CZ117699A3 - Slinuté, lehké, teplem rozepnuté granule z jílu pro odstraňování fosforu - Google Patents

Description

Estrogenní činidla

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových 3-[4-(2-fenyl-indol-1ylmethyl)-fenyl]-akrylamidových sloučenin a nových 2-feny1-1-[4-(amino-l-y1-alk-l-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-olových sloučenin, které jsou použitelné jako estrogenní činidla, jakož i farmaceutických kompozic a způsobů léčení, využívajících těchto sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Použití hormonové substituční terapie při prevenci úbytku kostní hmoty u post-menopauzálních žen je dobře známé. Normální protokol uvádí pro estrogenové doplnění použití takových přípravků, které obsahují estron, estriol, ethinylestradiol nebo konjugované estrogeny izolované z přírodních zdrojů (Premarin od Wyeth—Ayerst). U některých pacientů může být terapie kontraindikována proliferativními účinky estrogenů bez protikandidáta (estrogeny nejsou podávány v kombinaci s progestiny) na děložní tkáň. Tato proliferace je spojena se zvýšeným rizikem endometriozní a/nebo endometriální rakoviny. Působení estrogenů bez protikandidáta na tkáň prsu je méně jané, ale je poněkud rakovinotvorné. Potřeba estrogenů, které si mohou udržovat vliv šetření kostního úbytku za minimalizace pro 1 iferativních účinků v děloze a prsu je zřejmá. Určité nesteroidní antiestrogeny byly shledány jako udržující kostní hmotu v modelu ovarektomizovaných krys jakož i v klinických zkouškách na lidech. Tamoxifen například je paliativně vhodný pro léčbu rakoviny prsu. Byl demonstrován že vykazuje vliv podobný vlivu estrogen agonisty na kosti u lidí.

Nicméně je také parciální agenista v děloze a toto je případ hodný zájmu. Baloxifen, benzothiof enový antiestrogen. byl shledán jako stimulující děloZní růst u ovariektomizované krysy v menším rozsahu než tamoxifen při zachováni schopnosti šetřit kosti. Vhodný přehled tkáňově selektivních estrogenů poskytuje: Tissue-Selective Actions Of Estrogen Abalogs, Bone vol.17, č.4, říjen 1995, 181S-190S.

Použití indolů jako estrogen antagonist bylo popsáno von Angererem, Chemical Abstract, vol.99, č.7 (1983), abstrakt č. 53886η. Viz také J.Med.Chem. 1990, 33, 2635-2640; J.Med.Chem. 1987, 30, 131-136. Viz také zveřejněný spis DE 3821148 AI 891228 a WO 96/03375. Dále viz WO, A, 93 23374 (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). Von Angererova práce je omezena na alifatické řetězce připojené k indolovému dusíku a pak připojené k bázickému aminu (nebo amidu) nebo benzylovým skupinám nevykazujícím bázický amin. Světový patent Otsuky (Japonsko) zahrnuje sloučeniny týkající se předloženého vynálezu s výjimkou že R₃ (jak je uvedeno ve vzorci I) je definováno jako -SE, kde R je alkyl. Dále v těchto nejsou žádné řetězce z indolového dusíku se stejnou strukturou jako je uvedena v předloženém vynálezu, bud v nárocích nebo příkladech. Příbuzný patent WO A 93 10741 popisuje 5-hydroxyindoly. WO A 95 1783 (Kar Bio AB) popisuje sloučeniny s alifatickým řetězce.

WO A 95 17383 (Karo Bio AB) popisuje indolové antiestrogeny s dlouhými přímými řetězci. Jiný patent WO A 93 10741 popisuje 5-hydroxyindoly se širokým rozsahem postranních řetězců. WO 93/23374 (Otsuka Pharmaceuticals, Japonsko) popisuje sloučeniny velmi podobné struktury jako mají sloučeniny podle předloženého vynálezu s výjimkou struktury označené jako Rj v předložených vzorcích I a II dale, definované jako thioalkyl a tato práce nepopisuj Za ne sloučeniny, mající řetězce z indolového dusíku, mající stejno strukturu jako mají sloučeniny poskytnuté předloženým vynálezem.

Podstata vynálezu

Sloučeniny obecného struktury typu znázorněného vzorci I a II jsou estrogen agonisté/antagonisté a jsou vhodné p léčení chorob spojených s nedostatkem estrogenu. Sloučeniny podle předloeného vynálezu vykazuji silnou vazbu k estrogen receptoru. Tyto sloučeniny jsou pokládány za antiestrogeny s malou vlastni estrogenici tou . V modelu tri dny ovarektomizované krysy jsou sloučeniny vzrce I schopny antagonizovat účinky 17|3-estradiolu zatímco prokazuji malou déložní stimulaci jsou-li použity samotné.

Předložený vynález zahrnuje sloučeniny vzorců I a II

_Sl je vybrán z H, OH nebo Ct-C. esterů nebo jejich alkyletherů nebo halogenu, Rz , S3 , Ra , Rs a Ci-C4esterú nebo Ci-C6alkylu nebo _St JSOU nezávisle vybrány z H. OH nebo jejich jejich alkyletheru. halogenu, kyano.

trifluormethylu s tou podmínkou, te je-li >

H není R2 OH, n je 2 nebo 3,

X je vybrán z H, Ci-Cealkylu, kyano, nitro, trifluormethylu, halogenu, Z je vybrán z — CH-CH-C—Y nebo __ ^OHajrrY ·

Y je vybrán ze

a) skupiny

R7 Rb kde R7 a Re Ci-Cealkyl, jsou nezávisle vybrány ze skupiny, zahrnující , fenvl nebo dohromady -(CH₂)_P-, kde Ρ je cele . _Ί ,_n z _takže tvoří kruh, kruh je popřípadě říqlo od 2 do o, taxze substituován aZ trém, substjtuenty vybranými ze skupiny, zahrnující vodík, hydroxyl, halogen, C-C.akyl, trihalogenmethyl, Q-Czalkoxy. trihalogenmethoxy n-b' Cí-Cáalkylsulfinyl, Ci-O^alky!suli ony , Ci-C4alkylthio, Ci-Ciaikyisun j víCí-C4jalkyl -CO2H, ~CN, -CONH(Ci C4) , NH3 .

hydroxylC C,)al y ’ -NHCOtC.-C.)alky 1 a -NOz,

Ci-C4alkylammo , Ci-C4diaiKyiamn oěti- šesti- nebo sedmičlenného nasyceného, nenasyceného ^P ’ ého heterocyklu, obsahujícího až dva nebo částečně nenasyceného heterocyki heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující -0-, -NH-,

-N(d-Cialkyl) , -N= a -S(0).-, kde m je cele číslo od do 2, popřípadě substituovaný 1 at 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující vodík, hydroxyl, halogen Ci-Cialkyl, trihalogenmethyl. C-C.alkoxy, trihalogenmethoxy, Ci-dacyloxy. Ci-C«alkylthio, Ci-C»alkylsulf myl, Ci-dalkylsulfonyl , hydroxy(d-C,)alkyl , fenyl aí 3 (Ci-Ci)alkylskupinami, -COzH , CN , CONH i , z .

! Hi re,-Cdlalkylamino , -NHSO2R1-, -NHCOR1-, (C1-C4) alkylamino , di(Ci Ujauyiduin

-NO 2-;

cl bicyklického kruhového systému, zahrnujícího pěti- nebo šestičlenný heterocyklický kruh kondenzovaný k fenylovemu kruhu, ke uvedený heterocyklický kruh obsahuje at dva heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující 0 , NH . -N(Ci-dalkyl)- a -S(0)kde m je celé číslo od 0 do 2. popřípadě substituovaného 1 at 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující vodík, hydroxyl, halogen, C,-C.alkyl, trihalogenmethyl. d-dalkoxy. trihalogenmethoxy. Ci-C.acyloxy, Ci-dalky 1 thi o , Ci-dalkylsulf myl , d-dalkylsulfonyl. hydroxy (Ci-C.) alky 1 , fenyl substituovaný at 3 (Ci-d) alky 1 skupinami. -CO2H-, -CN-, -CONHS1 , NH2 , (Ci-Ci)alky lamino, di(Cl-C<)alky lamino . -NHSO2B1-. -NHCOBi ,

-NO2-;

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Kruhy vytvořené spojením R₇ a Re uvedené výše mohou zahrnovat, ale nejsou tak omezeny, aziridin, azetidin, pyrrolidin, piperidin nebo hexamethylenaminový kruh.

Dále výhodné, když R₇ a Rs jsou vzájemně spojeny jako -(CH₂)p-, takto vytvořený kruh je popřípadě substituován 1 až substituenty vybraným: ze skupiny, zahrnuj ici Ci-Ciálkyl , trifluormethy1, halogen, vodík, íenyl, nitro, preferovány ty, ktere mají strukturní vzor .

výše, kde Ri je OH: Hz- Rs mají výše definovaný vybrán ze skupiny, zahrnu:lei Cl, NOz, C_N, CHi nebo CHz, je skupina

N *8 a Hz a Rs jsou spolu vzájemně spojeny a znamenají -(CHz),-, _kde _{p je} celé číslo od 4 do 6. za vnuku kruhu WP* substituovaného až třemi substituenty vybranými zahrnující vodík, hydroxyl. halogen. C.-C.alkyl, trihalogenmethyl. C.-C.alkoxy.trihalogenmethoxy, Ci-Cíalkylthio, Ci-C»alkylsulfmyl, _

Ci-C,alky 1 sulfony 1 , hydroxyCCi-C.lalkyl , -C z · ‘ .

-CONH(Ci-C.)alkyl. -NHi, (C,-Ci)alky lamino, dí(C, -NHSOz(Cí-C.), -NHCO(C,-C.)alky 1 a -NOz a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Vynález zahrnuje Přuatelné solí vytvořené adiční reakci _s bud anorganickými nebo organickými kyselinami. Jsou vhod anorganické kyseliny iako je kyselina chlorovodík» bromovodíková, kyselina jodovodíková, kyselina kvselina fosforečná, kyselina dusičná, tak organic e kyseliny jako je kyselina octová, kyselina propionová, ^kyse‘^ina citrónová, kyselina maleinová. kyselina lablečná, kyselina vinná, kyselina ftalová. kyseltna jantarová, kyselina methansulfonová, kyselina toluensulfonova, kyselina naftalensulfonová, kyselina kafrsulfonová, kyselina benzensulfonová. Je známo, že sloučeniny, obsahující bázicky dusík mohou být komplexovány s mnoha různými kyselinami (jak protickými tak neprotickými) a obvykle je preferováno podávat sloučeninu podle vynálezu ve formě adiční sole s kyselinami.

Sloučeniny podle vynálezu jsou parciální estrogen agonisté a vykazují vysokou afinitu k estrogen receptoru. Na rozdíl od mnoha estrogenú nepůsobí tyto sloučeniny zvýšeni vlhké hmotnosti dělohy. Tyto sloučeniny jsou anti estrogenm v děloze a mohou plně antagonizovat trofické účinky estrogen agonistů ve tkáni dělohy. Tyto sloučeniny jsou vhodné pro léčení neboprevenci savčích chorobných stavů nebo syndromů, které jsou způsobeny nebo spojeny s deficiencí estrogenú.

Předložené sloučeniny mají schopnost se chovat podobné jako estrogen agonisté při snižování cholesterolu a bránění kostní ztráty. Proto jsou tyto sloučeniny vhodné pro lečem mnoha chorob, zahrnujících osteoporosu, prostatickou hypertrofii, infertilitu, rakovinu prsu, endometriální rakovinu.kardiovaskulární choroby, antikoncepci, Alzheimerovu chorobu a melanom. Dále mohou být tyto sloučeniny použity pro hormonovou substituční terapii u post-menopauzálních žen nebo jiné estrogen deficientní stavy, kde by doplnění estrogenú mohlo být přínosem.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být také použity v metodách léčení kostního úbytku, který může vznikat u jednotlivce z nerovnováhy ve tvorbě nové kostní tkáně a resorpce starších tkání, vedoucí k čistému úbytku kosti. Taková kostní deplece vzniká v okruhu jednotlivců, zejména u post-menopauzálních žen, žen, které byly podrobeny hvsterektomii, u těch, které dostávaly nebo se očekává, že hysterekiomi s gonadálni dysgenezi budou dostávat kortikosteroidm terapie, a u těch, které jsou postiženy Cushingovým syndromem. Speciální potřeba kostního doplnění může být také směrována o im těchto sloučenin k jednotlivcům s kostními rakturamr, defektními kostními strukturami a těm. kteří byli podrobeni kostní chirurgii a/nebo implantaci protézy. Navíc výše popsaným potížím mohou tyto sloučeniny být použity při léčeních osteoartritidy, Pagetovy choroby, osteomalacie, , friální rakoviny, mnohotného myelomu osteohalisterezy, endometrlalni rakoviny, a jiných forem rakoviny, majících škodlivý vliv na kostní tkáně. Metody léčení chorob zde uvedených zahrnuji podaní jednotlivci v případě potřeby takového léčeni, íarmaceutic účinného množství jedné nebo více sloučenin podle tohoto vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli. Tento vynález také zahrnuje farmaceutické kompozice, využivajicrc jednu nebo více sloučenin podle předloženého vynálezu a/nebo, jejich farmaceuticky přijatelných solí, společně s jod,..... ......

více farmaceuticky přijatelnými nosiči, přísadami atd.

Je třeba vzít na vědomi, že dávka, režim a způsob podáni těchto sloučenin se budou měnit podle léčené nemoci a individuálního léčeného stavu a budou zcela v rozhodnutí ošetřujícího lékaře.

Je preferováno, že podání jedné nebo více sloučenin začíná v nízké dávce a zvyšuje požadovaného účinku.

se až do dosažení

Účinné podání těchto sloučenin může být dosaženo dávkou od asi 0.1 mg/den do as> 1000 mg/dem. Výhodně bude podana od asi 50 mg/den do asi 600 mg/den v jediné dávce nebo ve dvou nebo více rozdělených dávkách. Takové dávky budou podávány jakýmkoliv způsobem vhodným při směrování účinných sloučenin do příjemcova krevního proudu, zahrnujícím orální, parenterální (zahrnující intravenozní, intraperitoneálni a subkutánní injekce) a transdermální způsob podání. Pro účel tohoto popisu se trasdermálním podáním rozumívšechna podáni přes povrch těla a vnitřní výstelky tělesných části, zahrnujících epitheliální a mukosální tkáně. Taková podání mohou být provedena za použití předložených sloučenin nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, v lotionech, krémech, pěnách, náplastích, suspenzích, roztocích a cípcích (rektálních a vaginálních).

Orální formulace, obsahující aktivní sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být v jakýchkoliv obvykle používaných orálních formách, zahrnujících tablety, kapsle, bukální formy, trocheje, lozengy a orální kapaliny, suspenze nebo roztoky. Kapsle mohou obsahovat směsi aktivní s 1 oučemny (ni n) s inertními plnivy a/nebo ředidly jako jsou farmaceuticky přijatelné škroby (např. kukuřičný, bramborový nebo tapiokový škrob), cukry, umělá sladící činidla, práškované celulózy jako jsou krystalické a mikrokrystalické celulózy, moučky, želatiny, gumy atd. Vhodné tabletové formulace mohou být vyrobeny běžným slisováním, metodami mokré granulace nebo suché granulace a za použití farmaceuticky přijatelných ředidel, pojiv, lubrikantů, dezintegrantů, suspendačních nebo stabilizačních činidel, zahrnujících, ale neomezených takto, stearát horečnatý, kyselinu stearovou, talek, laurylsulfát sodný, mikrokrystalickou celulózu, vápenatou karboxymethylcelulozu, polyvinyIpyrro1idon, želatinu, kyselinu alginovou, akaciovou gumu, xanthanovou gumu, citrát sodný, komplexní silikáty, uhličitan vápenatý, glycin, dextrin, sacharozu, sorbitol, fosforečnan dvojvápenatý, síran vápenatý, laktozu, kaolin, mannitol, chlorid sodný, talek, suché škroby a práškovaný cukr. Orální formulace mohou využívat standardní uvolnění nebo to mohou být přípravky uvolňující s casern pro úpravu absorpce aktivní sloučeeniný(nin). CíPkové formulace mohou být vyrobeny ze tradičních materiálů, zahrnujících kakaové máslo, s nebo bez přídavku vosků pro úpravu teploty táni čípků a glycerin. Ve vodě rozpustné čípkove baze, jako JSOU polyethylenglykoly různých molekulových hmotnosti, mohou být také použity.

Sloučeniny podle předloženého svntetizovány obecně podle schémat vynálezu mohou být a 2 uvedených dále.

Počátek indolové syntézy podle schema 1 se provede zahříváním vhodně substituovaného anilinu (1) se vhodné substituovaným alfa-bromfenyIpropriofenonem (2) ve vhodném

1 vysokovroucím rozpouštědle jako je DMF. Produkt se pak alkyluje se 4-brombenzyIbromidem za získání substituovaného indolu (3). V tomto bodě se provádí deprotekce fenolu (je-li Přítomna chránící skupina). Normálně jsou fenoly chráněny iako benzylethery a mohou být běžně štěpeny pomocí TMS1. Akrylami y jsou kondenzovány za použití podmínek Heckovy reakce bud v čistém EtiN nebo EtjN/CHsCN.

Schema 2

Počátek indolové syntézy podle schema 2 může být proveden zahříváním vhodně substituovaného anilinu (1) se vhodně substituovaným alfa-bromfenylalkyl-fenonem (2) ve vhodném vysokovroucím rozpouštědle jako je DMF. produkt se pak alkyluje se 4-jodbenzyIbromidem za získání substituovaného indolu (3). V tomto bodě je provádí deprotekce fenolu (je-li přítomna chránící skupina). Normálně jsou fenoly chráněny jako benzylethery a mohou být vhodně štěpeny pomocí TMSI. Propargylaminy mohou pak být kondenzovány k fenyljodidu. Propargylaminy jsou typicky připraveny z alkinyIbromidu nebo alkinyltosylátu substitucí se vhodným aminem. Substituční reakce probíhá in situ, bez izolace propargyl aminu. Sloučeniny substituované v poloze 3 se skupinami jinými než alkyl mohou být připraveny nejprve připravením indolu substituovaného v poloze 3 -H. Indol pak může být elektrofilně halogenován, formylován atd. za získání jiných 3-substituovaných sloučenin.

Rozpouštědla použitá zde pro reakce jsou bezvodá Aldrich Sure Seal™ bez dalšího čištění. Činidla jsou typicky Aldrich a použitá bez dalšího čištění. Všechny reakce se provádějí pod atmosférou dusíku. Chromatografie se provádí za použití silikagelu 230 až 400 mesh (Merck Grade 60, Aldrich Chemical Company). Chromatografie na tenké vrstvě se provádí pomocí Silica Gel F254 ploten od EM Science. NMR spektra byla získána na přístroji Bruker AM—400 v DMSO a chemické posuny jsou uváděny v ppm. Teploty tání byly stanoveny na přístroji Thomas-Hoover a jsou nekorigovány. IR spektra byla zaznamenána na Perkin-Elmer difrakčních mřížkových nebo Perkin-Elmer 784 spektrofotometrech. Hotová spektra byla zaznamenána na spektrometrech Kratos MS 50 nebo Finnigan 8230. Elementární analýzy byly získány s Perkin-Elmer 2400 elementárním analyzátorem. Hodnoty analýzy jsou v 0,4 % teorie.

Předložený vynález je dále ilustrován následujícími neomezujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

5-Benzyloxy-2-(4-benzyloxy-feny1)-3-methy1-IH-indo1

Baňka se naplní 4-benzyloxyani1inem (45 g, 0,23 mol), 4'-benzy1oxy-2-bromfenyIpropiofenonem (21 g, 0,066 mol) a DMF (50 ml). Reakční směs se zahřívá pod refluxem 30 min a pak se ochladí na teplotu místnosti a pak se rozdělí mezi EtOAc (250 ml) a IN HC1 (vod.) (100 ml). EtOAc se promyje NaHCOs (vod.) a solankou, suší se nad MgSO«. Roztok se zahusti a zbytek se vyjme do CH2CI2 a hexany se přidají pro vysrážení 25 g surové pevné látky. Pevná látka se rozpustí v CH2CI2 a odpaří a chromatografuje na silikagelu za použití CH2CI2/hexanu (1:5) a získá se 9,2 g rezavé pevné látky (33 %): t.t. 150 až 152 °C. ^!H NMR (DMSO) 10,88 (s, 1H), 7,56 (d, 2H, J= 8,8 z), 7,48 (d, 4H, J= 7,9 Hz), 7,42- 7,29 (m, 6H), 7,21 (d. 1H, J= 7,0 Hz), 7.13 (d, 2H, J= 8,8 Hz), 7,08 (d, 1H, J= 2,2 Hz), 6.94 (dd, 1H, J= 8,8, 2,4 Hz), 5,16 (s, 2H), 5,11 )s, 2H), 2,33 (s, 3H); IR (KBr) 3470, 2880, 2820. 1620 crn’i; MS el m/z 419.

Příklad 2

5-Benzy1oxy-2-(4-fluor-fenyl)-3-methy 1-1H-indo1

Titulní sloučenina se připraví podobně jako (3): t.t.= 132 °C; 1H NMR (DMSO) 11.0 (s, 1 H), 7.68-7.64 (m, 2 H), 7.49-7.47 (m, 2 H), 7.41-7.31 (m, 5 H),

7.23 (d, 1 H, J = 8.8 Hz), 7.10 (d, 1 H, J = 2.4 Hz), 6.82 (dd, 1 H, J = 8.8, 2.4 Hz), 5.11 (s, 2 H), 2.34 (s, 3 H); MS EI m/z 331;

CHN vypočteno pro C22H18FNO.

Příklad 3

Benzyloxy-2-(4-benzy1oxy-feny1)-3-methyl)-1-y1 me thy 1-(4f enyIbromid)-indo 1

Roztok 60% NaH (0,17 g, 7,1 mmol) v DMF (20 ml) se ochladí na 0 ⁰C a zpracje se po kapkách s přídavkem benzyloxyindolu 1 (2,5 g, 5,94 mmol) v DMF (10 ml). Po 15 min se přikape 4'-brombenzy1bromid (1,63 g, 6,53 mmol) v DMF (10 ml). Reakční směs se míchá 5 min při 0 °C a pak při teplotě místnosti dalších 20 min. Reakční směs se zředí etherem (300 ml) a promyje se NH4CI (2 x 25 ml), potom NaHCCh (1 x 25 ml) a solankou (25 ml). Organické extrakty se suší nad MgSOz, a zahustí. Zbytek se krystaluje z THF/hexanú za získání 2,7 g 177 %) 2: t.t. 144 až 146 °C;

ím Sttl 7 (a λ t, ^{H WR (CDC1}3) 7.51-7.36 ( . 8 H), 7.34 (d, 4 H, J = 8.6 Hz), 7.20 (d, 2 H, J = 8.8 Hz), 7.15 (d. 1 H J = 2 4 Hz), 7.03-7.00 (_m, 3 H), 6.89 (dd, 1 H, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.80 (d, 2 H J - 8 6 Hz) Xs ™' ^{2 H)}' ^{5O9 (S}' ^{2 H)}· ²·^{25 <S}· ^{3 H); IR (KBr}> ™

Příklad 4

5-Benzy1oxy-2-(4-fluor-f eny1)-3-methy1)-1-yImethy1-(4-feny1bromid)-indol

Titulní sloučenina se připraví podobně jako sloučenina 5.

T.t. 139 až 139,5 °C:

1H NMR (DMSO) 7.49-7.46 (m, 2 H), 7.41-7.37 (m, 6 H), 7.33-7.27 (m, 4 H), 7.24 (d IH.J. 8.8 Hz), 7.16 (d, 1 H, J = 2.2 Hz), 6.84 (dd, 1 H, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.73 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 5.2 (s, 2 H), 5.12 (s, 2 H), 2.15 (s, 3 H); IR (KBr) 2920, 1630 cm-i; MS el m/z (499/501, Br přítomen); CRN vypočteno pro

C29H2 sBrFNO.

Příklad 5

2-(4-Hydroxyfeny1)-3-methyl)-l-yImethy1-(4-fenyIbromid)indol-5-o1

Roztok, obsahující 5 (0,5 g, 0,85 mmol) v CH2CI2 (10 ml) se zpracuje přídavkem po kapkách 3,5 ekv TMSI (0,47 ml, 3,0 mmol) při teplotě místnosti.? pár hodinách se reakce ukončí tak, že se přidají další 2,2 ekv. TMSI a reakční směs se zahřívá pod refluxem 5 h. Reakce se ochladí na 0 Ca pro přerušení reakce se přidá pomalu methanol. Reakce se zředí etherem (25 ml) a promyje se NaHCCh (25 ml), 10% Na2SO3 (25 ml) a solankou. Etherová vrstva se suší nad síranem hořečnatým a zahustí a nanese na silikagel. Chromatograf1í s EtOAc/hexany (1:4 až 1:1) se získá 0,25 g 3 (71 %): t.t. 83 až 86 C, ^lH NMR (CDCI3) 2 H z fenolu široký (> 10), s 7,35 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,15 (d, 2H, J= 8,8 Hz), 7,01 (dd, 1H, J= 2,4, 0,4 z), 6,86 (d, 2H, J= 8,8 Hz), 6,80 (d, 1H, J= 8,6 Hz), 6,72 (dd, 1H, J= 8,6, 2,4 Hz), 5,10 (s, 2H), 4,88 (s, 1H), 4,50 (s, 1H), 2,21 )s, 3H); MS el m/z 407/409 obsahuje Br; IR 3390, 2900, 1600 cm^-1; CHN vypočteno pro C22HisBrNO2 + 25 EtOAc.

Příklad 6

2-(4-Fluor-fenyl)-3-methyl)-l-ylmethyl-(4-fenylbromid)indol-5-ol

Titulní sloučenina se připraví podobně jako sloučenina 7 a izoluje se jako pěna. iR NMR (DMSO) 8,79 (s, 1H) , 7,39-7,34 (m, 4H), 7,32-7,30 (m, 3H), 7,11 )d, 1H, J= 8,8 Hz), 6,85 (d, 1H, J= 2,2 Hz), 6,74 (d, 1H, J= 2,4 Hz), 6,63 (dd. 1H, J= 8,6, 2,2 Hz), 5,16 (s, 2H) . 2,11 (s. 3H); IR (KBr) 3400, 2900, 1630 cm-¹; MS el m/z 409/411 obsahuje Br.

Obecný postup pro indol akrylamidyRoztok z příkladu 3 v EtsN se zpracuje se tri-o-tolylfosfonem (10 % mol), a akrylamidem (1.25 ekv.). profoukne se N2 a přidá se Pd(OAc)2 (2,5 % mol). Reakční směs se zahřívá na 100 až 110 °C v zatavené trubce až podle TLC je reakce úplná. Surový reakční produkt se zahustí a bud přímo krystaluje nebo se chromatografuje na silikagelu.

Příklad 7 (E)-N,N-Diethyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)indol-l-ylmethyl]-feny1}-akry 1 amid

T.t. 160 až 1 65 ⁰ C; 1_H NMR 9.67 (s, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 7.50 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 7.37 (d, 1 H, J = 15.4 Hz), 7.17 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.06 (d, 1 Η, I = 8.8 Hz), 6.97 (d, 2 H, J = 15.4 Hz), 6.86-6.82 (m, 5 H), 6.58 (dd, 1 H, J = 8.6, 2.2 Hz), 5.19 (br s, 2 H), 3.47-3.42 (m, 2 H), 3.34-3.30 (m, 2 H), 2.09 (s, 3 H), 1.10 (t, 3 H, J = 7.0 Hz), 1.03 (t, 3 H, J = 7.0 Hz); IR (KBr) 3300, 2950, 1660, 1580 cm'¹;

MS(el) m/z 454; CHN vypočteno pro C29H30N2O3+O>15 CH2C12+0,30

H2O

Příklad 8 (_E)__N__terc.Butyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-f eny Dimethyl)-indol-1-ylmethyl]-feny l}-akrylamid

T.t.= 168 až 170 °C; 'h NMR 9.66 (s, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 7.66 (s, 1 H), 7.34 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.24 (d, 1 H, J = 15.8 Hz), 7.15 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.05 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 6.85-6.82 (m, 5 H), 6.59-6.56 (m, 1 H), 6.55 (d, 1 H, J = 16.0 Hz), 5.18 (s, 2 H), 2.11 (s, 3 H), 1.28 (s, 9 H); IR (KBr) 3350, 2950, 1660, 1620; MS (el) m/z; CHN vypočteno pro C29H30N2O3+O,4 H2O

Příklad 9 (E)-Pyrro1idino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-feny1)^-3-methy 1)~ indo1-1-yImethy 1]-fenyl}-akry 1 amid

T. t . = 170 až 175 °C; ’h NMR 9.67 (s, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 7.49 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 7.35 (d, 1 H, J = 15.4 Hz), 7.16 (d, 2 H, J = 8.6 Hz), 7.05 (d, 1H, J = 8.8 Hz)’ 6.88-6.81 (m. 6 H), 6.57 (dd, 1 H, J = 8.6, 2.2 Hz), 5.19 (br s, 2 H), 3.56 (t, 2 H, J = 6.6 Hz), 3.35 (m, 2 H), 2.11 (s, 3 H), 1.87 (p, 2 H, J = 7.0 Hz). 1.77 (p, 2

H, J=7,0 Hz); MS m/z 452; CHN vypočteno pro C29H28N2O3+O,1

MeOH+1.3H2O.

Příklad 10 (E)-N,N-Dimethy1-3-(4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy fenyl) 3 me thy 1)-indol-l-ylmethyl)-fenyl}-akrylamid

T.t.=278 aZ 280 ”ϋ;.Η^(ΠΜ50)9.65(ΜΗ).870^1Μ(ΟΗ.

, . 3Λ Hz). 7.33 (d. ) H. 3 - 8.6, 2.4

15.6 Hz), 7.05 (d, 1H.J - 8.8 Hz & _{3 MS 426;} ir

Hz), 5.19 (s, 2 H). 3.09 (s, 3 H), 2.88 (s. 3 H), ₍K_Br) 3410, 3220, 1650, 1580 cm'> ; CHN vypočteno pro C27H26N203+0,5 H2O.

Příklad 11 (E)-N,N-Dibuty1-3-(4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-feny1)-3®e thy 1)-indo 1-1-y Imethyl)-f eny 1 )-akry lamid

„...i j = 8.3 Hz), 7.36 (d, 1 H, J- 15- ^H ’ · s 6 57 (dd, 1 H, J = 8.8, 2.4 8.6 Hz), 6.97 (d, 1 H J = ¹⁵² θ(t, _{2R } = 7}._{2 H}z), 2.11 (S, 3 Hz), 5.19 (s, 2 H), 3.39 (t, 2 , ’

H), 1.48-1.43 (M, 4 H), 1.29-1.20 (M, 4 H), 0.87 (t, 6 H. J

510; IR (KBr) 3300, 2920. 2900, 2850, 1650, 1625. 1580 cm' : CHN vypočteno pro C33H38N2O3.

Příklad 12 (E)-N-Butyl. N’-methyl-3-(4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)3-methyl)-indol-l-yImethyl]-feny1}-akry1amid

T.t.= 240 aZ 242 ’ C; Ή NMR (DMSO)9.66 (s, 1 H), 8.70 (S.1H). 7.5 (. .

J = 8 1 Hz), 7.38-7.32 (m, ! H), 7.)6 (d, 2 Η, I = 6.8 Hz), <m, 2 H)

85-6.81 (m, 5 H), 6.57 (dd. 1 H, J = 8.6, 2.2 Hz), 5.19 (s, 2 H), 3.44, 3.3a (2

H. , .7.2HZ), 3.06. 2.87 <2 s. 3 H),

7.5 Hz), 0.87 (t, 3 H, J = 7.2 Hz); Ms =1 m/z 468, IR (KBr)

CHN vypočteno pro C3oH32N2O3+O,2 H2O

Příklad 13 (E)-Morfolino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl)indol-l-ylmethyl]-feny 1}-akry lamíd

T.t.=165 až 167 ^CC; 'h NMR (DMSO) 9.66 (s, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 7.52 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 7.39 (d, 1 H, J = 15.4 Hz), 7.15 (d, 2 H, J = 8.6 Hz), 7.12 (d, 1 H, J = 15.4 Hz), 7.06 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 6.85-6.81 (m, 5 H), 6.57 (dd, 1 H, J = 8.6, 2.2 Hz), 5.19 (s, 2 H), 3.65-3.64 (m, 2 H), 3.59-3.53 (m, 6 H), 2.11 (s, 3 H); IR (KBr) 3330, 1650, 1620, 1580 cm-1; MS (FAB) m/z 469 (M+H⁺); ~

CHN vypočteno pro C29H28N2O4 + 0,5 H2O.

Příklad 14 (E)-3-{4-[5-Hydroxy-2-(4-hydroxy-f eny1)-3-methy1)indol-l-yImethyl]-feny1}-akrylamíd

T.t.= 161 až 163 °C, ^lH NMR (DMSO) 9.65 (s, 1 H), 8.70 (s, 1 H), 7.48 (s, 1 H), 7.37 (d, 2 H, J = 8.35 Hz), 7.30 (d, 1H, J= 15.8 Hz), 7.14 (d, 2 H, J = 8.35 Hz), 7.04 (d, 2 H, J = 8.6 Hz), 6.85-6.81 (m, 5 H), 6.57 (dd, 1 H, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.48 (d, 1 H, J = 15.8 Hz), 5.18 (s, 2 H), 2.10 (s, 3 H); IR (KBr) 3320, 3180, 1660, 1580 cm-¹; MS(FAB) m/z 399 (M+H)⁺; CHN vypočteno pro C25H22N2O3+

1,1 H2O.

Příklad 15 (E)-N-Methy1-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-feny1)-3-methy1) indo1-1-ylmethyl]-feny1}-akry lamid

T.t. 155 až 158 °C; ^lH NMR (DMSO) 9.64 (s, 1 H), 8.70 (s, 1 H), 7.99 (q, 1H,

J = 4.4 Hz), 7.37 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.30 (d, 1 H, j = 15.8 Hz), 7.14 (d, 2 H, J=

8.6 Hz), 7.03 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 6.85-6.81 (m, 5 H), 6.57 (dd, 1 H, J = 8.6, 2.4 Hz), 6.48 (d, 1 H, J = 15.8 Hz), 5.18 (s, 2 H), 2.66 (d, 3 H, J = 4.6 Hz),H); IP (KBr) 3400, 1660. 1620 cm¹; MS el m/z 412; CHN vypočteno pro C26H24N2O3 + 0,4 H2O.

Příklad 16 (E)-N,N-Dibutyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-fluor-fenyl)-3-methyl)indo1-1-ylmethyl]-fenyl}-akry lamid

T.t.= 180 °C; 'h NMR (DMSO) 8.77 (s, 1 H), 7.48 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 7.417.38 (m, 3 H), 7.38-7.29 (m, 3 H), 7.13 (d, 1 H, J = 8.8 Hz), 6.97 (d, 1 H, J = 15.4 Hz), 6.85 (d, 1 H, J = 2.4 Hz), 6.80 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 5.2 (s, 2 H), 3.40-3.36 (m, 2 H), 3.30-3.27 (m, 2 H), 2.10 (s, 3 H), 1.50-1.40 (m, 4 H), 1.29-1.21 (m, 4 H), 0.86 (t, 6 H, J = 7.2 Hz); IR (KBr) 3180, 2950, 2900, 2850, 1650, 1590 cm'¹;

MS el m/z 512; CHN vypočteno pro C33H37N2O2.

Příklad 17 (E)-N-Butyl,N'-methyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-fluor-fenyl)-3methyl)-indol-1-ylmethyl]-fenyl}-akry lamid

T. t.=153 až 153,5 °C; 'h NMR (DMSO) 8.77 (s, 1 H), 7.50 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 7.42-7.36 (m, 2 H), 7.35-7.28 (m, 3 H), 7.13 (d, 1 H, J = 8.8 Hz), 7.03 (dd, 1 H, J = 15.4, 2.6 Hz), 6.84 (d, 1 H, J = 2.4 Hz), 6.80 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 6.62 (dd, 1 H, J = 8.8, 2.4 Hz), 5.21 (s, 2 H), 3.44, 3.41 (2 t, 2 H, J = 7.0 Hz), 3.06, 2.87 (2 s, 3 H) 2.10 (s, 3 H), 1.49-1.42 (m, 2 H), 1.27-1.20 (m, 2 H), 0.86 (t, 3 H); IR (KBr)

3300, 2950, 2860, 1645, 1580 cm^-1; MS el m/z 470; CHN vypočteno pro C30H31FN2O2·

Příklad 18

5-Benzy1oxy-2-(4-benzy1oxy-f eny1)-3-methy1-1H-indol

Do baňky se umístí 4-benzyloxyani1 in (45 g, 0,23 mol), 4'-benzy1oxy-2-bromfeny1 propiofenon (21 g, 0,066 mol) a DMF (50 ml) . Reakční směs se zahřívá pod ref luxem 30 minut a pak ochladí na teplotu místnosti a pak se rozdělí mezi EtOAc (250 ml) a IN HC1 (vod.) (100 ml). EtOAc se promyje NaHCO3 (vod.) a solankou, suší se nad MgSOá. Roztok se zahustí a zbytek se vyjme do CH2CI2 a přidají se hexany pro vysrážení 25 g surové pevné látky. Pevná látka se rozpustí v CH2CI2 a odpaří, nanese na silikagel a chromatografuje za použití

CH2CI2/hexanu (1:5) a získá se 9,2 g rezavohnědé pevné látky (33 %) : t.t. 150 až 152 °C; ’H NMR (DMSO) 10.88 (s, 1 H), 7.56 (d, 2 H, J = 8.8 Hz), 7.48 (d, 4 H, J = 7.9 Hz), 7.427.29 (m. 6 H), 7.21 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.13 (d, 2 H, J = 8.8 Hz), 7.08 (d, 1H.J2.2 Hz), 6.94 (dd, 1 H, 1 = 8.8, 2.4 Hz), 5.16 (s, 2 H), 5.11 (s, 2 H), 2.33 (s, 3 H); IR (KBr) 3470, 2880, 2820, 1620 cm’¹; MS el m/z 419.

Příklad 19

5-Benzy1oxy-2-(4-benzy1oxy-f eny1)-3-methy1)-1-y1methyl (4fenyljodid)-indol

Roztok 4 (3,0 g 7,4 mmo1) v DMF (25 ml) se zpracuje s NaH (60% disperze, 0.21 g. 8,9 mmol) a míchá se při teplotě místnosti 15 minut. Přidá se 4-jodbrombenzyIbromid (2,2 g, 7,4 mmol) a reakce se míchá 1 hodinu. Reakční směs se nalije do vody a extrahuje se EtOAc, suší se nad MgSCU a zahustí se. Triturací surového produktu s etherem se získá 2,2 g produktu jako bílé pevné látky: t.t. 153 až 156 °C;

’H NMR (DMSO) 7.54 (d, 2 H, J - 8.6

2.15 (s, 3 H); MS el m/z 635.

Příklad 20

3—(4—Hydroxyfeny1)^—3—methy1)~1~yImethy1 (4 fenyljodid) indol-5-ol

Roztok 4 (2,2 g, 3,5 mmol) v CHCls se zpracuje s jodtrimethy 1si 1anem (1,04 ml, 7,0 mmol) a reakce se zahřívá pod refluxem. Po 2 hodinách se přidají další 3 ekv.

jodtrimethy1si lanu a reakce se míchá při teplotě místnosti 18 h. Reakce se přeruší přídavkem MeOH (5 ml). Organická vrstva se promyje vodným 10% roztokem NaaSOs, HC1 (1M) a suší se nad MgSOz. . Roztok se zahustí s chromatograf u j e se na silikagelu s EtOAc/hexanem (3:7), získá se 4a jako pěna (1,2 g):

1H NMR 9,65 (s, 1H), 8,71 )s, 1H), 7,54 (d, 2H, J o 3 Hz) 7 12 (d 2 H, J = 8.3 Hz), 7.02 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 6.84-6.80 (m, 3 H), 6.61 (d, 2 H. J = 83 Hz), 6.57 (dd, 1 H, J = 6.4 Hz), 5.12 (s. 2 H), 2.09 (s, 3 H);

MS el m/z 455.

Obecný postup pro přípravu indoIpropary1 aminu

Titulní sloučeniny z příkladu 21 až 23 se připraví za použití roztoku, obsahujícího 10 násobný molární přebytek sekundárního aminu v DME ochlazeného na 0 ⁰C a zpracováním s propargy1bromidem (3 ekv., 80% roztok v toluenu). Po 1 h při 0 °C se reakční směsi nechají ohřát na teplotu místnosti na 1 hodinu. Pak se přidá indoljodid (4a, 1 ekv.) následovaný Cul (0,1 ekv.) a Pd(pPh₃)2Cl₂ (0,035 ekv.). Reakční směs se pak míchá 16 až 48 hodin a zpracuje se nalitím do vody a extrakci do EtOAc. EtOAc se zahustí s chromatografuje se na silikagelu za použití EtOAc/hexanu jako elučního systému.

Příklad 21

2-(4-Hydroxy-fenyl)-3-methyl-l-[4-(3-N,N-dimethyl-l-ylprop-1-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-ol

T.t.=173 až 176

C > 'H NMR (DMSO) 9.64 (s, 1 H), 8.70 (s, 1 H), 7.25 (d, 2 H, = 8.3 Hz), 7.03 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 6.83-6.78 (m, 5 ffi.t^dUHJ 8Λ 2.4 Hz), 5.17 (s, 2 H). 1» (». 2 H). 2.19 (s, 6 H), 2.10 (s, 3 H); IR (KBr) 3390, 1490 cm’’; MS esl 411 (M+H⁺).

Příklad 22

2-(4-Hydroxy-fenyl)-3-methyl-l-(4-(3-piperidin-l-yl prop-1-iny1)benzyl]-lH-indol-5-o1 t t - 118 až 1’3 · C;’H NMR (DMSO) 9.65 (s, 1H), 8.71 (s,lH), 7.24 (d. 2 H, / 1 H 7 ; (d. 2 Η, 1 . 8.6 Hz), 7.02 (d, 1 Η. 1 . 8.6 Hz), 6.83-6.80 (m, 5 j s 0.1 ηζ-Λ '·^{χ χ} _o -λ _r , TU) 2H), 2.41 (m, 4 H), 2.10

1420 cm-i; MS El m/z 450; CHN vypočteno pro C₃0H30N2O2+O,25

H2O

Příklad 23

2-(4-Hydroxy-fenyl)-3-methyl-l-[4-(3-pyrrolidin-l-yl _prop-l-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-ol (5c)

T.t.=174 až 1 76 ⁰ C; jr NMR (DMSO) 9.64 (s, 1 H), 8.70 (s, 1 H), 7.23 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.11 (d, 2 H, J = 8.6 Hz), 7.02 (d, 1 H, J = 8.8 Hz), 6.84 (m, 5 H), 6 57 (dd 1 H, J = 8.6, 2.2 Hz), 5.17 (s, 2 H), 3.53 (s, 2 H), 2.53-2.51 (m, 4 H), 2.09 (s, 3 H), 1.69-1.66 (m, 4 H); IR (KBr) 3400, 2920, 2900, 1620 cm'¹; MS el m/z 436; CRN vypočteno pro C29H28N2O2+O,7 H2O.

Biologické metody

In vitro vazebný esej estrogen receptoru

Příprava receptoru

CHO buňky nadměrně exprimující estrogen receptor rostly ve 150 mm² miskách v DMEM + 10% dextranem potaženým aktivním uhlím stripovaného fetálního hovězího séra. Plotny byly promyty dvakrát s PBS a jednou s 10 mM Tris-HCl,pH /,4. 1 mM EDTA. Buňky byly sklizeny seškrabáním povrchu a pak byla buněčná suspenze umístěna na led. Buňky byly rozrušeny v ruce drženým motorovým tkáňovým mlýnkem za použití dvou 10 sekundových impulzů. Surový přípravek byl odstředován při 1200 g po 20 minut s následujícím 60 minutovým otáčením při 100000 g za vzniku ribosomu prostého cytosolu. Cytosol se pak zmrazí a uchovává při -80 ⁰C.Proteinová koncentrace cytosolu byla hodnocena za použití BCA eseje s referenčním standardním proteinem.

Podmínky vazebné eseje

Kompetiční esej byl proveden na 96-jamkové plotně (polystyren*), která váže <2,0 % celkového vstupu [ ³H]-17p-estrad i olu a každý datový bod byl sejmut třikrát. Na jamku bylo rozděleno 100 pG/100 μΐ receptorového přípravku. Sytící dávka 2,5 nM [³H]17β—estrádi olu + kompetitoru (nebo pufru) v 50 μΐ objemu byla přidána v předběžné kompetici, když byl hodnocen lOOx a 500x kompetitor, pouze byl použit 0,8 nM[³H]178-estradiol. Plotny byly inkubovány při teplotě místnosti po 2,5 hodiny. Na konci této inkubační periody bylo do každé jamky přidáno 150 μΐ ledově studeného dextranem potaženého dřevného uhlí (5% aktivované dřevné uhlí potažené s 0,05 % 69K dextranu) a plotny byly ihned odstředěny při 99g po 5 minut při 4 °C. 200 μΐ supernatantového roztoku bxlo pak odebráno pro scintilační počet. Vzorky byly spočteny na 2 L· nebo 10 minut, co se objeví jako první. Protože polystyren absorbuje malé množství [³H] 17(3—estradiolu, jamky, obsahující radioaktivitu a cytosol, ale nezpracované s aktivním uhlím, byly zahrnuty do kvantity množství dostupného izotopu. Také jamky, obsahující radioaktivitu, ale ne cytosol byly zpracovány s aktivním uhlím pro hodnocení neodstranítelného DPM [³H]17p-estrad i olu. Zrnění č. 25880-96, 96-jamkové plotny byly použity protože se ukázaly jako vázající alespoň něco estradiolu.

Analýzy výsledků

Impluzy za minutu (CPM) radioaktivity byly automaticky převedeny na rozpad za minutu (disintegrated per minute DPM) přístrojem Beckman LS 7500 Scintillation Counter za použití setu rozložených standardů pro generováné H# pro každý vzorek. Pro výpočet % estradiolové vazby za přítomnosti 100 nebo 500násobku kompetitoru byl použit následující vzorec:

((DPM vzorek-DPM neodstraněný aktivním uhlím)/(DPM estradiol-DPM neodstraněný aktivním uhlím))x 100 % = % estradiolové vazby

Pro generování IC50 křivek se vynesou % vazby proti sloučenině. IC50 jsou generovány pro sloučeniny, které vykazují >30% kompetici při 500x koncentrace kompetitoru. Popis těchto metod viz Hulme E.C. vyd.1992. Receptor-Ligand Interactions: A Practical Approach. IRL Press, New York (viz zejména kapitola 8).

Ishikawa buněčný alkalický fosfatasový esej

Udržení buněk a zpracování:

Ishikawa buňky byly udržovány v DMEM/F12 (50 % : 50 %), obsahujícím fenolovou červeň + 10 % fetálního hovězího séra a medium bvlo doplňováno 2 mM Glutamaxem, 1 % Pen/Strap a 1 mM pyruvátu sodného. Pět dnů před začátkem každého pokusu (ošeztření buněk) bylo medium vyměněno za fenolové červeni prosté DMEM/F12 + 10% dextranem potaženým aktivním uhlím stripované sérum. Den před zpracováním byly buňky sklizeny za použití 0,5 % 1. ryps inu/EDTA a umístěny na plotnu v hustotě 5 x 10⁴ buněk/jamka do 96-jamkových tkáňových kultivačních ploten. Testované sloučeniny byly dávkovány v 10^-6, 10“⁷ a 10“⁸M navíc k 10~⁶M 17p-estradiolu k hodnocení schopnosti sloučenin působit jako anti estrogeny. Buňky byly zpracovány 48 h před esejem. Každá 96-jamková plotna obsahuje 173~estradio 1ovou kontrolu. Vzorek populace pro každou dávku byl n=8.

Alkalická fosfatasa esej:

Na konci 48 hodin se medium odsaje a buňky se promyjí třikrát fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS). 50 μΐ lýzového pufru (O,1M Tris-HCl, pH 9,8, 0,2% Triton X-100) se přidá do každé jamky. Plotny se umístí při -80 °C na minimálně 15 minut. Plotny se nechají roztát při 37 °C s následujícím přídavkem 150 μΐ O,1M Tris-HCl, pH 9,8, obsahujícího 4 mM para-nitrofeny1fosfátu (pNPP) do každé jamky (konečná koncentrace, 3 mM pNPP).

Absorbance a výpočty strmosti byly provedeny za použití KineticCalc Application programu (Bio-Tek Instruments, lne. Winooski, VT). Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr +/- S.D. ’ --.ti enzymové reakce (strmost) zprůměrované nad lineární částí kinetické reakční křivky (odečítání optické hustoty každých 5 minut po 30 minut čtení absorbance). Výsledky pro sloučeniny jsou shrnuty jako procenta odezvy vztažená k 1 nM 1 7 f3—e s tradi o lu.

Eúzné sloučeniny byly hodnoceny na estrogenní aktivitu alkalickou fosfatasovou metodou a odpovídající ED50 hodnoty (95% C.I.) byly vypočteny. Čtyři dále uvedené jsou použity jako referenční standardy:

1 7p-es tradi o 1	0,03	nM
17a-es trad i o 1	1,42	nM
estriol	0,13	nM
es tron	0,36	nM

Popis takových metod je uveden v práci Holinka C.F., Hata H. , Kuramoto H. a Gurpide E. (1986) Effects of steroid hormones and antisteroids on alkaline phosphatase activity in human endometrial cancer cells (Ishikawa Line). Cancer Research 46:2771-2774 a Littlefield B.A., Gurpide E., Markiewicz L., McKinley B. a Hochberg R.B. (1990) A simple and sensitive microtiter plate estrogen bioassay based on stimulation alkaline phosphatase in Ishikawa cells; Estrogen action of D5 adrenal steroids. Endocrinology 6:2757-2762.

2X VIT ERE transfekční esej

Udržování buněk a zpracování

Buňky vaječníků čínského křečka (CHO). které byly stabilně transfektovány s lidským estrogenním receptorem, byly udržovány v DMEM + 10 % fetálního hovězího séra (FBS). 48 před ošetřením bylo růstové medium nahrazeno DMEM prostým fenolové červeně + 10 % fetálního hovězího séra (FBS). + 10 % dextranem potaženého aktivního uhlí stripovaného FBS (medium pro zpracování). Buňky byly umístěny na 6-jamkové plotny v hustotě 5000 buněk/jamku, obsahující 200 μΐ media/jamka.

Transfekce fosforečnanem vápenatým

Reporter DNA (Promega plasmid pGL2, obsahující dvě tandemové kopie vitellogenin ERE před minimálním thymidin kinasa promotorem nesoucím luciferasový gen) byly kombinovány s B-galaktosidasa expresním plasmidem pCHllO (Pharmacia) a nosičem DNA (pTZ18U) v následujícím poměru: 10 pG reporter DNA pG pCHHODNA 5 pG pTZ18U 20 pG DNA/1 ml transfekčního roztoku

DNA (20 pG) byla rozpuštěna v 500 pl 250 mM sterilního CaClz a přidána po kapkách do 500 pl 2 x HeBS (0,28 M NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM NazHPCU , pH 7,05) a inkubována při teplotě místnosti 20 minut. 20 ml této směsi bylo přidáno do každé jamky s buňkami a udržováno na buňkách 16 h. Na konci této inkubace byla sraženina odstraněna, buňky byly promyty mediem, čerstvě zpracovaná media byla nahrazena a buňky byly zpracovány s dalším vehikulem, 1 nM 17(3-estradi ol em, 1 pM sloučeniny nebo 1 pM sloučeniny + 1 nM 17p-estradiolu (testy na estrogenní antagonismus). Každé zpracování za daných podmínek bylo provedeno na 8 jamkách (n = 8), které byly inkubovány 24 hodin před luciferasovým esejem..

Luciferasový esej

Po 24hodinovém vystavení sloučeninám byla media odstraněna a každá jamka byla promyta 2 x 125 pl PBS bez Mg⁺⁺ a Ca⁺⁺. Po odstranění PBS bylo do každé jamky přidáno 25 pl Promega lýzového pufru a ponecháno stát při teplotě místnosti 15 mi s následujícími 15 min při -80 °C a 15 min při 37 °C. 20 pl lyzátu bylo přeneseno do opakní 96 jamkové plotny pro hodnocení liciferasové aktivity a zbylý lyzát (5 pl) byl použit pro hodnocení β-galaktosidasové aktivity (normalizovaná transfekce). Luciferan substrát (Promega) byl přidán ve 100 pl podílecg do každé jamky automaticky luminometrem a produkované světlo (relativní jednotky světla) bylo odečteno 10 sekund po přídavku.

β-Galatos idasový esej

Ke zbývajícím 5 μΐ lyzátu bylo přidáno 45 μΐ PBS. Potom bylo přidáno 50 μΐ Promega B-galaktosidasa 2X esejového pufru, dobře promícháno a inkubováno při 37 °C 1 hodinu. Plotny, obsahující standardní křivku (0,1 až 1,5 milijednotek trojmo) byly použity pro každý běh pokusu. Plotny byly analyzovány na Molecular Devices spektrofotometrické čtečce při 410 nm. Optické hustoty pro neznámé byly převedeny na milijednotky aktivity matematickou extrapolací ze standardní křivky.

Analýza výsledků

Luciferasa-data byla generována při relativních světelných jednotkách (RLU) akumulovaných během 1 Osekundového měření a automaticky přenesena do JMP (SAS lne) souboru, kde byly základní RLU odečteny. B-Galaktosidasové hodnoty byly automaticky importovány do souboru tyto hodnoty byly děleny do RLU k normalizaci dat. Průměrné a standardní odchylky byly stanoveny z n=8 pro každé zpracování. Aktivita sloučenin byla porovnána se 178~estradiolem pro každou plotnu. Procenta aktivity ve srovnání se 178-estradiolem byla vypočtena za použití vzorce %=((estradio1-kontrola)/(hodnota sloučeniny)) x 100. Tyto techniky jsou popsány Tzukermanem M.T., Estym A., Sant iso-Merem D., Danilelianem P., Parkerem M.G., Steinem R.B., Pikem J.W. a McDonnelem D.P. (1994). Lidská estrogen receptor transaktivační kapacita byla stanovena jak v buněčném tak promotorovém kontextu a zprostředkována dvěma funkčně odlišnými intramo1ekulárními regiony (viz Molecular Endocrinology, 8:21-30). Krysí uterotrofní/antiuterotrofní bioesej

Estrogenní a ant i estrogenní vlastnosti sloučenin byly stanoveny v immaturovaném krysím uretotrofním eseji (4 dny) jak bylo popsáno dříve (L.J.Black a R.L.Goode, Life Sciences 26, 1453 (1980)). Immaturované krysy Sprague-Dawley (saice 18 dnů staré) byly testovány ve skupinách po šesti. Zvířata byla ošetřována denně ip injekcí s 10 pG sloučeniny, 100 pg sloučeniny, (100 pg aloučeniny + 1 pg 17p-estradiolu) ke kontrole antiestrogenicity a 1 pg 17p-estradiolu, s 50 % DMSO/50 % salinického roztoku jako injekčního vehikula. 4.den byla zvířata usmrcena CO2 zadušením a jejich dělohy byly odebrány a oškrabání zbaveny přebytku lipidu, odstraněna jakákoliv kapalina a stanovena vlhká hmotnost. Malý řez jednoho rohu byl podroben histologii a zbytek použitpro izolaci celkové RNA za účelem vyhodnocení kompletní složky 3 genové exprese.

Biologické výsledky

Estrogen receptorová afinita (uváděna jako RBA: 1 7|3^—es t rad i o 1— 100)

S1oučenina	RBA
ra1ox i f en	200
tamoxi fen	1,8
příklad 10 příklad 7 příklad 8 příklad 9 příklad 12 příklad 11 příklad 13 příklad 14 příklad 15 příklad 21 příklad 22	20 42 40 40 114 80 27 32 53 53 23

Infekční luciferasový esej

S1oučenina	% aktivace	% aktivace s 1 nM
		17B-estradiolem
17p-estradiol	100%	N/A
estriol	38%	N/A
tamoxi fen	0%	10%
raloxifen	0%	0%
příklad 10	1%	2%
příklad 7	4%	8%
příklad 8	6%	78%
příklad 9	6%	8%
příklad 12	13%	24%
příklad 11	8%	12%
příklad 13	8%	17%
příklad 14	19%	57%
příklad 15	15%	31%
příklad 21	34%	34%
příklad 22	17%	19%

Ishikawa alkalická fosfatasa esej

S1oučenina	% aktivace	% aktivace (sloučenina + 1 nM 173-estradiol)
17p-estradiol	100%	N/A
tamoxi f en	0%	45%
raloxi f en	5%	5%
pří klad 10	6%	19%
příklad 7	1%	9%
příklad 8	10%	22%
příklad 9	3%	11%
příklad 12	7%	16%
příklad 11	6%	11%
příklad 13	7%	9%
příklad 14	2%	14%
příklad 15	0%	5%
příklad 21	34%	34%
příklad 22	27%	23%

3-denní ovariektomizovaný krysí model

S1oučenina	io pg loo μ-g
tamoxi f en raloxifen kontrola= 42,7	69,6 mg 71,4 mg 47.5 mg 43,2 mg mg 1 pg 17p-estradiolu = 98,2
S1 oučenina	10 pg 100 pg	100 pg + Ipg 178-estradiolu
příklad 7 kontrola=20,2	47,8 mg 64,8 mg mg 1 pg 17p-estradiol= 80,2 mg	75,4

S1 oučenina	10 pg íoo Vg	100 pg + Ipg 17p-es trad i olu
příklad 12	36,9 mg 49,5 mg	63,1
kontrola=31,4	mg 1 pg 173-estradiol= 89,0 mg
Sloučenina	10 pg 100 pg	100 pg + lpg 17P~estradiolu
příklad 11	39,3 mg 59,8 mg	81,0 mg
kontrola=24,5	mg 1 pg 173-estradiol= 90,8 mg
Sloučenina	10 pg 100 pg	100 pg + lpg 17p-es trad i o 1u
příklad 14	32,5 mg 56,4 mg	79,8 mg
příklad 15	40,4 mg 56,3 mg	69,3 mg
kontrola=29,1	mg 1 pg 178-estradiol= 95,5 mg
S1oučenina	10 pg 100 pg	100 pg + lpg 17p-es trad i olu
příklad 21	56,0 mg 84,0 mg	77,6 mg
kontrola=32,1	mg 1 pg 17p-estradiol= 90,2 mg
příklad 22	55,6 mg 71,3 mg	66,8 mg
kontrola=21,7	mg 1 pg 178-estradiol= 82,8 mg

Claims (25)

1. Sloučenina vzorce

kde

Ki je vybrán z H, OH nebo C1-C4 esterů nebo jejich alkyletherů nebo halogenu,

R₂, R3, R/i , Rs a Re, jsou nezávisle vybrány z H, OH nebo jejich C1-C/1 esterů nebo jejich alkyletherů. halogenu, kyano, Ci-Cóalkylu nebo trifluormethylu s tou podmínkou, že je-li Ri H není R₂ OH, n je 2 nebo 3,

X je vybrán z 11, Ci-Cealkylu, kyano, nitro, t r i f 1 uorme thy 1 u , Ua1ogenu, Ί je vybrán z — CH-CH-C—Y nebo

-ΟΞ C-fCH^Y.

Y je vybrán ze

a) skupiny | /^N-. r₇ Re kde R7 a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny, zahrnující H, Ci-Cealkyl, fenyl nebo dohromady -(CHzIp^-, kde p je celé číslo od 2 do 6, takže tvoří kruh, kruh je popřípadě substituován až třemi substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující \^od i k , hydroxyl, halogen, Ci —Ca a1ky 1 , trihalogenmethy1, Ci-C^alkoxy, trihalogenmethoxy, Ci-C^alky 1 thi o , Ci-Caalky1 sulfinyl, Ci-Qalkylsulfonyl, hydroxy(C1-Ca)a 1ky1, -CO2H, -CN, -CONH(Ci-Ca) alkyl , -NH2, C1-Ca a 1ky1 am i no, di(C1-Ca)alkylamino, -NHCO(C1-Ca ) alky1 a -NO2,

b) pěti-, šesti- nebo sedmičlenného nasyceného, nenasyceného nebo částečně nenasyceného heterocyklu, obsahujícího až dva heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující -0-, -NH-, -N(Ci-CAalkyl), -N= a -S(0)_B-, kde m je celé číslo od 0 do 2, popřípadě substituovaný 1 až 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující vodík, hydroxyl, halogen, Ci-CAalkyl, trihalogenmethyl, Ci-CAalkoxy, tri ha 1ogenmethoxy, C1-Caacy1 oxy , Ci-CAalky1thio, Ci-CAalkylsulfinyl, C1-Ca a 1ky1 sulfony1, hydroxy (Ci-Ca ) alky I-CO2II-, -CN-, -CONHR1-, -NH2-· (Ci-Ca)alkylamino, di(Ci-Ca)alky lamino, -NHSO2R1-. -NHC0R1-, -NO2-; fenyl substituovaný 1 až 3 (C1-C a)a1k y1skupi nami,

c) bicyklického kruhového systému, zahrnujícího pěti- nebo šestičlenný heterocyklický kruh kondenzovaný k fenylovému kruhu, ke uvedený heterocyklický kruh obsahuje až dva heteroatomy vybrané ze skupiny, zahrnující 0 , NH ·.

-N(Ci-C4alky1)- a -S(O)_m-. kde m je celé číslo od 0 do 2. popřípadě substituovaného 1 až 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny, zahrnující vodík, hydroxyl, halogen, Ci-C/_talkyl. tr i hal ogenme thy 1 , Ci-C«alkoxy, tri ba 1ogenmethoxy. Ci-C«acyloxy , C i-C4 a 1 ky 1 th i o, Ci-Cáalky 1 sul 1'i ny 1 .

Ci-C4alky1 sulíony1, hydroxy(C1-C4)alky 1 , fenyl substituovaný 1 až 3 (C1-C4)a 1ky1 skup inami , -CO2H-, -CN-, -CONHK1-, -NH2-. (C1-C4) a 1 ky 1 ami no , di(C1-C4)alkylamino, -NIISO2R1-, -NIlGORi-, -NO2^-. a fenyl popřípadě substituovaný 1 až 3 (Ci-C4)a 1ky1 skupí námi;

a její farmaceuicky přijatelná sul.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde kde Ri je H. OH nebo Ci-Cíesterů nebo jejich alkyletherů, halogen;

R₂, R3, R/i , R5 a Re, jsou nezávisle vybrány z H, OH nebo Ci-Cáesterů nebo jejich alkyletherů. halogenu, kyano. Ci-Csalkylu nebo trif1uormethy1u s tou podmínkou, že když K1 je H, R2 není OH;

X je vybrán ze skupiny, zahrnující H, Ci-Cealkyl. kyano, nitro, trifluormethy1, halogen;

Y je skupina । ^7 Rb;

kde R7 a Re jsou nezávisle vybrány z H, Ci-Cealkyiu nebo spolu vzájemně spojeny a znamenají -(CH2)p^_, kde p je celé číslo od 2 do 6, za vzniku kruhu popřípadě substituovaného až třemi substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující vodík, hydroxyl, halogen, Ci~C4alkyl, tr ihal ogenmethyl , Ci-C.4alkoxy, tri halogenmethoxy, Ci-C4alkylthio,

Ci-C₄alkylsulfinyl, Ci-C₄aIky 1 sulfony 1, hydroxy(Ci-C₄) alky1, -COžH, -CN-, -CONH(Ci-C₄alky1), -NH₃, (Ci-C₄)alky lamino, di(Ci-C₄)alkylamino, -NHSOz(Ci-C₄)alky 1, -NHCO(Ci-C₄)alkyl a

-NO 2 .

3. Sloučenina podle nároku 3, kde R7 a Re jsou spojeny a znamenají -(CH₂)_P- za vzniku kruhu, kde p je celé číslo od 2 do 6, kruh je popřípadě substituován 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny, zahrnující Ci-Csalkyl, trifluormethy 1, halogen, vodík, fenyl, nitro nebo -CN.

4. Sloučenina podle nároku 1, kterou je

5-benzy1oxy-2-(4-fluor-feny1)-3-methy1)-1H-indo1.

5. Sloučenina podle nároku 1, kterou je

5-benzy1oxy-2-(4-benzy1 oxy-feny1)-3-methy1)-lyImethy1(4-fenyIbromid)-indol.

6. Sloučenina podle nároku 1, kterou je

5-benzy1oxy-2-(4-fluor-feny1)-3-methy1)-1yImethy1(4-fenylbromid)-indol.

7. Sloučenina podle nároku 1, kterou je

2-(4-hydroxy-feny1)-3-methyl)-lyImethy1-(4-fenyIbromid)indol-5-ol.

8. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N,N-diethyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-feny1)-3methy1-indol-l-yImethyl]-fenyl}-akrylamid.

9. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N-tere.butyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-feny1)-3 methyl-indol-l-ylmethyl]-feny1}-akry lamíd.

10. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-pyrolidino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-f enyl)-3methyl-indol-l-ylmethyl]-feny 1}-akry 1amid.

11. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N,N-dimethyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3methyl-indol-l-yImethy1]-f eny1}-akry1amid.

12. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N,N-dibutyl-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-f eny1)-3methy1-indo1-1-yImethy1]-f eny1}-akry lam id.

13. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N-buty1,N'-me thy 1-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-f eny1) -3methy1-indo1 — 1 —yImethy1]-feny1}-akry 1amid.

14. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-morfolinino-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-f enyl)-3methy1-i ndo 1-1-yImethy 1]-feny 1}-akrylamíd.

15. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-feny1)-3methyl-indol-l-ylmethyl]-feny1}-akry1 amid.

16. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N-methy1-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-hydroxy-fenyl)-3methy1-indo1-1-yImethy1]-f enyl}-akrylamíd.

17. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N,N-dibuty1-3-{4-[5-hydroxy-2-(4-fluor-f enyl)-3 methy1-indo1-1-y1methy 1]-f eny1}-akry1 amid .

18. Sloučenina podle nároku 1, kterou je (E)-N-butyl,N'-methy13-{4-[5-hydroxy-2-(4-fluor-feny1)-3methy1-indo 1-1-y1methy1]-feny 1}-akry lamíd.

19. Sloučenina podle nároku 1, kterou je

2 —(4—hydroxy—f eny1)-3—me thy1 — 1—[4—(3—N,N—d ime thy1 — 1—yl — prop-1-iny1)-benzy1]-1H-indo1-5-01 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

20. Sloučenina podle nároku 1, kterou je

2-(4-hydroxy-fenyl)-3-methyl-l-[4-(3-piperidin-l-ylprop-l-inyl)-benzy1]-lH-indol-5-ol nebo jeho farmaceuticky při jatelná sůl.

21. Sloučenina podle nároku 1, kterou je

2-(4-hydroxy-feny1)-3-methy1-1-[4-(3-pyrro1idin-1-y1prop-l-inyl)-benzyl]-lH-indol-5-ol nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

22. Způsob léčení nebo prevence úbytku kostí u savců, zahrnující podání savci v případě potřeby účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

23. Způsob léčení nebo prevence chorobných stavů nebo syndromů, které jsou vyvolány nebo spojeny s deficiencí estrogenu u savce, zahrnující podání savci v případě potřeby účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

24. Způsob léčení nebo prevence kardiovaskulární choroby u savce zahrnující podání savci v případě potřeby účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

25. Farmaceutická kompozice, vyznačující se t í m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu.