CZ128096A3 - Charged liposome preparation - Google Patents

Description

organismu.

Dosavadní stav techniky . Liposomy se používají jako nosiče pro aktivní činidla, zahrnující terapeutická, diagnostická a profylaktická činidla.

Obecně liposomy zahrnují amfipatické sloučeniny, mající hydrofilní hlavu a hydrofóbní konec, které reagují za určitých podmínek za vzniku bimolekulární listové struktury alespoň dvou vrstev lipidu, ve které jsou polární hlavové skupiny na rozhraní mezi vodným mediem a lipidem a hydrofóbní konce interagují za vzniku prostředí, které vylučuje vodu. Lipidové dvojvrstvy jsou stabilní struktury, které drží pohromadě nekovalentní interakcí uhlovodíkových skupin acylových skupin. Jestliže se lipidová dvojvrstva uzavře sama do sebe, vytvoří kulovitý vesikl nazvaný liposom, mající vnitřní prostor oddělený od vnějšího prostředí. Požadovaná činidla mohou být enkapsulována v tomto prostoru nebo v samotné dvojvrstvě.

Lipidy, které obsahují liposomy, jsou typicky *fosfoglyceridy jako je fosfatidylcholin (lecitin) a sfingolipidy.

Liposomy mohou být použity jako nosiče například pro terapeutická, diagnostická a profylaktická činidla. Jsou zejména vhodné proto, že mohou chránit citlivá činidla před degradací a tím zvyšovat dobu, během níž je činidlo v těle aktivní. Navíc může být tkáně nebo buňky specificky cílené liposomem dosaženo inkorporací složky do liposomu, např. kopulací, konjugací, absorpcí nebo adsorpcí této složky k povrchu liposomové dvojvrstvy, která je selektivní pro specifický tkáňový nebo buněčný typ. Například mohou být do liposomů inkorporovány lipidy, protilátky, lektiny, receptory, ligandy a jiné takové složky pro účel dosažení tkáňově specifického cílení.

Další aplikací liposomové technologie je léčba, profylaxe a diagnosa jaterních poruch. Pres mnoho v současnosti dostupných různých zobrazovacích technik a metod zůstává přesné hodnocení jaterních lézí obtížným diagnostickým problémem. Jedním z důvodů obtíží diagnózy je nízký kontrastní rozdíl mezi normálním a tumorovým jaterním parenchymem, který umožňuje poznat pouze léze nad 1 až 2 cm. V souladu s tím by bylo žádoucí mít k dispozici koncentrované radiografické nebo MRI kontrastní medium v játrech za účelem zvýšení kontrastu po časovou periodu, která umožňuje hodnocení celého orgánu.

Jedním způsobem pro dosažení příjmu hydrofilních substancí do jater je jejich enkapsulace v liposomech. Po i.v. podání mohou být liposomy přijmuty retikulo-endothe1iáním systémem. Jsou tak hlavně koncentrovány v Kupfferových buňkách jater a makrofázích ve slezině. Protože fagocytická aktivita není zobrazena tumorovou tkání, může být liposomální kontrastní činidlo selektivně koncentrováno ve zdravé tkáni. Toto vede ke zvýšenému rozdílu hustoty (^HU pro rentgenové zobrazení, ^T1 nebo T2 pro MRI).

Různí výzkumníci jsou schopni demonstrovat v zásadě účinnost takového řešení. Ve většině případů jsou však neschopni dosáhnout dostatečného rozdílu v hustotě způsobené k

ΐ malou kapacitou liposomů pro zatížení jodem; ani nejsou k dispozici metody přípravy kontrastního činidla, nesoucího liposomy, které by bylo vhodné pro reprodukovatelnou výrobu farmaceuticky přijatelných 1iposomových přípravků ve velkém (odpovídající životnost, sterilita, apyrogenita, vysoká enkapsulace jodu).

Byl vyvinut způsob přípravy kontrastních liposomů, který i

překonává všechna výše uvedená omezení. Viz WO 91/1603; P 40 135802. Tento způsob nazvaný ethanol-odpařovací metoda umožňuje reprodukovatelnou výrobu liposomů ve velkém za aseptických podmínek. Originální liposomová suspenze produkovaná touto metodou se lyofilizuje za získání produktu s adekvátní životností. Před aplikací se lyofilizát resuspenduje se 135 mM mannitolovým roztokem za získání liposomální suspenze, která se infunduje po filtračním stupni.

Za použití kontrastních liposomů produkovaných touto metodou se dosáhne opacifikace jater a sleziny. Na základě počátečních biodistribučních studií, byl iopromid zvolen jako liposomálné kontrastní činidlo, protože jeho 7-denní retenční hodnoty v játrech a slezině jsou podstatně nižší než hodnoty pro iotrolan.

Ačkoliv jsou liposomy potenciálně důležitým přínosem v ·' ϊ systémech pro doručování léčiv jako jsou kontrastní media jak ? ............jsou popsána výše, jejichž použití v žijících organismech je omezeno svými vlastními nežádoucími systémovými vedlejšími účinky, které mohou být pozorovány po podání liposomů. Tyto systémové účinky zahrnují např. přechodnou hemodynamickou depresi, ovlivněni krevního tlaku, srdeční rychlosti a ECG; deprese počtu krvinek. Například je známo, že liposomy mohou mít nežádoucí hemodynamické účinky při intravenozním podání zvířatům, což je pro hostitelské zvíře nebezpečné.

Z hlediska výskytu takových systémových účinků není možné použít takové liposomové přípravky pro doručení léčiva. S překvapením bylo nalezeno, že když jsou připraveny stejné liposomy, ale za inkorporace elektricky nabité složky, jsou nežádoucí systémové účinky po podání redukovány nebo eliminovány.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr.l je schematický diagram metody ethanolového odpařování výroby liposomů.

Obr.2 je průměrný krevní tlak (procenta předchozí hodnoty) po intravenozní infuzi liposomů vyrobených z různých lipidů (300 mg lipid/kg, 100 mg 1ipid/kg/min) a mannitolu (300 mM), n=6, prúměry+SEM.

« mannitol o DSPC/DSPG Q DSPC Obr.3 je celkové periferní rezistence (procenta předchozí hodnoty) po intravenozní infuzi liposomů vyrobených z různých lipidů (300 mg lipid/kg, 100 mg 1ipid/kg/min) a mannitolu (300 mM), n=6, prúměry+SEM.

• mannitol o DSPC/DSPG Π DSPC

Obr.4 je konečný diastolický tlak /EDP) po intravenozní infuzi liposomů vyrobených z různých lipidů (300 mg lipid/kg, 100 mg 1ipid/kg/min) a mannitolu (300 mM), n=6, prúměry+SEM.

* mannitol o DSPC/DSPG Q DSPC

Podstata vynálezu

Při inkorporaci elektricky nabité složky do liposomů, které mají nežádoucí systémový účinek, bylo nalezeno, že výsledné liposomy snižují nebo odstraňují výskyt neočekávaných nebo škodlivých systémvých účinků, které jsou jinak pozorovány, když se podávají liposomy vytvoří ze stejných lipidových složek, ale s vypuštěním elektricky nabité složky.

Zejména přídavek složky, mající negativní náboj, např. mastné kyseliny jako je stearová kyselina, k liposomovému přípravku, zlepšuje významně hostitelovu toleranci k přípravku ve srovnání s tím, je-li stejný přípravek podáván bez negativně nabité složky. Zlepšená tolerance se může odrazit v redukci nebo eliminaci nežádoucích systémových účinků produkovaných u 1iposomového přípravku, ve kterém není přítomna elektricky nabitá složka. Tyto systémové účinky zahrnují, např. hemodynamické účinky jako je hemodynamická deprese, změny v krevním tlaku, srdeční rychlost, systolický tlak, diastolický tlak nebo EKG intervaly (PR, QRS, QT, Qtc), reflexní tachykardii i, prematurované ventrikulární arytmie, zvýšenou respiraci, sedaci a také změny v počtech krevních buněk a destiček a úmrtí. Je uznáváno, že tyto základní principy zlepšení tolerance k jiné škodlivé struktuře modifikací elektrickým nábojem, mohou být aplikovány na činidla jiná než liposomy.

Předložený vynález se týká množství elektrického náboje, které je účinné k, např. redukci hemodynamických účinků, zlepšení tolerance nebo redukci nežádoucích účinků, u liposomového přípravku, účinné množství elektrického náboje ,, muže být přidáno k liposomovému přípravku vytvořením liposomú za přítomnosti účinného množství elektricky nabité složky nebo přídavkem účinného množství náboje k již vytvořeným liposomům.

Nežádoucí nebo škodlivé účinky liposomového přípravku po podání mohou být redukovány nebo eliminovány přídavkem elektrického náboje, bez ohledu na složení podávaných liposomů. Například může liposomový přípravek, mající systémové účinky, již obsahovat elektricky nabité složky. V tomto případě muže být zavedení účinného množství elektricky nabité složky provedeno jako přídavek k nabitým složkám, které již jsou přítomny v liposomů. Nabitá zavedená složka může být stejného typu nebo náboje již přítomného v liposomů nebo zcela odlišného typu nebo náboje. Předložený vynález se tak týká přídavku náboje k liposomů, majícímu nabité složky.

Nabitá složka může být inkorporována do liposomů různými způsoby. Při inkorporaci elektricky nabité složky do liposomů se nabitá složka může stát, např. strukturní složkou lipidové dvojvrstvy a/nebo být konjugována nebo nekovalentně připojena ke složce liposomů. Například jestliže jsou liposomy vytvářeny ze směsi, obsahující účinné množství negativně nabité stearové kyseliny, může být stearová kyselina inkorporována do lipidové dvojvrstvy liposomů. Nicméně účinné množství elektricky nabité složky může být také přidáno k již vytvořenému liposomovému přípravku nebo neúplně vytvořenému přípravku, např. konjugací nebo nekovalentním připojením nabité složky k povrchu lipidové dvojvrstvy.

Jak je přídavek elektricky nabité složky k liposomů proveden, není podstatné. Rozhodujícím rysem je, že elektricky nabitá složka je přítomna v liposomů v množství, které je účinné, např. pro zlepšení hostitelovi tolerance, redukce

-škodlivých účinků a/nebo redukce hemodynamických účinku produkovaných podáním liposomového přípravku. Elektrický náboj může proto být nesen a inkorporován do liposomů různými způsoby, zahrnujícími, např. přídavek nabitých složek jako jsou kyseliny, např. stearová kyselina a soli těchto složek jako jsou amonné soli; kopulací nabitých skupin ke složkám lipidové dvojvrstvy; a přídavkem dvojvrstvu tvořících složek s náboji, bud kopulovanými kovalentně nebo adherovánlm jakoukoliv jinou silou. I když vynález není vázán jakoukoliv teorií, liposom podle předloženého vynálezu nese elektrický náboj na vnějším povrchu jeho dvojvrstvy.

Například liposomový přípravek, obsahující fosfatidylcholin je znám jako mající škodlivý hemodynamický účinek. Jeho tolerance hostitelským organismem může být zlepšen přípravou nové vsádky liposomů, obsahujících účinné množství elektricky nabité složky přidané k fosfátidylcholinu, např. účinné množství elektrického náboje může být neseno stearovou kyselinou. Alternativně náboj může být zaveden do liposomů, které již byly vytvořeny. Například může být elektrický náboj zaveden ke vnějšímu (exterior) povrchu lipidové dvojvrstvy chemickou modifikací nebo kovalentním nebo nekovalentním přídavkem nabité skupiny k jeho povrchu.

Přídavek náboje k liposomovému přípravku muže být také proveden vyššími množstvími přípravku, který je podáván hostitelskému organismu bez vzniku Škodlivých účinků normálně přičítaných podání liposomů. Toto je významné tím, že mohou být udrženy větší dávky činidla enkapsulovaného v liposomů. Přídavek náboje k liposomů může také zlepšit stabilitu a skladování liposomového přípravku, např, při teplotách větších než teplotě místnosti, jako je 30 nebo 40 °C.

Charakter účinného množství elektricky nabité složky může být bud pozitivní nebo negativní, pokud je dosaženo požadovaného účinku, např. ke zlepšení tolerance, redukce Škodlivých účinku a/nebo redukce hemodynamických účinků produkovaných při podání liposomového přípravku. Negativní náboj je preferován. Náboj může být např. iontový nebo elektronegativní. V zásadě jakmile je známo, že určitý liposoraový přípravek není tolerován hostitelským živočichem např. jak je manifestováno nežádoucími systémovými účinky, může být nabitá složka zvolena a pak inkorporována do liposomového přípravku za účelem snížení nebo odstranění vedlejších účinku spojených s jeho podáním. Při přírravě sérií liposomových přípravků, majících různá množství a typy náboje, by mělo být rutinní podat a stanovit, jak mnoho a jaký typ náboje je účinný v např. redukci hemodynamických účinků a zlepšení hostitelovy tolerance.

Množství účinného elektrického náboje může být neseno molekulou nebo nosičem náboje. Molekula musí mít jednu nebo více nabitých skupin, např. zwitterion. Náboj může být umístěn v jakékoliv položena nosiči náboje. Volba nosiče náboje bude záviset na různých faktorech, např. dostupnosti, biovyužitelnosti a požadovaném účinku. Nosič náboje může být zvolen i pro jiné vlastnosti navíc k jeho schopnosti nést požadovaný náboj. Například nosič náboje může mít také funkci cílového činidla, tj. řízení liposomů selektivně k požadovanému typu tkáně nebo buňky v hostitelském organismu. Nosič náboje může být, např. biomolekula, polymer, lipid, protein, nukleová kyselina, karbohydrát, syntetická molekula nebo jakákoliv molekula nebo molekulová struktura, která může být inkorporována do liposomové dvojvrstvy a která vykazuje účinné množství elektrického náboje. Při inkorporování molekuly do liposomové dvojvrstvy se molekula může stát

-.l,. .. strukturní částí liposomového vesiklu, např. být integrována do lipidové dvojvrstvy nebo být obvodově připojena k liposomovému povrchu nebo jako složka lipidu samotného. Dále mohou být malé sloučeniny s další kyselou skupinou kopulovány ke kotvě jako je cholesterol, fosfatidylcholin, mastná kyselina atd. umístěné na dvojvrstvě. Náboj, výhodně negativní, může být také nesen aminokyselinami nebo cukrovými kyselinami kopulovanými k jakékoliv skupině schopné adherovat ke dvojvrstvě (cholesterol, fosfatidylcholin, mastná kyselina atd.) .

Nosič náboje může být také jakýkoliv lipid, který nese náboj, např. zahrnující steroly, mastné kyseliny, glycerolestery, sfingosin, terpeny nebo obecně lipidy, např. vit TEEXTBOOK OF CLINICAL CHEMISTFY (1986), N.W. Tietz, vydavatel, W.B.Saunders Co., kapitola 7, str. 829-900. Preferovaným příkladem mastné kyseliny, mající negativní elektrický náboj, která může být použita v předloženém vynálezu v účinném množství, např. ke snížení hemodynamických účinků parenterálně podávaného 1iposomového přípravku. Jiné mastné kyseliny mohou zahrnovat např. kyselinu palmitovou, kyselinu arachidonovou, linolovou kyselinu, linoleovou kyselinu a /nebo jejich směsi.

Nábojový nosič může být také protein který je např. schopen integrace do lipidové dvojvrstvy a připojení obvodově k povrchu. Náboj proteinu může být produkován aminokyselinami karbohydrátovými vazbami, neproteinovými skupinami navázanými nebo připojenými k proteinu. Protein také může být protein, mající lipidovou skupinu. Protein může být zvolen pro svůj požadovaný náboj a také pro jeho schopnost směrovat liposomy ke specifické tkáni.

I

Množství náboje inkorporovaného do liposomu musí být

i.¹ m»¹··* 'u í¹¹¹ takové, že že toto množství je účinné pro snížení nežádoucích systémových účinků jako je hemodynamická deprese a/nebo tolerance. Množství náboje se může měnit změnou molárního poměru mezi nabitou složkou a jinými složkami liposomu. Například může být nabitá složka přidána k liposomu obsahujícímu fosfatidylcholin přídavkem kyseliny stearové.

Množství náboje v liposomu může být dosaženo úpravou molárního poměru mezi dvěma složkami na požadované množství; např. fosfatidylcholin/kyselina stearová, 9:1.

Zlepšení tolerance hostitele k liposomovému přípravku a následné odstranění nebo snížení systémových účinků může být dosaženo inkorporací nabité složky do liposomového vesiklu. Toto zlepšení, je-li zprostředkováno změnami buněčného povrchu vyvolanými nabitou složkou, může být také produkováno za použiti činidel nebo metod, které modifikují povrchy.

Například již vytvořené liposomy, mající škodlivý systémový účinek, mohou být zpracovány enzymaticky nebo chemicky pro změněni povrchových vlastností liposomu a pro zlepšení jeho tolerance při podávání. Chemická modifikace může zahrnovat např. reakci liposom redukujících činidel, oxidačních činidel nebo kopulačních nabitých složek k jeho povrchu. Tyto metody jsou prováděny běžným způsobem, ale pro dosažení redukce nebo eliminace škodlivých účinků se postupuje podle zde uvedeného.

Liposomy mohou být připraveny podle metod, které jsou v oboru běžné, např. jejichž přehled je ve W086/00238. Navíc mohou být liposomy připraveny podle EP69307; US pat.č.

5110475, který např. popisuje způsob výroby vodné disperze, zahrnující odstranění kapaliny(kapalin) z případné vícefázové kapalinové směsi pomocí membránové destilace; a W086/00238, který popisuje extruzní techniky pro produkci .liposomu, mající v podstatě unimodální a definovanou distribuci velikosti.

Jestliže se liposom připraví s elektricky nabitou složkou, je možné, že elektricky nabitá skupina může být orientována v liposomu v několika různých směrech; např.1ícováním interiéru liposomového vesiklu a lícováním exterieru na rozhraní mezi vodným mediem a lipidem. Liposomy, mající elektrický náboj na vnějšku jsou preferovány, např. vnější povrch. Může být žádoucí oddělit např. interiérově nabité liposomy od exteriérově nabitých liposomů. Toto může být provedeno jakýmkoliv známým způsobem v oboru, zahrnujícím sloupcovou chromatografi i, využívající např. nabité nebo jinak modifikované nosiče, elektroforézu, elektrické separační procesy a jiné procesy, které oddělují struktury, založené na náboji, hustotě náboje nebo orientaci náboje. Obecně mohou být liposomové přípravky, obsahující elektricky nabitou složku podrobeny podmínkám, které eliminují orientace, které nejsou žádoucí pro účely předloženého vynálezu.

Účinné činidlo může být enkapsulováno v liposomech měžnými postupy. Liposomový přípravek, mající účinné množství elektricky nabité složky může obsahovat nebo enkapsulovat účinné činidlo. Enkapsulace může být provedena metodami, které jsou známé, např. tvorbou liposomů za přítomnosti účinného činidla za podmínek, ve kterých lipidové dvojvrstvy se tvoří okolo a enkapsuluji účinné činidlo, při zavedení účinného činidla k již vytvořenému liposomů fúzí s liposomem, buňkou nebo jinou strukturou, obsahující účinné činidlo, např. může být taková fuze provedena pomocí PEG, elektrického proudu, lektinú a jiných dobře známých metod v oboru. Dále mohou být liposomy, mající účinné činidlo připraveny podle WO/89593, např. zpracováním liposomů ve vodném mediu za tlakových podmínek účinných pro redukci řádu lipidového přeskupení, čímž se umožní vstup účinného činidla a provedení poklesu tlaku.

účinné činidlo může být enkapsulováno do liposomového přípravku, majícího účinné množství elektricky nabité složky, zahrnující např. konvenční účinná činidla jako jsou ta, která jsou používána pro terapii, zahrnující činidla jak jsou uvedena ve Physicians Desk References, Medical Economics Data,

X,

44.vydání nebo Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 18. vydání, 1990, protilátky, peptidy, DNA, RNA, ribozymy a oligonukleotidy, profylaxi a diagnostiky, např. kontrastní činidla jako je iopromid, paramagnetické jednotky, feromagnetické jednotky, radioisotopy a jiné běžné struktury nebo sloučeniny. Takovým účinným činidlem může být takové činidlo, které se používá a je uznáváno odborníky v oboru.

Liposomy mohou být podávány běžnými metodami. Například může být liposomový přípravek podáván parenterálně, např. intravenozně arteriálním nebo venozním katetrem, injekcí stříkačkou, může být však také podáván orálně nebo přes zažívací trakt. Typické množství liposomového přípravku je, např. 100 až 200 mg lipidu/kg, toto množství je závislé na tom, kolik činidla je zamýšleno pro podání a kolik ho je enkapsulováno na liposora. Množství liposomového přípravku, které má být podáváno může být stanoveno rutinně, metodami, které jsou známé v oboru. Liposomy mohou být podávány v jediné injekci nebo mohou být podávány nebo infundovány během časové periody při konstantní nebo proměnlivé rychlosti, např. 2 ml/min po 30 minut. Protože liposomy, obsahující nabitou složku jsou dobře tolerovatelné hostitelem, mohou být infuzní rychlosti a množství podávaného Iiposomů zvýšena proti množstvím která se typicky používají pro liposomové přípravky, které mají škodlivé účinky.

Liposomy mohou být podávány jakémukoliv organismu, např. savcům jako jsou lidé, krysy, myši, psi, králíci, krávy, koně, ale také ptákům, obojživelníkům a plazům, účel podání může být diagnóza, léčba, medikace, sedace nebo prevence poruch, ale mohou být také použity ve spojení svývojem živočišných modelů pro hodnocení bezpečnosti a účinnosti léčiv, kontrastního media, protilátek a jiných činidel pro jejich případné použit u lidí. Způsob podle předloženého vynálezu např. redukce hemodynamických účinků, zlepšení tolerance hostitelem nebo redukce škodlivých účinku spojených s podáním liposomu, může být provedeno v jakémkoliv organismu, jako jsou výše uvedené organismy. Liposomy mohou být použity pro jakékoliv diagnostické nebo terapeutické použití, zahrnující např. MRI, ultrazvukovou a nukleární medicínu.

Bez dalších výzkumů se očekává, že odborník v oboru za použití předcházejícího popisu může vynález využít v jeho celém rozsahu. Následující preferovaná specifická provedení jsou proto konstruována jako ilustrativní a nijak popis neomezuj ící.

V předchozích a následujících příkladech jsou všechny teploty udávány nekorigované ve stupních Celsia a pokud není uvedeno jinak, jsou všechny díly a procenta hmotnostní.

Celé popisy všech přihlášek, patentů a publikací již citovaných a uváděných dále jsou zde zahrnuty jako odkaz.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsob přípravy iopromidových liposomu ethanolovou odpařovací metodou je znázorněno na obr. 1. Ethanolický roztok membránových lipidů (standard = 92,5 mg/ml fosfátidylcholin/cholesterol/kyselina stearová 4:5:1 molárně) se smísí s roztokem iopropidu, který se získá ředěním podílů Ultravist^R 370 roztoku s 20 mM tromethaminovým pufrem, pH 7,4 za získání konečné koncentrace jodu 46,25 mg/ml. Po míchací periodě se ethanol odstraňuje ze směsi za sníženého tlaku až do získáni liposomální suspenze. Tato suspenze se pak filtruje (5 pm a 1,2 pm) , naplní do lahviček a lyofilizuje za získání stabilní formy pro skladování.

Před podáním se takové lyofilizáty nejprve rehydratují 4 ml 135 mM roztoku mannitolu na g suché substance. Výsledná liposomální suspenze se pak filtruje (20 pm pre-filtr ze skleněných vláken a 5 pm CN hlavní filtr) pro odstranění neliposomálních struktur. Tyto struktury jsou smyčkovitě nebo lžičkovitě tvarované dvojvrstvé útvary částečně větší než 10 pm. Bylo prokázáno, že tyto struktury jsou odstraněny výše uvedeným filtračním stupněm.

Také byla demonstrována vhodnost tohoto způsobu přípravy pro reprodukovatelnou produkci větších množství liposomů. Příprava 16 vsádek (každá 1000 ml liposomální suspenze) vedla k enkapsulaci ze 42,1 + 4,9 % a průměrnému průměru 458 + 55 nm v resuspendovaném materiálu (2 ml 135 mM roztoku mannitolu na g lyofi 1izátu).

Způsob je potenciálně vhodný k provedení za aseptických podmínek. Poztoky používané pro výrobu liposomů mohou být ultra- nebo sterilně filtrovány. \

Složení resuspendovaného lyofilizátu (4 ml 135 mM

mannitolového roztoku	na g	lyof i 1izátu)	je uvedeno dále
rozmezí):
iopromide		145,5	mg
fosfatidylcholin	(PC)	41,3	mg
DL-a-tokoferol		0,04	mg
cholesterol (CH)		25,0	mg
kyselina stearová	<SS)	3,7	mg

(bez tromethamin IN HCI dvoj sodný edetát mannitol voda pro inj.

3,7	mg
25,4	mg
0,15	mg
21,8 mg
d 1	ml

Molární lipidová směs PC/CH/SS 4:5:1 vede k nejvyššímu stupni enkapsulace (42,5 + 3,7 %, n= 6) jakož i nejmenšímu střednímu průměru (439 ± 87 nm) v resuspendovaném materiálu. Tyto hodnoty jsou v těsném souladu s hodnotami, které byly získány, když byly velikosti vsázek zvýšeny 10-násobně (viz 3.1). Molární poměr těchto membránových složek jakož i typ a kvalita každé lipidové složky byly optimalizovány s ohledem na tyto cílové parametry.

Použití jiných neiontových monomerních kontrastních činidel (iopamidol, iohexol a ZK 119095) spíše než iopromid neposkytlo zlepšení pokud jde o enkapsulaci jodu. Když byl neiontový dimer iotrolan enkapsulován, bylo dosaženo vyšších hmotnostních poměrů (mg jodu/mg lipidu). Tato sloučenina byla vyloučena z dalších studií, pro nepřijatelné dlouhou retenci 1iposomálního iotrolanu v játrech a slezině testovaných živočichu (biodistribuční studie) a současné patologické změny v játrech.

V ethanol-odpařovacím procesu se ukázal poměr jod/lipid 1:1 v původních roztocích (viz obr.l) jako nejvhodnější z hlediska optimálního použití lipidu (tj. s nejvyšším možným hmotnostním poměrem jodu k lipidu) v konečném přípravku. Při testováné resuspenzního media, 135 mM mannitol vede k nejvyšším enkapsulačním hodnotám ve srovnání s dvakrát destilovanou vodou, různými roztoky pufrů a roztoky mannitolu o nižších koncentracích.

Přiklad 2

Pro počáteční stabilitní studii byly vsázky liposomového lyofilizátů vyrobeny za aseptických podmínek přípravy. Resuspendované liposomy byly charakterizovány z hlediska velikosti (QUELS), enkapsulace jodu, pH a mikroskpopického vzhledu. Mikrobiální stav nebyl stanoven. Podle výsledků získaných v této studii (šest měsíců skladování), mohou být liposomální lyofilizáty (PC/CH/SS 4:5:1) skladovány při teploách až 30 “C bez postřehnutelných změn kvality. Po 6 měsících při 40 “C bylo nicméně pozorováno významné zvýšení velikosti a snížení pH v resuspendovaném materiálu. Tyto změny byly spojeny s nepříjemným zápachem pocházejícím z resuspendovaného materiálu.

Ve stabilitní studii (nefi 1trovaného) resuspendovaného materiálu nebyly pozorovány žádné významné změny ve velikosti (QUELS), enkapsulaci nebo pH během periody 24 h. Možné změny v mikroskopickém vzhledu přípravku nebyly v této studii však sledovány; a tak byl mikroskopický vzhled resuspendovaného lyofilizátů sledován odděleně jak před tak po filtraci během časové periody 8 hodin. Nebyly pozorovány žádné významné změny ani v jednom ze zkoušených materiálů.

Příklad 3 (A) Metody (i) Chirurgické postupy

Šest až sedm dní před studií byl vybráno s ohledem na podobnou hmotnost (14,3 - 15,6 kg) 6 normálních zdravých dospělých psích kříženců a byly anestetizováni 35 mg/kg iv pentobarbitalu sodného, oholeni a připraveni pro sterilní chirurgii promytím plochy zamýšlené incise dvakrát BetadineR chirurgickým kartáčem a pak nabarvením Betadine^R roztokem. Psi byly intubováni za použití zamanžetované endotracheálni trubice a mechanicky respirováni vzduchem z místnosti za použití zařízení Harvard animal respirátor (model 607), umístěni v poloze na zádech na chirurgickém stole a zakryti pro chirurgický zákrok za použiti sterilních technik. Malá (asi 1 palec) incise byla provedena mezi manubriem sterna a větším tuberklem pravého humeru. Použití tupé disekce byly pravá omocervikální arterie a pravá jugulární véna izolovány pro kanylaci. Arterie byla kanylována za použití Tygom mikrotrubičky (0,05 vnitř.průměr,#S-54-HL). Katetr byl zajištěn šitím 2-0 hedvábím a exteriorizován před podkožní tunel k zádové části krku. Podobným způsobem byla katetrizována pravá jugulární véna za použití mikrotrubičky Tygon (0,04 vnitř.průměr, #S-54-HL) a exteriorizována také k zádové části krku. Jak arteriální tak venozní katetr byly naplněny sterilním, heparinizovaným (600 j./ml) salinickým roztokem, sešity a nabarveny betadinem pro snížení infekce. Vystavené katetry byly zajištěny malými plastickými váčky a uzavřeny v bavlněném límci zesíleném adhezivní páskou. Psům byly podávány standardní intamuskulární injekce Combioticu pro snížení rizika infekce a ponecháni se vzpamatovat z chirurgického zákroku.

(ii) Experimentální postupy

V den studie byli psi zavedeni v laboratoři do dvou individuálních mobilních smyčkách. Psi byli oholeni na kotnících a instrumentováni svody II elektrokardiografických (EKG) svodů za použití povrchových elektrod a vodivých spojů. Speciální límce byly odstraněny, krev byla odebrána z každého katetru a katetry byly promyty sterilním salinickým roztokem. Arteriální katetr byl připojen k tlakovému převaděči a kalibrován za použití rtuťového manometru. 10 ml vzorky venozní krve byly odebrány z venozního katetru za použití sterilní Sarsdtetovy monovette trubiček, obsahujících EDTA. Po ekvilibrační periodě 20-40 minut byla psům podána infuze DMPC/DPPC, připravená interdigitační/fuzní metodou (viz WO 91/10422; EP 510096), nebo DPPC při 2 ml/minuta během asi 25 minut. Sledované parametry byly přímý arteriální krevní tlak a svody II povrchového EKG.

(iii) Podání léčiva

DMPC/DPPC nebo DPPC liposomové vesikly byly podávány intravenozně jako opakni suspenze při rychlosti 2 ml/minuta v koncentraci 1 mg/kg/ml do podání celkové dávky 50 mg/kg. Všichna léčiva byla vložena do sterilní 60 ml stříkačky a infundována za použití Razel infuzní pumpy. Jakákoliv zbývající suspenze v katetru byla vymyta do psa za použití sterilního salinického roztoku při stejné infuzní rychlosti.

(iv) Statistická analýza

Selektované CBC počty po podání vesiklú byly srovnány se základními hodnotami za použití párovéhovzorkového t-testu. Rozdíly byly považována za významné při ý 0,05.

(B) Výsledky

Vlivy DMPC/DPPC nebo DPPC infuzí na srdeční rychlost (HR) , střední krevní tlak (MAP), systolický tlak (SP), diastolický tlak (DP), EKG intervaly (PR, QRS, QT, Qtc) a selektované hodnoty počtu krevinek jsou uvedeny v tabulkách 1-4. úplné hodnoty počtu krvinek (CBC) jsou obsaženy v příloze.

(i) Krevní tlak

Intravenozní podání DMPC/DPPC nebo DPPC vesiklú působí výrazné snížení systolického, diastolického a středního arteriálního tlaku.

(ii) Systolický tlak (tabulka 1)

Systolický tlak se průměrně snižuje o 37 % během infuze DMPC/DPPC. Během infuze DPPC vesiklů bylo pozorováno i větší snížení systolického tlaku s poklesem systolického tlaku 55 % Protože se systolický tlak vrátil blízko k základním hladinám pouze u jednoho psa z každé skupiny během doby pozorování, tento pokles byl stanoven jako přechodný protože systolickě tlaky byly v normálních fyziologických hladinách během 30 minut po podání vesiklů.

(iii) Diastolický tlak (tabulka 2)

Diastolický tlak se snižuje o 39 % ve skupině DMPC/DPPC o 48 % v DPPC skupině během inffuze vesiklů. Jeden pes ze skupiny DMPC/DPPC udržuje kontrolní hladiny diastolického tlaku během infuze a 1 pes ze skupiny DPPC demonstruje minimální účinky na diastolický tlak. V průměru byl účinek iposomových vesiklů na diastolický tlak přechodný, protože se střední diastolický tlak vrací na hladiny blízké kontrolním během 30 minut po podání vesiklů.

(iv) Střední tlak (tabulka 3)

Vliv liposomových vesiklů na střední arteriální tlaky byl mnohem výraznější v DPPC skupině s nižšími a mnohem déle trvajícími úbytky tlaku. Psi ve skupině DMPC/DPPC vykazovali průměrný pokles středního tlaku 38 % během infuze, ale navraceli se na hodnoty blízké kontrolním na konci infuze. Ps dostávající DPPC vesikly však zaznamenali 52% pokles ve středním krevním tlaku a nevraceli se na hladiny blízké kontrolním do 30 minut po konci infuze.

zu

1) (v) Srdeční rychlost (tabulka 4)

Vliv liposomových vesiklú na srdeční rychlost u psů při vědomi byl proměnlivý. I když se hodnoty střední srdeční rychlosti zvyšují u obou skupin, její projevení se jako zřetelné tachykardie bylo zaznamenáno pouze u jednoho psa v každé skupině. Další 2 psi v každé skupině udržovali srdeční rychlost stejnou nebo nižší než kontrola během infuze a po 45 minut následující periody sledování.

(vi) Elektrokardiografické intervaly (tabulka 5)

Infuze DMPC/DPPC nebo DPPC liposomových vesiklú nemá žádný fyziologicky významný vliv na ECG intervaly. Nebyly pozorovány žádné změny v PR a QRS intervalech (tabulka 3A a 3B, str. 13). Malá zvýšení ve QT (tabulka 3C, str. 14) byla zaznamenána, ale nepředstavují hlavní fyziologický efekt dostačující k tomu, aby byl signifikantní.

(vii) CBC hodnoty (tabulka 6)

Infuze DMPC/DPPC liposomových vesik.lu zvyčuje významně počet bílých krvinek a mírně snižuje cirkulující destičky, počet červených krvinek a hematokrit nebyly ovlivněny (tabulka 4A, str.15). Infuze DPPV vesiklú také měla malý vliv na počet červených krvinek a hematokrit, nicméně významně snižuje počet destiček a slabě snižuje počet bílých krvinek (tabulka 4B, str.15).

. (C) Diskuse

Předložená studie, ve které byli bdící psi sledováni na akutní hemodynamické a EKG změny, ukazuje, že intravenozní infuze DMPC/DPPC a DPPC liposomových vesiklú působí náhlý a významný pokles krevního tlaku vedoucí k mnoha fyzioogickým reakcím zahrnujícím letargii a mírnou sedaci u všech psů se zvracením, objevujícím se pouze u jednoho psa. V EKG parametrech nebyly zaznamenány žádné fyziologicky významné změny, byly však ovlivněny počty bílých krvinek a obíhajících destiček.

Většina z těchto zjevných reakcí mohla být přičtena přechodnému, ale významnému snížení krevního tlaku vzniklému z možné anafylaktické reakce na testovanou substanci. Souviset s takovou reakcí by mohly změny v počtu bílých krvinek a počtu obíhajících krevních destiček.

Příklad 4 (A) Metody (i) Chirurgické postupy

Šest až sedm dní před studií byl vybráno s ohledem na podobnou hmotnost (13,7 - 14,1 kg) 5 normálních zdravých dospělých psích kříženců obojího pohlaví a byly anestetizováni 35 mg/kg iv pentobarbital.u sodného, oholeni a připraveni pro sterilní chirurgii promytím plochy zamýšlené incise dvakrát Betadine^R chirurgickým kartáčem a pak nabarvením Betadine^R roztokem. Psi byly intubováni za použití zamanžetované endotracheální trubice a mechanicky respirováni vzduchem z místnosti za použití zařízení Harvard animal respirátor (model 607), umístěni v poloze na zádech na chirurgickém stole a zakryti pro chirurgický zákrok za použití sterilních technik. Malá (asi 1 palec) incise byla provedena mezi manubriem sterna a větším tuberklem pravého humeru. Použitím tupé disekce byly pravá omocervikální arterie a pravá jugulární véna izolovány pro kanylaci. Arterie byla kanylována za použití Tygom mikrotrubičky (0,05 vnit.průměr,#S-54-HL). Karetr byl zajištěn šitím 2-0 hedvábím a exteriorizován před podkožní tunel k zádové části krku. Podobným způsobem byla katetrizována pravá jugulární véna za použití mikrotrubičky

Tygon (0,04 vnitř.průměr, #S-54-HL) a exteriorizována také k zádové části krku. Jak arteriální tak venozní katetr byly naplněny sterilním, heparinizovaným (600 j./ml) salinickým roztokem a uzavřeny sterilními čepičkami. 2 incize byly uzavřeny zašitím hedvábím a nabarveny betadinem pro snížení rizika infekce. Vystavené katetry byly zajištěny malými plastickými váčky a uzavřeny v bavlněném límci zesíleném adhezivní páskou. Psúm byly podávány standardní intamuskulární injekce Combioticu pro další snížení rizika infekce a ponecháni se vzpamatovat z chirurgického zákroku.

(ii) Experimentální postupy

V den studie byli psi zavedeni v laboratoři do dvou individuálních mobilních smyčkách. Psi byli oholeni na kotnících a instrumentováni svody II elektrokardiografických (EKG) svodu za použití povrchových elektrod a vodivých spojů. Speciální límce byly odstraněny, krev byla odebrána z každého katetru a katetry byly promyty sterilním salinickým roztokem. Arteriální katetr byl připojen k tlakovému převaděči a kalibrován (0 - 200 mmHg) za použití rtuťového manometru. 10 ml vzorky venozní krve byly odebrány z venozního katetru za použití sterilní Sarstedt monovette trubiček, obsahujících EDTA. Po ekvilibrační periodě 20-40 minut byla psům podána infuze EPC rychlostí 2 ml/minuta po 25 minut. Sledované parametry byly přímý arteriální krevní tlak a svody II povrchového EKG.

(iii.) Podání léčiva

EPC liposomové vesikly byly podávány intravenozně jako opakní suspenze při rychlosti 2 ml/minuta v koncentraci 1 mg/kg/ml do podání celkové dávky 50 mg/kg. Všechny dávky byly vloženy do sterilní 60 ml stříkačky a infundovány za použití Razel infuzní pumpy. Jakákoliv zbývající suspenze v katetru byla vymyta do psa za použití sterilního salinického roztoku při stejné infuzní rychlosti pro zajištění, že každému psovi byla podána celková dávka.

(B) Výsledky

Vlivy EPC liposomových infuzí na srdeční rychlost (HP), střední krevní tlak (MAP), systolický tlak (SP) , diastolický tlak (DP), EKG intervaly (PR, QRS, QT, Qtc) a úplné hodnoty počtu krvinek (CBC) jsou popsány dále. Píkové změny v krevním tlaku a srdeční rychlosti se objevují během infuze liposomových vesiklú.

(i) Krevní tlak

Intravenozní podání EPC liposomových vesiklú působí výrazné snížení systolického, diastolického a středního arteriálního tlaku u 3 z 5 testovaných psú.

(ii) Systolický tlak (tabulka 7)

Systolický tlak se průměrně snižuje o 36 % ve skupině 5 psů. Tito psi vykazující akutní hemodynamickou depresi (n=3) měli systolický tlakpsů v rozmezí od 50% do 62 % pod bazálními hladinami. Tyto změny v systolickém tlaku byly přechodné protože hodnoty systolického tlaku se vracely na normální hladiny na konci EPC infuze.

(iii) Diastolický tlak (tabulka 8)

Diastolický tlak se snižuje o 36 % u 5 testovaných psů.

Ti 3 psi, kteří vykázali značné snížení v krevním tlaku měly poklesy diastolického tlaku v rozmezí od 56 % do 61 % pod bazální hladiny. I když tyto pklesy v tlaku byly obtížmé, byly také přechodné, protože hodnoty tlaku vrací na hladiny blízké bazálním hladinám na konci infuze EPC vesiklú.

(iv) Střední tlak (tabulka 9)

Vliv infuze EPC liposomových vesiklů neměl žádný pozorovaný vliv u 2 ze 3 testovaných psu; nicméně 3 z 5 testovaných psú demonstruje významní poklesy ve středním arteriálním tlaku. Průměrný pokles ve středním tlaku byl 35 %, ale ti psi s významnou hemodynamickou depresí vykazovali střední tlakové poklesy v rozmezí od 57 % do 61 % pod bazální hladiny. I když byly tyto poklesy kruté, byly také přechodné, protože se tlakové hodnoty vrátily blízko k bazálním hodnotám na konci infuze EPC vesiklů.

(v) Srdeční rychlost (tabulka Ϊ0)

Vliv EPC liposomových vesiklů na srdeční rychlost u psu při vědomí byl v těsném spojení s fyziologickou odezvou na pokles krevního tlaku. Ti psi, kteří byli sledováni hemodynamicky při EPC infuzi demonstrují zřetelnou tachykardii během EPC infuze s následující krátkou bradykardií s návratem srdeční rychlosti na bazální hladiny u všech psů během 30 minut po EPC infuzi. 2 psi, kteří nevykazovali hemodynamick urovnání během EPC infuze si udrželi relativně konstantní srdeční rychlosti během studie.

(vi) Elektrokardiografické intervaly (tabulka 11, A-D)

Infuze EPC liposomových vesiklů nemá žádný fyziologicky významný vliv na ECG intervaly. Nebyly pozorovány žádné změny ve QRS trvání.

Změny, objevující se v PR, QT a QTc intervalech byly ve vztahu ke změnám srdeční rychlosti, které se objevují u 3 psú, zřetelně způsobených EPC infuzi. Žádná z těchto změn nebyla stanovena jako fyziologicky významná pro svůj přechodný charakter.

U jednoho psa se objevily spontánní arytmie (ve formě₍ izolovaných prematurovaných ventrikulárních kontrakcí), objevujících se během EPC infuze. Příklady jsou uvedeny na obr. 2.

(vii) Střední CBC hodnoty (tabulka 12)

Infuze EPC liposomových vesiklu nezvyšuje významně počet krvinek ani hematokrit. Počty bílých krvinek nebyly konzistentní. Počty destiček byly jasně potlačeny u těch 3 psu, u kterých se objevila hemodynamická deprese (USDA #97684) vykázal depleci destiček, ale ne pod normální rozmezí hodnot.

(C) Diskuse

Intravenozní podání EPC liposomových vesiků bdícím psům vede k hemodynamické depresi. Destičková deplece pozorovaná v této studii odpovídá podobnému účinku zaznamenanému v předešlé studii. V obou studiích se destičková deplece jeví být v těsné souvislosti s obtížnými poklesy v krevním tlaku vzniklými z liposomové infuze. Zjevné reakce pozorované během liposomové infuze (destičková deplece, značná hypotenze a zjevná tachykardie) jsou nejpravděpodobněji v souvislosti s anafylaktickou odezvou. Spontánní arytmie pozorované u jednoho psa, který dostal EPC vesikly mohou být odezvou na náhlý hypotenzivní efekt s reflexní aktivací katecholaminů.

Přiklad 5

Liposomy podle předloženého vynálezu, obsahující elektricky nabitou složku kyselinu stearovou (přípravky SA 504/02079 a SA 504/300591) byly podány zdravým psům.

(A) Metody (i) Chirurgické postupy

Šest až sedm dní před studií byl vybráno s ohledem na podobnou hmotnost (12,3 - 15,1 kg) 6 normálních zdravých dospělých psích kříženců obojího pohlaví a byly anestetizováni 35 mg/kg iv pentobarbitalu sodného, oholeni a připraveni pro sterilní chirurgii promytím plochy zamýšlené incise dvakrát Betadine^R chirurgickým kartáčem a pak nabarvením plochy s endotracheální trubicí a mechanicky respirováni vzduchem z místnosti za použití zařízení Harvard animal respirátor (model 607), umístěni v poloze na zádech na chirurgickém stole a zakryti pro chirurgický zákrok za použití sterilních technik. Malá (1 palec) incise byla provedena mezi manubriem sterna a větším tuberklem'pravého humeru. Použití tupé disekce byly pravá omocervikální arterie a pravá jugulární véna izolovány pro kanylaci. Arterie byla kanylována za použití Tygom mikrotrubičky (0,05 vnitř.průměr,#S-54-HL). Karetr byl zajištěn šitím 2-0 hedvábím a exteriorizován před podkožní tunel k zádové části krku. Podobným způsobem byla katetrizována pravá jugulární véna za použití mikrotrubičky Tygon (0,04 vnitř.průměr, #S-54-HL) a exteriorizována také k zádové části krku. Jak arteriální tak venozní katetr byly naplněny sterilním, heparinizovaným (600 j./ml) salinickým roztokem (1 ml) a uzavřeny sterilní nabarvením Betadinem^R pro snížení infekce. Vystavené katetry byly zajištěny malými plastickými váčky a uzavřeny v bavlněném límci zesíleném adhezivní páskou. Psům byly podávány standardní intamuskulární injekce Combioticu pro snížení rizika infekce a byli ponecháni se vzpamatovat z chirurgického zákroku.

(ii) Experimentální postupy

V den studie byli psi zavedeni v laboratoři do individuálních mobilních smyčkách. Psi byli oholeni na kotnících a instrumentováni svody II elektrokardiografických (EKG) svodů za použití povrchových elektrod a vodivých spojů. Speciální límce byly odstraněny, krev byla odebrána z každého katetru a katetry byly promyty sterilním salinickým roztokem. Arteriální katetr byl připojen k tlakovému převaděči a kalibrován za použití rtuťového manometru. 10 ml vzorky venozní krve byly odebrány z venozního katetru za použití sterilní Sarstedtovy monovette trubiček, obsahujících EDTA. Po ekvilibrační periodě 20-40 minut byla psum podána infuze SA 504/020791 nebo SA 504/300591 rychlostí přibližně 2 ml/minuta po přesně 30 minut. Sledované parametry byly přímý arteriální krevní tlak a svody II povrchového EKG. Srdeční rychlost byla stanovena z EKG artikulace.

(iii) Podání léčiva

SA 504/020791 nebo SA 504/300591 jod obsahující liposomové vesikly byly podávány intravenozně jako opakní suspenze při rychlosti 2 ml/minuta do konečného objemu 4,2 ml/kg a 4,5 ml/kg. Infuzní rychlost byla upravena tak, že celková doba infuze byla 30 minut, Všichny dávky byly vloženy do sterilních stříkaček a infundovány za použití Razel infuzní pumpy. Jakákoliv zbývající suspenze v katetru byla vymyta do psa za použití sterilního salinického roztoku při stejné infuzní rychlosti.

Testované substance byly připraveny podle následujícího postupu: SA .504/020791: 17,6 ml mannitolového roztoku (135 mM) byly přidny do každé lahvičky s testovanou substancí a ponechány usadit alespoň po 10 minut. Lahvičky pak byly intenzivně třepány a ponechány usadit dalších 10 minut. Po opakování třepacího postupu byly suspenze hodnoceny vizuálně na aglomeráty (jsou-li aglomeráty přítomny, byl výše uvedený postup opakován). Suspenze byly pak nataženy do 60ml stříkaček a filtrovány přes sterilní filtrační zařízení fy Schering AG. Každé zvíře dostalo 4,5 ml/kg.

SA 504/300591: Postup byl přesně stejný jak je uveden výše s tím rozdílem, že 18,0 ml mannitolového roztoku (135 mM bylo použito na lahvičku a každé zvř.e dostalo 4,2*ml/kg.

(iv) Statistická analýza

Hemodynamické parametry, EKG intervaly a selektované kompletní počty krvinek byly porovnány se základními hodnotami před ošetřením za použití párového vzorkového t-testu.

Rozdíly byly považována za významné při <. 0,05.

(v) Liposomový přípravek

SA 504/020791 a SA 5041/300591 byly připraveny podle následujících instrukcí.

!

Roztok 1 byl připraven rozpuštěním 54,6 g lipoidu S100, 33,0 g cholesterolu a 4,9 g kyseliny stearové v 9,5 ml 96,5% ethanolu. 2000 ml roztoku 2 bylo připraveno spojením 250 ml iopropidového roztoku s 9,5 ml 20 mM Tris HCI, pH 7,5 a 9,5 ml 96% ethanolu. Za míchání byl roztok 1 smísen s roztokem 2. Ethanol byl odstraněn za vakua a zbylý roztok byl vymražen. 5 g vymraženého materiálu bylo resuspendováno v 8,8 ml 135 mM mannitolu. Resuspendovaný liposomový přípravek byl typicky injektován v dávce 300 mg jodu/kg.

(B) Výsledky

Vlivy SA 504/02091 nebo SA 504/300591 infuzí na srdeční rychlost (HR), střední krevní tlak (MAP), systolický tlak (SP), diastolický tlak (DP), EKG intervaly (PR, QRS, QT, Qtc) a selektované hodnoty počtu krevinek jsou uvedeny v tabulkách 13-16.

I* (i) Krevní·tlak (tabulka 13)

Intravenozní podání SA 504/020791 nebo SA 504/300591 vesiklú nepůsobí žádné výrazné změny systolického, diastolického a středního arteriálního tlaku. Jak je zřejmé z tabulky 13C byl kontrolní střední arteriální tlak u psú ošetřených s SA 504/300591 104 + 6 a byl relativně neměnný po dobu trvání testu. Podobné výsledky byly získány s testovanou substancí SA 504/020791.

(v) Srdeční rychlost

Přípravky 1iposomových vesiklú'neměly podstatný vliv na srdeční rychlost u psů při vědomí. Z pěti psů ošetřených s SA 504/300591, měli tři psi sníženou srdeční rychlost během infuze a dva měli zvýšenou. U jednoho zvířete, které dostalo SA 504/020791 (pes # 10003) byla kontrola srdce zvláště vysoká. Toto zvíře reagovalo vysoce na každý stimul v místnosti (tj. laboratorní personál), ale s postupem pokusu se uklidňovalo. Toto bylo způsobeno pravděpodobněji aklimatizací a nebyl to účinek léčiva.

(vi) Elektrokardiografické intervaly (tabulka 5)

Infuze ani jednoho testovaného činidla nemá žádný fyziologicky významný vliv na ECG intervaly. Nebyly pozorovány žádné změny v PR, QRS, QT nebo QTC intervalech, (vii) CBC hodnoty

Infuze ani jednoho testovaného činidla neměla podstatný vliv ria RBC nebo WBC počty. I když hodnoty WBC nebyly podstatně ovlivněny, zdá se, že je sklon ke zvyšování WBC po podání testovaných činidel. Jestliže se spojí data z obou skupin (tj, n=8), potom je dosaženo statické významnosti pro zvýšení WBC (p= 0,026). V 5 pokusech byly hodnoty destiček před a po testovaných substancích kategorizovány jako bud

JU adekvátní, zvýšené nebo snížené. Ve všech 5 byly destičkové hodnoty charakterizovány jako adekvátní. Ve zbývajících 3 pokusech byly hodnoty počtů destiček (ticíce/ml) nás 1edovné:

ošetření	pes #	kontrola	45’
SA 504/300591	10174	435	376
SA 504/020791	10003	198	243
SA 504/020791	98701	210	298

(C) Diskuse

Předložené studie liposomových přípravků provedené na bdících psech s DMPC/DPPC, DPPC a EPC liposomovými vesikly demonstruji dramatickou, přechodnou hypotenzivní odezvu u asi 40-60 % testovaných zvířat. Předložená studie, ve které byli bdící psi sledováni na akutní hemodynamické a EKG změny ukazuje, že intravenózní infuze SA 504/300591 a SA 504/020791 liposomové přípravky neprodukují žádné podstatné změny v hemodynamických proměnných (krevní tlak a srdeční rychlost), EKG intervalech nebo EBC a WBC hodnotách a jsou proto dobře tolerovány a prosty škodlivých hemodynamických účinků.

Příklad 6

Bylý připraveny dva liposomové přípravky a testovány na psím modelu na hemodynamické účinky.

Přípravek 1: Liposomy, obsahující pouze fosfatidinylcholin v koncentraci asi 25 mg/ml.

Přípravek 2: Liposomy s fosfatidylcholinem a kyselinou stearovou. Molární obsah byl asi 9:1 při celkové koncentraci

1ipidu as i 70 mg/ml.

Tyto přípravky byly infundovány intravenozně pěti psů, každý v dávce asi 50 mg lipidu na kg tělesné hmotnosti (přípravek 1) a asi 30 mg lipidu na kg (přípravek 2).

Na psech byly pozorovány následující účinky.

Přípravek 1: Přechodný pokles v krevním tlaku spojený s významnou reflexní tachykardií u 3 z 5 testovaných zvířat. Další pozorované účinky u těchto 3 zvířat zahrnují: prematurované ventrikulární arytmie během infuze a krátce po podání u 1 psa a zvýšenou respiraci ve formě zrychleného dechu u 2 dalších psů. U žádného ze psú nebyly žádné fyziologicky významné změny v EKG intervalech. Počet destiček klesl u 4 z 5 psú, kteří dostali přípravek. Tito psi vykazující hemodynamickou depresi se zdáli být utlumeni a měli nejkonzistentnější destičkovou depleci ve srovnání se psi, kteří nevykazovali pokles krevního tlaku.

Přípravek 2: Intravenozní podání tohoto přípravku nemělo žádné nežádoucí účinky na žádné z pěti ošetřených zvířat.

Příklad 7

V tomto příkladu byly zkoušeny kardio-hemodynamické —________účinky liposomú připravených z nasyceného nenabitého fosfolipidu DSPC samotného nebo v kombinaci s negativně nabitým fosfolipidem DSPG (9:1).

Příprava liposomú: Liposomy, které byly použity v této studii byly připraveny metodou kontinuální vysokotlaé extruze.

Stručně, ethanolický roztok příslušného lipidu nebo lipidová směs byy umístěny na stěnu baňky s kulatým dnem. Výsledný lipidový film byl dispergován ve 300 mM mannitolovém roztoku za získání lipidové koncentrace přibližně 100 mg/ml. Výsledné MLV disperze byly následně extrudovány za použití zařízení pro vysokotlakovou extruzi (Maximator^R model HPE 10,0-250, Schmidt, Kranz & Co. Zorge, Německo). Každá vsázka byla následně extrudována lOkrát přes dvě na sobě položené polykarbonátové membrány (Nucleopore, Tlibingen, Německo) se snižující se velikosti orů (1,0 - 0,4 a 0,1 pm) za poskytnutí celkem 30 filtrových pasží pro každý přípravek. Na konci extruzního procesu byly získané liposomální přípravky filtrovány přes sterilní filtrových držáku (0,4 nebo 0.2 pm velikost pórů, acetát celulózy, Sartorius Gottingen, Německo) do sterilních skleněných lahviček, které byly uzavřeny za aseptických podmínek.

Lipidové substance

Všechny fosfolipidy byly skladovány při teplotě pod -20 °C a použity bez dalšího čištění.

Distearoylfosfatidylcholin (DSPC - vsázky LP—04—013—114219 a -116298) a distearoylfosfatidyl-glycerol (DSPG - vsázka LP 04-017-115751) byly získány od Sygena, Liestal, Švýcarsko.

Velikost liposomů byla stanovena fotonovou korelační spektroskopií (PCS) za použití zařízení submicron part ic1e-sizer, autodilute™ model 370, Nicomp Instr. Corp., Santa Barbara, CA, USA.

Osmolalita (mOsm/kg) vzorku a pH hodnoty byly stanoveny s osmometrem s automatickým bodem mrazu (automatic freezing point osmometer - Knauer, Berlín, Německo) a pH metrem 761

Calimatic (Knick, Berlín, Německo).

Pokusy na zvířatech

Osmnáct samců krys (kmen: Han-Wistar, cov: Schering SPF, standardní potrava a podmínky chovu), s tělesnou hmotností 360 až 430 g byly náhodně rozděleny do tří skupin s n=6 zvířat na skupinu.

Krysy byly anestetizovány pentobarbitalem 60 mg/kg intraperitoneálně. Trachea byla kanylována pro usnadnění spontánní respirace. Tělesná teplota byla udržována na 38 +

0,5 °C pomocí vytápěného operačního stolu a topné lampy.

Byly zaznamenávány levý ventrikulární tlak a krevní tlak ve femorální arterii přes polyethylenem naplněné katetry připojené ke Stathamovým tlakovým převaděčům. Srdeční výdej byl stanoven metodou termodiluce (termistorový katetr v abdominální aortě, injekce ledově studeného salinického roztoku do pravého atria). Zvířata byla heparinizována i.v. bolusem 400 j./kg.

Krysy byly sledovány pro záznam/výpočet následujících parametrů (BPsyst. (systolický krevní tlak, mmHg), BPstřední (střední krevní tlak, mmHg), BPdiast. (diastolický krevní tlak, mmHg) HR (srdeční rychlost, 1/min), CO (minutový výdej/100 g tělesné hmotnosti, ml/min/100 g), LVEDP (levý ventrikulární konečný diastlický tlak, mmHg), TPR (celková periferní rezistence, dyn*s*cm^-510³), EKG (elektrokardiogram, ms) a dP/dt max (zvýšení maximání rychlosti levého ventrikulárního tlaku, mmHg/s).

Chirurgie a instrumentace byla následována 30-min ekvilibrační periodou, na jejímž konci byly hodnoty před ošetřením. Data byla zaznamenávána po 45 min po podání liposomů nebo mannitolu (objemová kontrola). Každé zvíře bylo ošetřeno pouze jednou.

Krysy byly infundovány liposomovou dávkou, obsahující celkové množství 300 mg lipidu/kg tělesné hmotnosti a při injekční rychlosti 100 mg lipis/kg/min do levé femorální vény. Kontroly dostaly stejný objem 300 mM mannitolového roztoku. Hodnocené liposomové přípravky byly vyrobeny z DSPC nebo DSPC/DSPG.

Statistiky

Byly vypočteny průměrné procentové hodnoty versus počáteční hodnoty (s výjimkou pro LVEDP, který byl vyjádřen jako absolutní změna od hodnot základní linie před ošetřením). Data byla porovnána s kontrolní skupinou. Bartlettúv test byl proveden pro testování stejných variací a byla použita jednosměrná analýza variance (ANOVA) pro demonstrování statistických rozdílů. Výpočty statistické významnosti byly provedeny za použití Studentova t-testu. p hodnota pod 0,05 byla považována za statisticky významnou. Hodnoty na obrázcích jsou vyjádřeny jako průměrná.procenta změn od původní hodnoty ± SEM.

Výsledky

Kontrolní pokusy

Mannitol 300 mM (objemová kontrola) nepůsobí významnou odchylku kardio-hemodynamickcých parametrů od původních hodnot. bPstřední se zvyšuje maximálně o 1,8 % (obr.2),

BPsyst. o 2,3 % a BP diast. se snižuje o -2,2 % v prvních 10 min po podání. HR se snižuje o -3,4 %. TPR (obr.3) a LVEDP

J J (obr.4) responduje s krátkodobým zýšením 5,5 % a 2,8 mmHg (tab.17). Kontrakt i 1ita se snižuje o -3,3 X.

DSPC liposomy

Použití nasycených DSPC vede k neutrálním, gelovitým liposomům, které vedou k významných srdečním a hemodynamickým poruchám, jsou-li infundovány v dávce 300 mg lippid/kg do krys. BPstřední a TRP byly významně sníženy o -53,7 % a -46,3 X (obr.2 a 3). Kontrakt i 1 i ta byla snížena o -34,7 X 5 minut po počátku infuze. Během této doby byl LVEDP (obr.4) významně zvýšen (p < 0,05). Všechny tyto účinky byly spojeny s obtížnou srdeční arytmií. Byly to ventrikulární extrasystol, ektopické údery, AV kondukční zpoždění a selhání vedení k ventriklu. Nicméně byly HR a CO pouze slabě ovlivněny během prvních 10 minut po podání. Na konci těchto 10 min periody se BP a kontrakt i 1 i ta navrátily na základní hodnoty. HR se nicméně začne slabě zvyšovat nad základní hladinu (asi 10 X) a stejně tak kontrakt i 1 i ta. Do konce periody pozorování 45 min p.a. byla kontraktilita zvýšena o +66,3 X nad základní hladinu (p < 0,01). TPR se však nevrací na základní hladinu na konci periody pozorování.

DSPC/DSPG liposomy

Přídavek negativně nabitého fosfolipidu (10 X mol) k DSPC redukuje významně nebezpečnost kardio-hemodynamických vedlejších účinků DSPC. PB a TPR se snižují po krátkém přechodném zvýšení o -33,3 X a -35,5 X původní hodnoty (obr. 2 a 3). Kontrakt i 1 i ta se během prvních 10 minut po aplikaci snižuje o -14,3 X. Vrací se na normální hodnoty a byla zvýšena za 30 min p.a. HR je také v souladu se zvýšením v pozdějších časových bodech. Elektrokardiografické změny se objevují u čtyř ze šesti krys během liposomové infuze. účinky byly interpretovány jako vodivé a nevodivé atriální předčasné stahy u třech zvířat a u jednoho zvířete jako komplexní arytmie produkovaná párovými atriálnimi předčasnými stahy. Všechny EKG-účinky se objevují po skončení infuze.

Přídavek negativního náboje k DSPC liposomúm významně zlepšuje kardio-hemodynamické vedlejší účinky přípravku u krys.

Předcházející příklady mohou být opakovány s podobným úspěchem za nahrazení genericky nebo specificky popsaných reaktantú a/nebo pracovních podmínek podle tohoto vynálezu za ty, které byly použity v předchozích příkladech.

Z předchozího popisu může odborník v oboru snadno seznat podstatné charakteristiky tohoto vynálezu a bez narušení ducha a jeho rozsahu může provést různé změny a modifikace vynálezu pro jeho úpravu pro různá použití a podmínky.

Tabulka 1

A.Systolický tlak

Ošetření	pes#	základ	infuze	0’	15’	30'	45'
'DMPC/DPPC	97547	137	140	145	135	135	145
ir	97481	145	60	115	125	125	130
ti	97557	120	55	85	115	108	100
prům.+S.E.		134±7	85+28	115+17	125+6	123+8	125+13
DPPC	9751 1	125	85	95	100	120	120
II	97454	140	55	70	115	115	120
>1	97502	150	45	50	100	125	115
prům.+S.E.		138+7	62+12	72±13	105+5	120+3	118+2

Tabulka 2

Β.Diastolický tlak

Ošetření	pes#	základ	infuze	0'	15'	30'	45’
DMPC/DPPC	97547	120	140	120	115	105	120
ti	97481	100	35	90	90	80	80
II	97557	90	35	60	85	65	75
prům.+S.E.		103+9	. 63+28	90+17	97+9	83+12	92+14
DPPC	9751 1	90	70	70	80	85	85
II	97454	80	25	45	75	75	75
H	97502	80	35	; 40	75	85	75
prúm.+S.E.		83±3	43+14	52+9	82 + 3	120+3	78+3

Tabulka 3 C, Střední tlak

Ošetření	pes#	základ	infuze	0'	15'	30'	45'
DMPC/DPPC	97547	126	127	128	122	115	128
II	97481	115	43	98	102	95	97
II	97557	120	42	68	95	79	83
prům.+S.E.		114+8	71+28	98+17	106+8	96+10	103+13
DPPC	9751 1	102	75	78	87	97	120 97
n	97454	100	35	53	88	88	90
r#	97502	103	38	43	83	98	88
prúm.+S.E.		102+1	49+13	58+10	86+2	94+3	92+3

Tabulka 4

Ošetření	pes#	základ	infuze	0'	15’	30'	45'
DMPC/DPPC	97547	120	115	HO	120	110	110
II	97481	110	180	170	160	180	180
rr	97557	100	60	80	70	100	100
prům.+S.E.		110±6	122+35	12O±26	117+26	130+25	130+25
DPPC	9751 1	100	100	60	70	70	80
ti	97454	85	180	220	190	210	160
II	97502	100	110	110	65	100	75
prúm.+S. E.		95+5	130+25	130+47	108+41	127+43	105+28

Tabulka 5 A. PR interval Ošetření pes#	základ	0'	15'	30'	45'
DMPC/DPPC	97547	103	115	105	118	105
II	97481	94	90	88	83	80
II	97557	92	92	95	80	77
prům.+S.E.		96+3	99+8	96+5	94+12 87+9
DPPC	97511	102	113	118	117	107
II	97454	90	78	78	75	80
II	97502	103	90	110	105	107
prúm.+S.E.		98+4	94+10	102+12	99+12 98+9

B. QRS trvání

Ošetření	pes#	základ	0‘	15'	30'	45'
DMPC/DPPC	97547	40	40	40	40	40
f t	97481	44	45	47	43	43
II	97557	41	43	43	40	40
prům.+S.E.		42 + 1	43+1	43+2	41±1	41±1
DPPC	9751 1	41	40	40	43	43
ii	97454	45	36	42	42	40
n	97502	42	38	39	40	40
prům.+S.E.		43 + 1	38+1 :	40±l	42±1	41 + 1

C. QT interval

Ošetření	pes#	základ	0' 15' 30'	45 '
DMPC/DPPC	97547	197	203 213 217	213
H	97481	173	195 198 188	187
H	97557	227	248 247 232	220
prům.+S.E.		199±16	215+17 219+15 212+13	207±10
DPPC	9751 1	205	228 228 222	207
n	97454	223	177 188 195	202
II	97502	220	209 222 227	233
prům.+S.E.		210+6	205+15 213+12 215±10	214±10

D. QTc interval

Ošetření	pes#	základ	0'	15'	30’ 45'
DMPC/DPPC	97547	292	309	272	244 253
II	97481	255	298	290	302 313
ir	97557	248	272	285	285 333
prům.+S.E.		249+3	293+11	282+5	277+17 300+24
DPPC	9751 1	245	281	255	254 240
ir	97454	262	340	335	287 264
If	97502	285	275	215	242 258
prúm.+S.E.		264+12	299+21'·	268±35	261+13 254+7

Tabulka 6 A DMPC/DPPC

Parametr	základní	45’po	p-hodnota (párovaný-t)	@24 h
počet bílých	12,5+4,0	16,3+4,0	0,009	16,4+3,2
krvinek
počet Červených	5,96+0,08	5,97+0,27	0,974	6,12+0,13
krvinek
hematokryt	42,9+1,0	43,3+2,1	0,818	42,0+0,4
destičky	252+87	140+47	0,203	227+58

Β.DPPC

Parametr základní 45'po p-hodnota @24 h (párovaný-t)

počet bílých	8,95+1,6	7,1±1, 3	0,444		9,	6+1,0
krvinek
počet červených	5,66+0,31	5,84+0,36	0,335		6,11+0,4
krvinek
hematokryt	41,2+1,4	42,2±1,7	0,433		42,8+2,0
destičky	244+38	69± 7	0,041		173±27
Tabulka 7
Systolický tlak	(mmHG) u	EPC-ošetřených psů
USDA#	základní	infuze	0’	15'	30'	45'
97513	140	70	130	140	140	145
97682	150	57	í 05	140	145	150
97492	165	65	145	180	185	190
97804	140	143	145	130	143	143
97684	150	145	140	140	143	140
prumér+SEM	149+5	96+20	133+8 146+8	151+8	154+9
Diastolický tlak (mmHG) u	EPC-vesikly	ošetřených psu
USDA#	základní	infuze	0’	15'	30’	45'
97513	95	35	100	90	100	90
97682	85	35	85	75	75	90
97492	95	42	90	115	105	110
97804	90	92	93	80	80	90
97684	92	90	88	80	75	70
prúměr+SEM	92+2	59+13	91+3	88+7	87+6	91+6

Tabulka 9

Hodnoty průměrného arteriálního tlaku	(mmHG)	u EPC-ošetřených psů
USDA#	základní	infuze	0’	15'	30'	45 '
97513	110	47	110	107	113	116
97682	107	42	92	97	98	110
97492	118	50	108	137	132	137
97804	107	110	110	97	101	108
97684	113	110	105	100	98	93
průměr+SEM	111+2	72±16	105+3	108 + 8	108+7	113+7

Tabulka 10

Hodnoty srdeční rychlosti (údery/minuta) u EPC-ošetřených psú

USDA#	základní	infuze	0'	15'	30'	45 '
97513	135	310	130	120	120	130
97682	90	220	50	65	100	130
97492	166	273	76	132	112	105
97804	113	115	139	109	94	118
97684	100	100	111	88	85	92
průměr+SEM	121±14	204+42	101+17 1O3±12	102±6	115+7
Tabulka 11
A PR (ms) hodnoty u EPC ošetřených psů
USDA#	základní	0'	15' 30'	45'
97513	85	83	87 93	92
97682	93	135	128 105	88
97492	87	101	87 85	81
97804	119	115	116 120	119
97684	107	101	96 100	97
prům.+SEM	98±5	107±9 .	103±8 101±6	95+6

i

B QRS (ms) hodnoty u EPC ošetřených psu

USDA#		základní	0'	15'	30'	45'
97513		35	40	37	39	40
97682		30	30	33	33	33
97492		35	35	35	35	35
97804		33	33	34	34	35
97684		34	34	35	35	33
prům<	+SEM	33+1	34+2	34+2	35+1	35+1
C.	QT	(ms) hodnoty u	EPC ošetřených	psu
USDA#		základní	0'	15 ’	30'	45'
97513		195	197	200	209	197
97682		210	260	247	215	200
97492		163	228	188	170	180
97804		163	228	188	170	180
97684		210	211	235	232	226
prúm.;	+SEM	196+9	219+11	217±11	209+11	202+7
D.	QTC	(ms) hodnoty	u EPC ošetřených	i psů
USDA#		základní	0'	15'	30'	45'
97513		289	293	276	299	285
97682		270	233	298	320	283
97492		266	260	227	231	224
97804		267	296	261	289	302
97684		292	298	275	287	273
prúm.;	+SEM	277+6	276±13	267+12	285+15	273+13

Tabulka 12

Počty krvinek u·'EPC ošetřených psů

	Základní	45 '	24h
USDA#	WBC	WBC	WBC
97513	10	13	13
97682	18	21	22
97492	20	19	18
97804	29	26	26
97864	9	9	11
prům.+SEM	17+4	18+3	18+3
USDA#	RBC	RBC	RBC
97513	6	6	6
97682	6	6	6
97492	6	6	7
97804	6	6	6
97864	6	6	7
prům.+SEM	6+1	6±1	6+2
USDA#	hematokryt	hematokryt	hematokryt

97513 44 42 39

97682 44 42 38

97492 47 46 46

97804 41 41 38

97864 43 41 46 prům.+SEM 44+1

43+1 41+2 f

ilka 13 ^rstolický tlak

:ření	pes#	základ	infuze
»4/	98661	150	170
!91
H	9841 1	130	140
ir	98741	140	140
II	98783	145	135
tr	10174	162	155
i.+S.E.		145+5	148±6
;04/	98682	205	195
'91	10003	150	145
	98701	155	155
i. +S. E.		170+18	165+15

0'	15'	30’	45’
175	165	155	155
145	145	150	140
140	145	140	140
160	140	145	170
145	145	145	145
153+6	148+4	149+4	152±6
210	190	200	195
152	150	155	155
145	145	140	145
169±21	162±14	165±18	165+15

astolický tlak

ření	pes#	základ	inf uze	0'	15’	30'	45'
4/	98661	100	100	125	100	95	90
91
11	9841 1	65	70	80	80	80	70
11	98741	90 ·	90	90	90	85	95
II	98783	70	75	90	70	70	90
ri	10174	90	95	85	85	85	85
i.+S.E.		83+7	86+6	94±8	85+5	83+4	86+4
04/	98682	105	130	115	105	105	110
91	10003	103	100	105	98	98	103
	98701	85	90	80	98	107	109
i.+S.E.		98+6	107+12	100±l0	98+4	96+6	101+6

C.Střední tlak

Ošetření	pes#	základ	infuze	0’	15’	30'	45'
SA504/ 300591	98661	117	123	142	122	118	115
i»	9841 1	87	93	102	102	103	93
II	98741	107	107	107	108	103	110
II	98783	95	95	113	93	95	117
II	10174	114	115	105	105	105	105
prům.+S.E.		104+6	107+6	114+7	106±5	105+4	108+4
SA 504/ 020791	98682	138	152	: 147	133	137	138
II	10003	119	115	121	115	117	120
II	98701	108	112	102	108	103	108
prům.+S.E.		122+9	126+13	123+13	119+7	119+10	122+9
Tabulka 14
Ošetření	pes#	základ	infuze	0'	15'	30'	45'
SA504/ 300591	98661	90	102	120	110	83	75
II	9841 1	75	61	67	77	103	60
II	98741	120	142	120	105	138	127
kl	98783	80	48*	140**	96	66	84
'1	10174	88	80	79	89	90	76
prům.+S.E.		91+8	87±17	105+14	95+6	96+12	84+11
SA 504/	98682	127	120	127	98	138	113
020791
n	10003	164	136	149	102	108	90
II	98701	101	106	125	112	113	120
prům.+S.E.		131±1	121 + 9	134+8	1O4±4	120+9	108+9

*zvířata spící během infuze **vstup personálu do místnosti .( ¹

Tabulka 15

A. PR interval

Ošetření	pes#	základ	0’	15’	30'	45'
SA 504/	9S661	97	111	107	105	104
300591
H	9841 1	103	109	101	103	103
,1	98741	99	104	109	104	105
fl	98783	85	95	88	93	85
H	10174	97	107	111	105	107
prům.+S. E.		96+3	105±3	102+4	102+2	101±4
SA 504/	98682	89	85	91	92	92
020791
1,	10003	104	109	121	108	119
11	98701	116	125	116	120	115
prům.+S.E.		103+8	106+12	109+9	107±8	109±8
B.QRS trvání		. ....			;;-s.
Ošetření	pes#	základ	0’	15’	30'	45’
SA 504/	98661	32	32	32	29	29
300591
1»	98411	31	31	33	31	31
řř	98741	33	33	29	29	31
II	98783	28	28	25	28	28
It	10174	24	23	24	25	24
prům.+S.E.		30±2	29+2	29+2	28+1	29+1
SA 504/	98682	27	27	28	28	31
020791
11	10003	29	31	28	29	29
1'	98701	24	25	23	25	25
prům.+S.E.		27±1	28±2	26+2	27+1	28±2

Tabulka 15 (pokračování)

C. QT interval

Ošetření	pes#	základ	0'	15’	30'	45'
SA 504/	98661	172	160	171	175	187
300591
It	9841 1	195	199	193	181	197
ti	98741	181	187	185	192	184
μ	98783	183	189	191	197	195
ti	10174	176	184	176	173	167
prům.+S.E.		181±4	184±6	183+4	184±5	186±5
SA 504/	98682	160	159	164	164	163
020791
H	10003	189	196	199	201	205
11	98701	183	187	185	185	188
prům.+S.E.		177±9	181±11	183+10	183±11	185±12

D. QTc interval

Ošetření	pes#	základ	0'	15 '	30'	45'
SA 504/	98661	233	235	251	229	252
300591
ir	9841 1	228	236	234	248	245
M	98741	252	279	230	256	254
ir	98783	218	289	232	233	234
TI	10174	234	195	226	216	217
prům.+S.E.		233±6	247+17	235+4	236+7	240+7
SA 504/	98682	232	238	202	241	215
020791
tr	10003	270	278	277	239	266
II	98701	262	244	251	267	229
prúm.+S.E.		255+12	253±12	243+22	249+9	237±1

Tabulka 16

A. RBC (milion/ml)

Ošetření	pes#	kontrola	45’
SA 504/300591	98661	6,5	6,4
1'	9841 1	6,1	6,2
H	98741	6,7	6,7
M	98783	6,6	6,7
»ř	10174	7,3	6,6
prúm,+S.E.		6,6+0,2	6,5+0,1
SA 504/020791	98682	6,9	6,9
	10003	5,7	5,7
	98701	6,8	6,6
prům. +S.E.		6,5 +0,4	6,4+0,4
B. WBC (tisíc/ml)		... . . -
Ošetření	pes#	kontrola	45’
SA 504/300591	98661	9,2	12,8
u	9841 1	13,9	19,2
H	98741	9,0	10,1
11	98783	9,8	8,6
11	10174	13,8	27,3
prúm,+S.E.		11,1+1,1	15,6±3,4
SA 504/020791	98682	9,8	13,6
	10003	10,8	17,3
	98701	6,8	9,1
prům. +S.E.		9,1 + 1,2	13,3+2,4

Tabulka 17

	BP prúm. (%)	HR (%)	LVEDP dP/dt	CO TPR (%) (%)
( mmHg)	max (%)
vehikulum	+ 1,8	-3,4	+ 2,8	-3,3	-4,5 +6,5
(mannitol 300 DSPC vs.	mM) -53,7***	-7,2	+ 12,5	*-34,7*	*-13,2 +15,3
kontrola DSPC/DSPG vs. kontrola	+ 12,3 (2 min)*	-3,6	+5,3	-14,3**	(lmin)* -48,3 (7min)*** +11,8(2min) -4,8-35,5(7min)
DSPCvs.	-33,3 (6 min)*** * * *	n. s.	*	n. s.	* n. s .

DSPC/DSPG n=7, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, Studentův t-test

Maximum procentické změny hemodynamických a srdečních parametrů během prvních 10 min po začátku infuze liposomu vyrobených z různých lipidů (300 mg lipid/kg, 100 mg 1ipid/kg/min) do femorální vény.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Liposomový přípravek, který jinak neobsahuje elektricky nabitou složku a který má škodlivé systémové účinky, je-li podáván savci, vyznačující se tím, že obsahuje v uvedeném liposomú inkorporovaný podíl elektricky nabité složky účinný pro snížení uvedených systémových účinků, kde uvedený podíl je navíc k jakémukoliv množství uvedené složky v uvedeném liposomú.
2. 2. Liposomový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka má negativní náboj.

   tím, že

   Liposomový přípravek podle nároku elektricky nabitá složka je mastná

   1, vyznačuj ící kyselina.

   se
3. 4. Liposomový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka je stearová kyselina.
4. 5. Liposomový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahující účinné činidlo
5. 6. Liposomový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahující kontrastní činidlo.

   ^! '
6. 7.' Liposomový přípravek, který obsahuje elektricky >

   nabitou složku a který má škodlivé systémové účinky, je-li podáván savci, vyznačující se tím, že obsahuje v uvedeném liposomú inkorporovaný podíl elektricky nabité složky účinné pro snížení uvedených systémových účinků, kde uvedený podíl je navíc k jakémukoliv množství uvedené složky v uvedeném ť * liposomů.
7. 8. Liposomový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka má negativní náboj.
8. 9. Liposomový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka je mastná kyselina.
9. 10. Liposomový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka je stearová kyselina.
10. 11. Liposomový přípravek podle nároku 7, vyznačující ' se tím, že dále obsahuje účinné činidlo.
11. 12. Liposomový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že dále obsahuje kontrastní činidlo.
12. 13. Liposomový přípravek podle nároku 1 nebo 7, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka inkorporovaná do uvedeného liposomového přípravku je kyselina stearová a tato složka je inkorporována v takovém množství, že liposom obsahuje fosfatidylcholin, cholesterol a kyselinu stearovou v molárním poměru asi 4:5:1.
13. 14. Liposomový přípravek podle nároku 1 nebo 7, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka inkorporovaná do uvedeného liposomového přípravku je kyselina stearová a tato složka je inkorporována v takovém množství, že liposom obsahuje fosfatidylcholin a kyselinu stearovou v molárním poměru asi 9:1.
14. 15. Liposomový přípravek podle nároku 1 nebo 7, vyznačující se tím, že elektricky nabitá složka

    0..

    inkorporovaná do uvedeného liposomového přípravku je DSPG a tato je inkorporována v takovém množství, že liposom obsahuje DSPC a DSPG v molárním poměru asi 9:1.