s karbodithioly nebo karbodithioláty. Zdá se, že část vzorce SC(S) je podstatná pro terapeutický účinek a že A a B mohou být libovolné skupiny, které nemají nepříznivý účinek na účinnost nebo toxicitu sloučeniny. A a B mohou být zvoleny odborníkem v oboru k propůjčení požadovaných charakteristických vlastností sloučenině, včetně velikosti, náboje, toxicity a stupně stability (počítaje v to stabilitu v kyselém prostředí, jako je v žaludku, nebo v bázickém prostředí, jako je v intestinálním traktu). Výběr A a B bude mít také důležitý účinek na distribuci ve tkáni na farmakokinetické vlastnosti sloučeniny. Obecně je pro ošetřování kardiovaskulárních chorob žádoucí, aby se sloučenina hromadila nebo umísťovala ve vrstvě blízké tepně, která obsahuje vaskulární buněčnou výstelku. Sloučeniny se výhodně vylučují vyměšováním z ledvin.

Jako ničím neomezené příklady A a B se mohou nezávisle na sobě uvést alkylová, alkenylová, alkinylová, alkarylová, aralkylová, halogenalkylová, halogenalkenylová, halogenalki16 nylová, arylová a alkarylová skupina, atom vodíku, alkoxyalkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části a 1 až 10 atomy uhlíku v alkylové části, alkylthioalkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylthiočásti a 1 až 10 atomy uhlíku v alkylové části, substituovaná alkylová skupina s 1 až 10 atomy uhlíku (kde substituentem je nezávisle na sobě hydroxyskupina, karbonyl nebo zbytek karboxylové kyseliny, které jsou umístěny na libovolném ze všech 10 atomů uhlíku), dále skupina vzorce NR²R³, -(CHOH)_nCH₂OH, kde n značí číslo 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, skupina vzorce -(CH₂)_n ^C02^Rl' včetně acetylu, propionylu a butyrylu, hydroxyalkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku (kde alespoň jedna hydroxylové skupina je umístěna na libovolném z atomů uhlíku) a A může být farmaceuticky přijatelný kation včetně sodíku, draslíku nebo skupiny vzorce NR⁴R⁵R⁶R⁷, na které výčet není omezen.

Při jiném provedení se může podávat dimer obecného vzorce

B-C(S)S-SC(S)-B.

Dithiokarboxyláty se mají volit pro použiti při ošetřování aterosklerózy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob tak, aby měly vlastní lipofilicitu k umístění v postiženém místě. Sloučenina se nedostává do oblastí s nízkou přeměnou, jako do místa ukládání tuku. Při výhodném ošetřování kardiovaskulárních chorob, farmakokinetické vlastnosti sloučeniny by neměly být výrazně zhoršovány selháním srdce v důsledku jeho překrvení nebo nedostatečnosti ledvin.

Dithikarboxyláty musí být fyziologicky přijatelné. Obecně jsou přijatelné sloučeniny s terapeutickým indexem alespoň 2 a výhodně alespoň 5 nebo 10. Terapeutický index je definován jako poměr EC₅₀/IC₅₀, kde symbol EC₅₀ znamená koncentraci sloučeniny, která inhibuje expresi VCAM-1 o 50 % a symbol IC^q označuje koncentraci sloučeniny, která je toxická pro 50 % cílových buněk. Buněčná toxicita se může měřit přímým spočítáním buněk, exkluzí trypanovou modří nebo studiemi měnící se metabolické aktivity, tak jako vpravením ³H-thymidinu, jak je známo odborníkovi v oboru. Terapeutický index natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu ve tkáňové kultuře je nad 100, jak -se změří na základě buněčné toxicity dělené schopností inhibovat expresi VCAM-1, při aktivaci TNFa, u buněk HUVE (pupečníková žíla člověka). Počáteční studie na rychle se dělících buňkách typu HT-18 gliomu člověka dokládají, že nenastává toxicita při koncentracích stonásobně větších než je terapeutická koncentrace. Disulfiram, orálně podávána forma diethyldithiokarbamátu, používaný pro ošetřování závislosti na alkohol, obecně nevyvolává velkou klinickou toxicitu, pokud se vhodně podává.

Je několik dithiokarbamátů, které jsou známé jako látky toxické pro geny. Tyto sloučeniny nespadají do rozsahu tohoto vynálezu, který je omezen na podávání fyziologicky přijatelných látek. Jako příklad dithiokarbamátů toxického pro geny se uvádí dimethyldithiokarbamát zinku, známý jako fungicidní prostředek. Dále anticholinesterázové vlastnosti určitých dithiokarbamátů mohou vést k neurotoxickému poškození (D. Miller, Neurotoxicity of the pesticidal carbamates, Neurobehay. Toxicol. Teratol. 4(6). 779-787 /1982/).

Výraz dithiokarboxylát, jak se zde používá, jmenovitě zahrnuje, třebaže na ně není omezen, dithiokarbamáty obecného vzorce

Rl-SCtSjNR^³ a R²R³N(S)CS-SC(S)NR²R³, ve kterých

R¹ znamená atom vodíku nebo farmaceutický přijatelný kation včetně sodného a draselného, aniž by na ně byl omezen, nebo skupinu vzorce NR⁴R⁵R⁶R⁷, kde R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, přímou, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu s· 1 až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, na které jedna nebo větší počet hydroxyskupin je umístěn na libovolném z atomů uhlíku, nebo znamená arylovou skupinu a

R² a R³ znamenají nezávisle na sobě přímou, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo skupinu vzorce -(CHOH)_n(CH₂)_nOH, kde n značí číslo 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, skupinu vzorce -(CH₂)_nCO₂R¹, -(CH₂)_nCO₂R⁴, hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo

Zvláštní příklady vhodných dithiokarbamátů ilustrovaných na obr. 8 zahrnují natrium pýrrolidin-N-karbodithioát, natrium N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát, trinatrium N,N-di(karboxymethyl)-N-karbodithioát, natrium N-methyl-D-glukamin-N-karbodithioát, natrium Ν,Ν-diethyl-N-karbodithio át (natrium diethyldithiokarbamát) a natrium N,N-diisopropyl-N-karbodithioát.

Aktivní dithiokarboxyláty a zvláště dithiokarbamáty jsou bud' obchodně dostupné nebo se mohou vyrobit za, použití známých způsobů.

Při molekulární hladině natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu se také ukazuje, že tato sloučenina inhibuje aktivaci transkripčního regulátorového faktoru Nf-kB v odezvu na určitou cytokinovou a necytokinovou stimulaci (R. Schreck a kol., Reactive oxygen intermediates as apparently widely ušed messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-1, EMBO J. 10(8). 2247-2258 /1991/, R. Schreck a kol., Dithiokarbamates as potent inhibitors of nuclear factor B activation in intact cells,

J. Exp. Med. 175. 1181-1194 /1992/). Avšak zkouškou posunu mobility gelu z jaderných extraktů buněk HUVE s různými zvyšujícími se projevy podobnými kB bylo nalezeno, že buněčná výstelka aktivuje genovou expresi VCAM-1 zřejmě novým transkripčním regulátorovým faktorem, který není Nf-kB. To naznačuje, že natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát může regulovat genovou expresi buněčné výstelky svým účinkem na nový transkripční regulátorový protein. Bylo také doloženo, že exprese VCAM-1 je vyvolána větším počtem faktorů v kultivovaných buňkách Kaposiho sarkomu, co může být důležité při jejich patogenezi. Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát blokuje expresi VCAM-1 -v buňkách Kaposiho sarkomu, které jsou aktivovány TNF, IL-1 a poly(I:C).

Bylo také nalezeno, že buňky hladkého svalstva produkují rozpustnou formu VCAM-1, která může být vylučována buňkami, a která může působit jako přírodní antihistamin.

II. Biologická aktivita

Schopnost dithiokarboxylátů inhibovat expresi VCAM-1 se může měřit různými způsoby, včetně metod uvedených podrobně dále v příkladech 1 až 7. Kvůli příkladům 1 až 3, a 7 se popisuje ohodnocení biologického účinku natrium pyrrolidin-N-karbodithioátu (také označovaného jako PDTC). Tyto příklady nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu vynálezu, který specificky zahrnuje použití libovolné z výše popsaných sloučenin pro ošetřování aterosklerózy a jiných typů zánětu a kardiovaskulárních chorob, zprostředkovaných VCAM-1.

Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát může být snadno nahrazen libovolnou ze sloučenin popsaných výše a ohodnocen podobným způsobem.

Příklady 4 a 5 poskytují srovnávací hodnoty týkající se schopnosti řady dithiokarbamátů inhibovat genovou expresi VCAM-1. Příklady uvedené dále podávají obraz o tom, že nárokované dithiokarbamáty specificky blokují schopnost VCAM-1 podrobit se expresi vaskulární buněčnou výstelkou v odezvu na řadu signálů, o kterých je známo, že jsou aktivní při ateroskleróze a odezvě na zánět.

Experimentální postupy

Buněčné kultury

Buňky HUVE, izolované z pupečníkové žíly člověka, se kanylují, propláchnou Hankovým roztokem k odstranění krve a potom inkubují s 1% kolagenázou za teploty 37 °C po dobu 15 minut. Po odstranění kolagenázy se buňky kultivují v prostředí M199, doplněném 20% fetálním telecím šerem (HyClone), 16 ug/ml heparinu (ESI Pharmaceuticals, Cherry Hill, New Jersey, USA), 50 μg/ml růstového doplňku buněčné výstelky (Collaborative Research Incorporated, Bedford, Massachsetts, USA), 25 mmol Hepes pufru, 2 mmol L-glutaminu,

100 μς/πιΐ penicilinu a 100 μg/ml streptomycinu, a nechají růst na deskách tkáňové kultury povlečených 0,1 % želatiny, za teploty 37 °C. Buňky se podrobí pasáži při soutoku štěpením 1:4. Buňky se použijí v prvních 8 pasážích.

Inkubace s cytokiny a jinými reakčními činidly

Soutokové buňky HUVE se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a potom se dodají do čerstvého prostředí. Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát se přidává na uvedených koncentracích, jak se provede předchozí zpracování 30 minut před přidáním cytokinů. Cytokiny a jiné indukující látky se přímo přidávají do prostředí v uvedených časech a koncentracích, které jsou udány při každém experimentu. Lidský rekombinant IL-lb je genetický jed od firmy Upjohn Company (Kalamazoo, MI, USA). TNFa se získává od firmy Bohringer Ingelheim (NSR). Bakteriální lipopolysacharid (LPS), kyselina polyinosinová, kyselina polycitidilová (Póly I:C) a pyrrolidindithiokarbamát (natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát) se opatřují u firmy Sigma Chemical (St. Louis, Montana, USA). Všechny další reakční činidla mají jakost pro reagencie.

Izolace RNA

Celková buněčná RNA se izoluje jednoduchou extrakcí za použití kyselé směsi guanidiumthiokyanátu, fenolu a chloroformu. Buňky se propláchnou fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a potom lýzují. 2 ml guanidiumisothiokyanátu. Roztok se okyselí 0,2 ml octanu sodného (hodnota pH 4,0) a potom se extrahuje 2 ml fenolu a 0,4 ml směsi chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24 : 1. RNA se podrobí dvěma preparacím ethanolem předtím, než se použije pro analýzu skvrn Northern.

Analýza skvrn Northern μ9 celkové buněčné RNA se frakcionuje podle velkosti za použití 1% agarózového gelu obsahujícího formaldehyd, v přítomnosti 1 μg/ml ethidiumbromidu. RNA se přenese na nitrocelulózový filtr a kovalentňé váže , ultrafialovým zářením za použití zařízení Stratlinker UV Crosslinker (Stratagene, La Jolla, Kalifornie, USA).

Hybridizace se provádí za teploty 42 °C po dobu 18 hodin v 5x SSC (lx = 150 mmol chloridu sodného, 15 mmol citrátu sodného), 1% dodecylsulfátu sodném, 5x Denhardtově roztoku, 50% formaldehydu, 10% dextransulfátu a 100 μg/ml DNA ze spermatu lososa, denaturovaného střihem. Přibližně 1 χ 10⁶ až 2 χ ΙΟ⁶ μιη/ιηΐ značeného zkušebního vzorku (o specifické aktivitě menší než 10⁸ cpm/^g DNA) se použije na hybridizaci. Potom se provede hybridizace a filtráty se promyjí s konečnou ostrostí 0,2 x SSC za teploty 55 °C. Nitrocelulóza se stripuje za použití vroucí vody před rehybridizací s jiným zkušením vzorkem. Autoradiograf se provádí při zesilujícím stínění za teploty -70 °C.

Zkušební vzorky

Vzorky DNA značené ³²P se zhotoví za použití primerové oligonukleotidové metody s nahodilým uspořádáním. Zkušebním vzorkem ICAM-1 je fragment Eco Rl z lidské cDNA. Zkušebním vzorkem ELAM-1 je fragment 1,85 kb Hind III z lidské cDNA. Zkušebním vzorkem VCAM-1 je fragment Hind III-Xho I z lidské cDNA sestávající z nukleotidu 132 až 1814.

Zkouška enzymu vázaného na imonusorbent (ELISA)

Buňky HUVE se umístí na desky tkáňové kultury s 96 jamkami 48 až 72 hodiny před zkouškou. Do každé jamky se přidají primární protilátky v prostředí M199 s 5% fetálního telecího sera a vše se inkubuje za teploty 37 °C po dobu 1 hodiny. Buňky se potom promyjí a inkubují po dobu 1 hodiny s antimyším IgG kozy, konjugovaným peroxidázou (Bio Rad), při zředění v poměru 1 : 500 v M199 s 5% fetálního telecího sera. Buňky se potom promyjí a vázání protilátky se stanoví přídavkem 100 μΐ roztoku, který obsahuje 10 mg/ml 3,3,5,5'-tetramethylbenzidinu (Sigma) s obsahem 0,003 % peroxidu vodíku. Reakce se zastaví přídavkem 25 μΐ 8-normální kyseliny sírové. Desky se· odečtou na vyhodnocovacím zařízení ELISA (Bio Rad) při optické hustotě O.D. odpovídající 420 nmol, po slepém odečtení na řádky vybarvené pouze s druhým stupněm protilátky. Údaje představují střední hodnoty z trojnásobných měření.

Protilátky

Monoklonální protilátka (MAb) 4B9, vhodná pro zjištění vaskulární adhezní molekuly-1 (VCAM-1) buněk, je velkorysým darem Dr. Johna Harlana z University of Washington, USA. MAb E9A1F1, vhodná pro zjištění adhezní molekuly buněčné výstelky (ELAM-1), je šlechetný dar Dr. Swerlicka z Emory University. Hybridomy produkující MAb 84H10, které zjištují intermolekulární adhezní molekuly-1 (ICAM-1) rostou běžným způsobem v laboratoři původců tohoto vynálezu. Protilátky se používají jako supernatantová tkáňová kultura.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát blokuje indukci VCAM-1 buněk HUVE zprostředkovanou IL-lb, ale ne ICAM-1 nebo ELAM-1, nahromadění mRNA

Ke stanovení, zda oxidační stav buněčné výstelky může urychlit basální nebo indukovanou expresi buněčných adhezních molekulárních genů, se lidská vaskulární buněčná výstelka vystaví indukujícímu cytokinu, IL-lb (10 jedn./ml) v přítomnosti nebo nepřítomnosti thiolovaného antioxidantu chaletizujícího kov a pyrrolidindithiokarbamátu (natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát, 50 μιηοΐ) až na dobu 24 hodin.

Jak je znázorněno na obr. 1, samotný IL-lb (pruhy 2, 4, 6 a 8) indukuje s očekávanou rychlostí a s přechodnou indukcí VCAM-l (obdélník· A), E-selektin (ELAM-1, obdélník B) a ICAM-1 (obdélník C) nahromadění mRNA, přičemž všechny píky se dosahují za 4 hodiny. Avšak v přítomnosti natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu, IL-lb indukce VCAM-l nahromadění mRNA se výrazně inhibuje nad 90 % (obdélník A, pruhy 3, 5, 7 a 9). V protikladu k tomu, třebaže IL-lb zprostředkovaná indukce ELAM-1 je slabě inhibována za 2 a 24 hodiny (srovnej pruhy 2 a 3 a dále 8 a 9 na obdélníku Β), natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát neinhibuje indukci za 4 a 8 hodin (pruhy 5 a 7 na obdélníku B). IL-lb zprostředkovaná indukce z ICAM-1 nahromadění mRNA není nepříznivě ovlivněna (obdélník B, pruhy 3, 5, 7 a 9). Ve skutečnosti se pozoruje mírné zvětšení IL-lb indukce z ICAM-1 nahromadění mRNA (přibližně o 30 %) (srovnej pruhy 4 a 5 na obdélníku B). Ekvivalentní množství nitrocelulózou přenesené RNA na pruh je potvrzeno obarvením ethidiumbromidem a vizuálním sledováním.

Analýza hodnot dávka-odezva se provádí ke stanovení, zda natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát inhibuje indukci exprese VCAM-l genu pomocí IL-lb v dávce závislé na způsobu. Jak je znázorněno na obr. 2, natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát inhibuje IL-lb zprostředkovanou indukci exprese VCAM-l genu se strmou křivkou dávka-odezva (obr. 2, obdélník A), s vypočítanou hodnotou EC₅₀ přibližně 10 μιηοΐ, zatímco natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát neinhibuje indukci ELAM-1 exprese při těchto koncentracích, zprostředkovanou IL-lb (obr. 2, obdélník B). IL-lb zprostředkovaná indukce

ICAM-1 nahromadění mRNA je zvýšena natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátem při koncentracích vyšších než 0,5 μιηοΐ (obr.

2, srovnej pruh 2 a pruhy 4 až 7 na obdélníku C).

Tyto údaje dokládají, že IL-lb používá dithiokarboxylát a zvláště sensitivní stupeň s dithiokarbamátem, jako část svého signalizačního mechanizmu pro indukci exprese VCAM-1 genu. Tyto údaje také ukazují, že tento sensitivní stupeň s dithiokarbamátem nehraje významnou úlohu při indukci exprese ELAM-1 nebo ICAM-1 genu, která je zprostředkována IL-lb.

Příklad 2

Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát blokuje indukci VCAM-1 buněk HUVE nahromadění mRNA vícenásobným stimulováním

Ke stanovení, zda jiné dobře popsané aktivátory exprese VCAM-1 genu také používají sensitivní stupeň s natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátem, se testují tři oddělené skupiny aktivátorů: indukující přípravek zprostředkovaný jiným klasickým receptorem (faktor tumorové nekrózy, TNFa), indukující látka zprostředkovaná nereceptorem (lipopolysacharid, LPS) a nedávno popsaná nová indukující látka (dvojitě stočená RNA, poly(I:C)). Ve všech třech případech natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát výrazně inhibuje indukci VCAM-1 nahromadění mRNA v buňkách HUVE po 4 hodinách (obr. 3, obdélník A). Ačkoliv exprese ELAM-1 genu zprostředkovaná TNFa je v určitém rozsahu potlačena (obr. 3, pruh 1 a 2, obdélník B), z ELAM-1 nahromadění mRNA zprostředkované LPS a poly(I:C) je bez nepříznivého ovlivnění (obr.

3, pruhy 3 až 6, obdélník B). Indukce ICAM-1 nahromadění mRNA je bez nepříznivého ovlivnění (obr. 3, obdélník C). Tyto hodnoty ukazují, že strukturně odlišné indukující prostředky, působící odlišnými způsoby, se podílejí na obecném regulačním stupni specificky pro indukci exprese VCAM-1 genu.

Příklad 3

Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát blokuje povrchovou expresi VCAM-1 buněk HUVE indukovanou při vícenásobném stimulování

Ke stanovení, zda podobně jako mRNA, indukce povrchové proteinové exprese VCAM-1 buněčné výstelky by také byla inhibována natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátem, se použije monoklonálních protilátek při zkoušce ELISA, ke kvantitativnímu stanovení indukce buněčného povrchu VCAM-1 a ICAM-1 v kultivovaných buňkách HUVE. Jak je znázorněno na obr. 4, větší počet souborů aktivujících přípravků v nepřítomnosti natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (-PDTC) indukuje rychlé a krátkodobé nahromadění VCAM-1 (horní levý obdélník) na povrchu buněk, při dosažení vrcholu za 6 hodin. V přítomnosti natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (+PDTC, horní pravý obdélník) se indukce povrchové exprese VCAM-1 buněk všemi testovanými přípravky výrazně inhibuje (80 až 90 %). Naopak indukovaná exprese buněčného povrchu ICAM-1 je bez nepříznivého ovlivnění za identických podmínek (spodní levé a pravé obdélníky).

Tyto údaje ukazují, že podobně jako nahromadění mRNA, exprese VCAM-1 povrchových buněk se selektivně inhibuje dithiokarbamáty, a že větší počet souborů aktivujících přípravků používá podobný sensitivní mechanizmus dithiokarmabátů k indukci exprese VCAM-1 genu.

Příklad 4

Poměrná účinnost antioxidantů při blokování TNFa indukce VCAM-1

Ke stanovení, jestli strukturně podobné nebo odlišné antioxidanty by mohly inhibovat expresi VCAM-1 genu a s jakou silou, se buňky HUVE vystaví působení TNFa po dobu 6 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti 5 rozdílných antioxidantů v odlišných koncentracích. Jak je uvedeno na obr. 5, jak diethyldithiokarbamát (DETC), tak N-acetylcystein (NAC) inhibují expresi VCAM-1 při koncentracích 5 a 30 μπιοί.

Naproti tomu natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát (PDTC) je účinný mezi 5 a 50 μιηοΐ. Chelatizační činidlo pro kovové železo, desferroximin, nemá účinek při testovaných koncentracích.

Příklad 5

Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát inhibuje TNFa indukci adheze zprostředkovanou VCAM-l/VLA-4

Schopnost různých antioxidantů inhibovat TNFa indukci VCAM-1 v buňkách HUVE se hodnotí způsobem uvedeným v příkladu

4. Obr. 6 je grafem relativní povrchové exprese VCAM-1 buněk (optická hustota, O.D., 595 nmol) v TNFa aktivovaných buňkách HUVE proti daným koncentracím

PDTC (natrium N-pyrrolidindithiokarbamát),

DiDTC (natrium N,N-diethyl-N-karbodithioát),

SarDTC (natrium N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát), IDADTC (trinatriům N,N-di(karboxymethyl)-N-karbodithioát), MGDTC (natrium N-me thy 1,-D-glukamin-N-karbodithioát),

MeOBGDTC (natrium N-(4-methoxybenzyl)-D-glukamin-N-karbodithioát,

DEDTC (natrium N,N-diethyl-N-karbodithioát),

Di-PDTC (natrium N,N-diisopropyl-N-karbodithioát) a

NAC (N-acetylcystein).

Nejméně účinné sloučeniny jsou natrium N-(4-methoxy28 benzyl)-D-glukamin-N-karbodithioát a N-acetylcystein.

Příklad 6

Ke stanovení, zda natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátem způsobená inhibice VCAM-l regulace je spojena s funkčními důsledky, stanoví se vázání buněk Molt-4 na buňky HUVE bud' nestimulované nebo stimulované 100 jedn./ml TNFa po dobu 6 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti natrium pyrrolidin-Ndithiokarbamátu. U buněk Molt-4 se předtím ukázalo, že jsou vázány k aktivovaným buňkám HUVE prostřednictvím mechanizmu závislého na VCAM-l. Jak ukazuje obr. 6, procentuální množství buněk Molt-4 vázajících se na buňky HUVE klesá, pokud je v prostředí přítomen natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát .

Příklad 7

Natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát inhibuje monocyt vázající se k hrudní aortě králíků krmených cholesterolem

Pokus se provádí ke stanovení, zda thiolový antioxidant natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát by byl účinný při blokování první složky aterosklerózy vázající monocyt na experimentálním zvířecím modelu. Jeden dospělý bílý králík kmene New Zealand, o hmotnosti 3,5 kg, obdrží intravenozní injekci natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu (20 mg/kg, při koncentraci 20 mg/ml v PBS) jednou denně po dobu 5 dnů. Injekce se podávají prozatímně uloženou kanylou do žíly v okrajové oblasti ucha, která se udržuje přístupná prouděním heparinizovaného fyziologického roztoku. Roztok natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu se míchá čerstvý denně nebo ob den (skladován při ochraně před světlem za teploty 4 °C) a filtruje (póry filtru 0,45 mm) bezprostředně před použitím. Po první injekci, kdy se provede umístění kanyly, se léčivá látky podává králíkovi při vědomí, bez zřejmého neklidu nebo jiných příznaků nemoci. Při injekci v druhý den, králík dostává žrádlo obsahující 1 % hmotnostních cholesterolu a v tom se pokračuje během zbývající části experimentu.

V pátý den se zvíře milosrdně usmrtí a hrudní aorta se vyřízne a fixuje. Po příslušné preparaci se vzorek zobrazí na nižším stupni skanovacího elektronového mikroskopu ISI DS-130, který je vybaven emitorem LaB. Za použití zobrazení s dvojitým stínítkem a transparentní mřížky na stínítku CRT, se 64 sousedícími polemí, se pří 620-násobném zvětšení stanoví, že pokrývá oblast přibližně 1,3 mm². V každém poli se spočítají a zaznamenají leukocyty (WBC) a erytrocyty (RBC), u kterých došlo k adhezi.

Údaje ze vzorku oblouku jsou tyto: 5 WBC a -25 RBC na

1,3 mm². Tato úroveň WBC adheze je obdobná jako u kontrolních zvířat krmených běžným žrádlem (v oblouku se pozoruje přibližně 7 případů na oblast a hrudní vzorky ze 2 negativních kontrolních experimentů). Pozitivní kontrolní králíci, krmení 1 % cholesterolu po dobu 4 dnů, avšak bez podávání antioxidantu, projevují přibližně pětinásobné zvýšenou adhezi, odpovídající 38 WBC/1,3 mm². Značné množství většinou mrtvé tkáně velikosti buněk se pozoruje přilnuté ke každému vzorku oblouku. Není jasné, zda tento materiál vznikl uměle z preparace nebo zda byl přítomen in vivo a pokud by tomu tak bylo, zda toto souvisí s podáváním natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu. Tato studie svědčíí o tom, že infuze natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamátu může účinně blokovat počáteční adhezi monocytů ke výstelce aorty.

III. Farmaceutické prostředky

Lidé a jiní živí tvorové, zvláště savci, trpící kardiovaskulárními chorobami a jinými zánětlivými stavy zprostředkovanými VCAM-1, se mohou ošetřovat tím, že se pacientovi podá účinné množství alespoň jedné z výše vymezených sloučenin nebo jejich farmaceuticky přijatelných derivátů nebo solí, ve farmaceuticky přijatelné nosné látce nebo ředidlu. Aktivní materiály se mohou podávat libovolnou vhodnou cestou, například orálně, parenterálně, intravenózně, intradermálně nebo subkutánně.

Když se zde používá výrazu farmaceuticky přijatelné soli nebo komplexy, tento výraz týká se solí nebo komplexů, které uchovávají požadovanou biologickou aktivitu výše charakterizovaných sloučenin a mají minimální nežádoucí toxikologické účinky. Neomezujícími příklady takových solí jsou (a) adiční soli s kyselinami, vzniklé z anorganických kyselin (například kyseliny chlorovodíkové, kyseliny bromovodíkové, kyseliny sírové, kyseliny fosforečné, kyseliny dusičné a podobně) a soli vzniklé z organických kyselin (například kyseliny octové, kyseliny oxalové, kyseliny vinné, kyseliny jantarové, kyseliny jablečné, kyseliny askorbové, kyseliny benzoové, kyseliny tříslové, kyseliny pamoové, kyseliny alginové, kyseliny polyglutamové, kyseliny naftalensulfonové, kyseliny naftalendisulfonové, kyseliny polygalakturonové, (b) adiční soli s bázemi, vzniklé z polyvalentních kovových kationů, jako je zinek, vápník, bismut, baryum, hořčík, hliník, měd', kobalt, nikl, kadmium, sodík, draslík a podobně, nebo z organických kationů, vzniklých z N,N-dibenzylethylendiaminu, D-glukosaminu, amonia, tetraethylamonia nebo ethylendiaminu nebo (c) kombinací (a) a (b), například zinečnaté soli kyseliny tříšlové a podobně.

Aktivní sloučenina je obsažena ve farmaceuticky přijatelné nosné látce nebo ředidle v množství dostačujícím k dodání terapeuticky účinného množství pacientovi, aniž by se způsobila řada toxických účinků u ošetřovaného pacienta. Výhodná dávka účinné sloučeniny pro všechny výše zmíněné stavy je v rozmezí od přibližně 0,5 do 500 mg/kg, výhodně od 1 do 100 mg/kg za den. Účinné dávkové rozmezí farmaceuticky přijatelných derivátů se může vypočítat na základě hmotnosti základní sloučeniny, která má být uvolněna. Jestliže derivát projevuje sám aktivitu, účinná dávka se může stanovit jako je uvedeno výše, za použití hmotnosti derivátu nebo jiným způsobem známým odborníkovi v oboru.

Sloučenina se obvykle podává v libovolné vhodné formě dávkové jednotky, včetně jednotky s obsahem 1 až 3000 mg aktivní látky, účelně 5 až 500 mg aktivní látky na formu dávkové jednotky, na které však možnosti nejsou omezeny. Orální dávka od 25 do 250 mg je obvykle vhodná.

Aktivní složka by se měla podávat k dosažení vrcholných koncentrací aktivní látky v plasmě od přibližně 0,1 do 100 μιηοΐ, výhodně od přibližně 1 do 10 μιηοΐ. Toho se může dosáhnout například intravenózní injekcí roztoku nebo prostředku aktivní složky, popřípadě ve fyziologickém roztoku nebo vodném prostředí nebo podáním sousta s obsahem aktivní složky.

Koncentrace aktivní sloučeniny v léčivém prostředku bude záviset na absorpci, distribuci, inaktivaci a rychlosti vylučování léčivé látky, stejně jako na jiných okolnostech známých odborníkovi v oboru. Je třeba poznamenat, že hodnota dávky se bude také měnit s obtížností stavu určeného ke zmírnění. Dále je třeba vzít v úvahu, že pro libovolného zvláštního pacienta se specifický režim dávkování může upravit během času podle individuálních potřeb a profesionálního úsudku osoby podávající nebo dohlížející na podání prostředku, a že koncentrační rozmezí se uvádí pouze jako příklady a není zamýšleno jako omezení rozsahu praktického provedení nárokovaných prostředků. Aktivní složka se může podávat najednou nebo rozdělena na řadu menších dávek, určených k podání v pozměněných časových intervalech.

Orální prostředky budou obecně zahrnovat inertní ředidlo nebo poživatelnou nosnou látku. Mohou být zahrnuty do želatinových kapslí nebo slisovány do tablet. Za účelem orálního terapeutického podání se aktivní sloučenina může uvést do těsného styku s pomocnými látkami a používat ve formě tablet, trochet nebo kapslí. Farmaceuticky snášenlivé pojivové prostředky a/nebo pomocné látky se mohou zahrnout jako část prostředku.

Tablety, pilulky, kapsle, trochety a podobné formy mohou obsahovat libovolné z dále uvedených složek nebo sloučenin podobné povahy:

pojivá jako je mikrobiologická celulóza, guma, tragant nebo želatina, excipienty (pomocné látky) jako je škrob nebo laktóza, desintegrační přípravky, jako je kyselina alginová, Primogel nebo kukuřičný škrob, maziva, jako je stearát hořečnatý nebo Sterotes-, látky umožňující klouzání, jako je koloidní oxid křemičitý, sladidla jako je sacharóza nebo sacharin, nebo aromatizační přípravky, jako je mentol, methylsalycilát nebo pomerančové ochucovadlo.

Pokud jednotkovou dávkovou formou je kapsle, může kromě látek výše uvedeného typu obsahovat kapalné nosné látky, jako mastné oleje. Mimo to dávkové jednotkové formy mohou obsahovat různé jiné materiály, které modifikují fyzikální formu jednotkové dávky, například obsahují povlaky z cukru, šelaku nebo jiných poživatelných přípravků.

Aktivní sloučenina nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo derivát se mohou podávat jako složka elixíru, suspenze, sirup, oplatka, žvýkací guma a podobně. Sirup může obsahovat, kromě aktivních sloučenin, cukr jako sladidlo a některé konzervační prostředky, barviva a aromatizační přípravky.

Aktivní sloučenina nebo její farmaceuticky přijatelné deriváty nebo soli se mohou také podávat s jinými aktivními látkami, které nepoškozují požadovaný účinek, nebo s látkami, které doplňují požadovaný účinek, jako jsou antibiotika, antifungální přípravky, protizánětlivé prostředky nebo protivirově účinné sloučeniny. Aktivní sloučeniny se mohou podávat s přípravky snižujícími lipidy, jako je probucol nebo kyseliny nikotinová, inhibitory shlukování krevních destiček, jako je aspirin, antitrombotickými přípravky jako je kumadin, blokátory vápníkových kanálků, jako je varapamil, dilthiazem a nifedipin, angiotensin konvertujícími enzymovovým (ACE) inhibitory, jako je captopril a analopril, a β-blokátory^ jako je propanalol, terbutalol a labetalol. Sloučeniny se také mohou podávat v kombinaci s nesteroidními protizánětlivými prostředky, jako je ibuprofen, indomethacin, aspirin, fenoprofen, kyselina mefanamová, kyselina flufenamová a sulindac.. Sloučenina se může také podávat s kortikosteroidy.

Roztoky nebo suspenze používané pro parenterální, intradermální, subkutánní nebo lokální podání mohou zahrnovat tyto složky:

sterilní ředidlo, jako voda pro injekce, fyziologický roztok, ztužené oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla, antibakteriální přípravy, jako je benzylalkohol nebo methyIparabeny, antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo hydrogensiřičitan sodný, chelatizační činidla, jako je kyselina ethylendiamintetraoctová, pufry, jako jsou octany, citráty nebo fosfáty a prostředky pro úpravu toxicity, jako je chlorid sodný nebo dextróza.

Parenterální prostředky mohou být vneseny do ampulí, injekčních stříkaček k okamžitému použití nebo do lékovek pro větší počet dávek, zhotovených ze skla nebo plastické hmoty.

Pokud se provádí intravenozní podání, výhodné nosné látky jsou fyziologický roztok nebo fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (PBS).

Aktivní sloučenina se také může podávat přes transdermální náplast. Způsoby výroby transdermálních náplastí jsou známy odborníkovi v oboru, viz například L. Brown a R. Lanter, Transdermal delivery of drugs, Ann. Rev. Med. 39, 221-229 /1988/.

Při jiném provedení se aktivní sloučeniny budou připravovat s nosnými látkami, které budou chránit sloučeninu proti rychlému vylučování z těla, jako prostředky s řízeným uvolňováním, včetně implantátů z mikroenkapsulovaných uvolňovacích systémů. Mohou se používat biologicky degradovatelné, biologicky snášenlivé polymery, jako ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná. Způsoby výroby takových prostředků budou zřejmé odborníkovi v oboru. Tyto materiály se také mohou získat na trhu od firem Alza Corporation a Nova Pharmaceuticals, Inc.

Liposomálními suspenzemi mohou být také farmaceuticky přijatelné nosné látky. Ty se mohou připravovat způsoby známými odborníkovi v oboru, viz například US patent č.

522 811. Tak například liposomové prostředky se mohou připravovat rozpuštěním vhodného lipidu nebo vodných lipidů (jako je stearoylfosfatidylethanolamin, stearoylfosfatidylcholin, arachadoylfosfatidylcholin a cholesterol) v anorganickém rozpoštědle, které se potom odpaří a zanechá po sobě tenký film vysušeného lipidu na povrchu zásobníku. Do zásobníku se poté vnese vodný roztok aktivní sloučeniny nebo jejího monofosfátového, difosfátového a/nebo trifosfátového derivátu. Obsah zásobníku se potom rychle rozvíří rukou a dojde k uvolnění volného lipidového materiálu ze stran zásobníku a k dispergování lipidových agregátů, čímž se vytvoří liposomální suspenze.

Modifikace a variace tohoto vynálezu budou zřejmé odborníkovi z oboru z předchozíího podrobného popisu vynálezu. Takové modifikace a variace jsou určeny k zahrnutí do rozsahu připojených patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití derivátu dithiokarbamátu obecného vzorce I

ASCiSlB (I) kde znamená

A atom vodíku nebo farmaceuticky vhodný kat ion,

B skupinu NR²R³, kde znamená

R² a R³ na sobě nezávisle skupinu -íCH0H1níCH3)nOH, kde znamená nO, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6,

-(CH₃)nCO₂A, -(CH2)nC0₂R4, kde znamená

R⁴ skupinu alkylovou, arylovou, alkarylovou nebo aralkylovou, hydroxyalkylovou s 1 aš 6 atomů uhlíku v alkylové skupině nebo podílu, nebo

R² a R³ na sobě nezávisle alkylovou skupinu s 1 aš 10 atomů uhlíku nebo spolu dohromady můstek, pro výrobu léčiva pro ošetřování kardiovaskulárních chorob lidí .
2. Poušití podle nároku 1 derivátu dithiokarbamátu obecného vzorce I vybraného ze souboru zahrnujícího natrium pyrrol idiη-N-thiokarbodithioát, natrium N-methyl-N-karboxymethy1-N-karbodithioát, natrium N-methyl-D-glukamin-N-karbodithioát a natr i um N,N-di i sopropy1 -N-karbodi thi oát.

• ·

- 37
3. Použití podle nároku 1 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce T, kde znamená můstek skupinu -(ΌΗ^)»-, kde znamená m 3 až 6.
4. Použití podle nároku 1 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I

ASCÍS1B kde znamená

A farmaceuticky vhodný kation,

B skupinu NR²R³, kde znamená

R² a R³ na sobě nezávisle skupinu propylovou, isopropylovou, butylovou, isobuty1ovou, terč.-butylovou, pentylovou, cyklopentylovou, isopentylovou nebo hexylovou.
5. Použití derivátu dithiokarbamátů podle nároku 1, kterým je natrium pyrrolidiη-N-di thi okarbamát.
6. Použití podle nároku 1, 3 nebo 4 derivátu dithiokarbamátu obecného vzorce I, přičemž farmaceuticky vhodný kation je vybrán ze souboru zahrnujícího sodík, draslík a skupinu obecného vzorce NR⁴R⁵R⁶R⁷, kde znamená R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ nezávisle na sobě atom vodíku, přímou, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu s až 6 atomy uhlíku, hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž na kterémkoliv atomu uhlíku je alespoň jedna hydroxylová skupina nebo arylovou sku·· ·· • · · * • · · · · • ·

- 38 pinu.
7. Použití podle nároku 1 aě 6 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I pro výrobu léčiva pro ošetřování kardiovaskulárních chorob lidí jako je atberoskleróza.
8. Použití podle nároku 1 až 6 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I pro výrobu léčiva pro ošetřování kardiovaskulárních chorob lidí jako je postangioplastická restenóza.
9. Použití podle nároku 1 až 6 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I pro výrobu léčiva pro ošetřování kardiovaskulárních chorob lidí jako je koronární arteriální choroba.
10. Použití podle nároku 1 až 6 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I pro výrobu léčiva pro ošetřování kardiovaskulárních chorob lidí jako je angína pectoris.
11. Použití podle nároku 1 až 10 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I pro výrobu léčiva pro ošetřování kardiovaskulárních chorob lidí pro podávání v dávce od 0,5 do 500 mg/kg télesné hmotnosti.
12. Použití podle nároku 1 až 10 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce T pro výrobu léčiva pro ošetřování kardiovaskulárních chorob lidí pro podávání perfuzní kanylou, opatře• * • · · ·

- 39 nou balónkem.
13. Použití podle nároku 1 až 12 derivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I pro výrobu léčiva podávaného v kombinaci s farmaceutickým prostředkem ze souboru zahrnujícího prostředek snižující lipidy, inhibitor shlukování krevních destiček, antitrombotický přípravek, b lokátor vápníkových kanálků, angiotensin konvertující enzymový (ACE) inhibitor, betablokátor, nestereoidní proti:aánět 1 ívý prostředek a kortikostero i d.
14. Použití drivátu dithiokarbamátů obecného vzorce I

ASCfSlB kde znamená

A atom vodíku nebo farmaceuticky vhodný kat ion,

B skupinu NR²R³, kde znamená

R² a R³ na sobě nezávisle skupinu -íCH0H1n(CH₂1_n0H, kde znamená η O, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6,

-ÍCH₂l_nCO₂A, -(CH₂l_nCO₂R⁴, kde znamená

R⁴ skupinu alkylovou, arylovou, alkarylovou nebo aralkylovou, hydroxyalkylovou s 1 až 6 atomů uhlíku v alkylové skupině nebo podílu, nebo

R² a R³ na sobě nezávisle alkylovou skupinu s 1 až 10 atomň uhlíku nebo spolu dohromady můstek, • ·· ··· · φ • · · ·· ·· • · · * pro výrobu léčiva pro ošetřování nekardiovaskulárních zánět1 ivých chorob, které jsou zprostředkovány VCAM-1.
15. Použití podle nároku 14 derivátu dithiokarbamátu obecného vzorce I vybraného ze souboru zahrnujícího natrium pyrrolidin-N-thiokarbodithioát, natrium N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát, natrium N-methyl-D-glukali η-N-karbodithioát a natrium N,N-di i sopropyl-N-karhodi thi oát.
16. Použití podle nároku 15 derivátu dithiokarbamátu obecného vzorce T, kterým je natrium pyrrolidiη-N-thiokarbodithioát.

podle nároku 14 derivátu dithiokarbamátu obeckde znamená můstek kde znamená m 3 podle nároku 14 derivátu dithiokarbamátu obecASCí S)B

A f armaceut i cky vhodný kat i on.

B skupinu NR²R³, kde znamená

R² a R³ na sobě nezávisle skupinu propylovou, isopropylovou, butylovou, isobutylovou, terč.-butylovou, pentylovou, cyklopentylovou, isopentylovou nebo hexy 1ovou.
17. Použití nébo vzorce I, až 6.
18. Použ i t i nébo vzorce kde znamená

- 41 • · » <

** • · « ·· ··
19. Použití podle nároku 17 derivátu dithiokarbamátu obecného vzorce I. kterým je natrium pyrrolidin-N-dithiokarbamát.
20. Použití derivátu dithiokarbamátu podle nároku 14, 17 nebo 18 derivátu dithiokarbamátu obecného vzorce I, přičemž farmaceuticky vhodný kation je vybrán ze souboru zahrnujícího sodík, draslík a skupinu obecného vzorce NR⁴R⁵R⁶R⁷, kde znamená R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ nezávisle na sobě atom vodíku, přímou, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu s až 6 atomy uhlíku, hydroxya1kylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž na kterémkoliv atomu uhlíku je alespoň jedna hydroxylová skupina nebo arylovou skupinu.