CZ147899A3 - Konjugát hedgehog proteinu vyznačující se zvýšenou aktivitou, způsob jeho přípravy a jeho terapeutické využití - Google Patents

Abstract

Konjugát hedgehog proteinu, kde tento konjugát zahrnuje: a) polypeptid složený z 10 až 30 hydrofobních aminokyselin a/nebo aminokyselin, které vytvářejí transmembránové helixy ajsou kladně nabité, b) 1 až 4 alifatické, nasycené nebo nenasycené uhlovodíkové zbytky s řetězcem o délce 8 až 24 uhlíkových atomů a s hydrofobními vlastnostmi, c) hydrofobní thiosloučeninu, kovalentně navázané na protein.

Description

tou, způsob jeho přípravy a jeho terapeutické využití.

Oblast techniky

Vynález popisuje konjugát hedgehog proteinu se zvýšenou aktivitou, způsob jeho přípravy a jeho terapeutické využití.

Dosavadní stav techniky

Hedgehog (hh) proteiny představují rodinu sekretovaných signálních proteinů, které jsou zodpovědné za vznik četných tvarů a struktur během embryogeneze (Smith J. C., Cell, 76: 193 až 196, 1994; Perrimon Ν., Cell, 80: 517 až 520, 1995; Chiang C. a další, Nátuře, 83: 407, 1996; Bitgood M. J. a další, Curr. Biol., 6: 296, 1996; Vortkamp A. a další, Science, 273: 613, 1996; Lai C. J. a další, Development,

121: 2349, 1995). Během jejich biosyntézy dochází nejprve k odštěpení signální sekvence, pak následuje autokatalytické štěpení za vzniku 20 kD N-koncové domény a 25 kD C-koncové domény. Po odštěpení C-koncové domény je, v přirozeně se vyskytujícím proteinu, N-koncová doména modifikována na svém C-konci cholesterolem (Porter J. A. a další, Science, 274: 255 až 259, 1996). U vyšších organismů nacházíme alespoň tři zástupce rodiny hh proteinů: sonic, indián a desert hh (shh, Ihh, Dhh; Fietz M. a další, Development (Suppl.): 42 až 51, 1994). Byl pozorován rozdíl mezi aktivitou rekombinantních hedgehog proteinů produkovaných v prokaryotech a eukaryotech (Hyneš M. a další, Neuron, 15: 35 až 44, 1995; a Nakamura T., Biochem. Biophys. Res. Comm., 237: 465 až 469, 1997).

Hyneš a další srovnali aktivitu eukaryotního hh proteinu v supernatantu z transformovaných lidských embryonálních ledvinových buněk 293 s hh proteinem získaným expresí v E. coli. Hh protein ze supernatantů linie ledvinových buněk vykazoval čtyřikrát vyšší aktivitu. Toto zvýšení aktivity může být způsobeno například potenciálním spolupůsobícím faktorem exprimovaným pouze v eukaryotních buňkách, určitou posttranslační modifikací, vyšším agregačním stavem (například kvůli vazbě na Ni-agarózu), či rozdílným N-koncem proteinu. Bylo totiž zjištěno, že hh isolovaný z E.coli obsahuje 50% formy, která může být na N-konci buď prodloužená o dvě aminokyseliny (Gly-Ser) nebo zkrácená o 5-6 aminokyselin.

Nakamura a další srovnali aktivitu shh v supernatantu transformovaných kuřecích embryonálních fibroblastů s aktivitou shh proteinu izolovaného z E.coli, který navíc obsahoval polyhistidinovou fúzi na N-konci. Shh ze supernatantu kultury fibroblastů byl ve stimulaci aktivity alkalické fosfatázy (AP, z angl. alkaline phosphatase) v buňkách C3H10T sedmkrát účinnější než protein purifikovaný z E.coli. Zvýšená aktivita byla připsána synergismu hh s proteiny typu morfogenetického proteinu kostí (BMP, z angl. bone morphogenetic protein). Tyto proteiny se vyskytují pouze v supernatantech eukaryotních buněk a ve spojení s hh způsobují vyšší indukci AP.

Kinto a další (FEBS Letters, 404: 319 až 323, 1997) popisují, že fibroblasty sekretující hh indukují při intramuskulární implantaci (v kolagenu) ektopickou tvorbu kosti.

Tato aktivita však nebyla pozorována u izolovaného hh proteinu .

Podstata vynálezu

Do rozsahu vynálezu spadá příprava hh proteinů (polypeptidů), které vykazují ve srovnání s doposud popsanými hh proteiny výrazně vyšší aktivitu.

Tohoto zvýšení aktivity je dosaženo umělou lipofilizací rekombinantního hedgehog proteinu. Lipofilizace je s výhodou prováděna chemickou modifikací. Konjugát hedgehog proteinu získaný takovým způsobem výhodně obsahuje kovalentně vázaný přídavný polypeptid (nejlépe na C-konci a/nebo na N-konci), který je tvořen 10 až 30 nejlépe hydrofobními aminokyselinami a/nebo aminokyselinami vytvářejícími transmembránové helixy. Tento přídavný polypeptid zvláště výhodně obsahuje 2 až 12 lysinů a/nebo argininů, ale žádnou polyhistidinovou část, která by byla vhodná pro purifikaci tohoto proteinového konjugátu na niklové chelatační koloně. Rovněž velmi výhodné může být kovalentní navázání (nejlépe na C-konec a/nebo na N-konec) 1 až 4 alifatických, nasycených nebo nenasycených uhlovodíkových zbytků o délce řetězce 8 až 24 uhlíkových atomů, případně navázání lipofilních (hydrofobních) steroidů. Dále je s výhodou možno k hh proteinům prostřednictvím oxidativně tvořených disulfidových můstků kovalentně vázat hydrofobní thiosloučeniny, zvláště pak například thiocholesterol, thioalkany a thioalkeny (nejlépe na Ckonec a/nebo na N-konec a v tomto případě na N-koncový cystein) .

Protein, jehož hydrofobicita je zvýšena derivatizací takovýmito lipofilními zbytky, lépe interaguje s lipidovými membránami eukaryotních, zvláště pak savčích buněk.

Lipofilizovaným proteinem podle vynálezu se rozumí hydrof obizovaný protein, jehož povrchová hydrofobicita je vyšší než povrchová hydrofobicita nemodifikovaného proteinu. Tato jeho modifikace zvyšuje jeho afinitu k apolárním molekulám nebo amfifilům. Zvýšení lipofility proteinu je měřitelné mírou integrace proteinu do lipidové dvojvrstvy, způsobem popsaným například v publikaci Haque Z. a další, J. Agric. Food Chem., 30: 481, 1982. Způsoby hydrofobních modifikací (lipofilizace) proteinů jsou popsány například v publikacích: Haque Z. a další, J. Agric. Food Chem., 31: 1225 až 1230, 1983; Webb R. J. a další, Biochemistry, 37: 673 až 679, 1998; Hancock J. F., Cell, 63: 133 až 139, 1990; kniha A practical guide to membrane protein purification, editoři Jagow G. v., Schágger Hermann, kapitola 16, strany 535 až 554, 1994.

Překvapivě se ukázalo, že takto lipofilizované hedgehog proteiny (dále označované rovněž hedgehog konjugáty (hh konjugáty)) vykazují ve srovnání s nemodifikovanými hedgehog proteiny (například po expresi v cytoplazmě E. coli) velmi výrazně zvýšenou aktivitu, to jest alespoň 10-krát a v nejlepším případě 10³ až 10⁵-krát, zejména pak, jsou-li tyto proteiny použity ve farmaceutickém přípravku a in vitro. Dále je velmi překvapující, že hedgehog konjugáty podle vynálezu mohou nalézt zvlášť výhodné použití při lokální terapii, a to zejména kostí, chrupavek, nervových buněk (při nervových lezích a neurodegenerativních onemocněních) nebo svalové tkáně.

Je známo, že k dosažení farmaceuticky účinné aktivity hedgehog proteinů in vivo je nutné udržet jejich vysoké lokální koncentrace v místě působení po dobu alespoň 16 hodin (Yang a další, Development, 124: 4393 až 4404, 1997). Nosičové systémy použité pro tento účel, t. j. hedgehog protein navázaný na chromatografická média Affigel CM (Yang a další), Ni-agarózu (Marti a další, Nátuře, 375: 322 až 325, 1995), Affigel Blue (Lopez-Martinez a další, Curr.

Biol, 5: 791 až 796, 1995) nebo částice heparin agarózy použité stejnými autory, nejsou příliš vhodné pro farmaceu4 • * • · · • · tické aplikace, poněvadž jsou imunogenní a mohou vyvolat zánětlivé reakce.

Konjugáty podle vynálezu slouží jako nové aktivní látky pro přípravu různých forem farmaceutických přípravků. Uvedené modifikace mají za následek obecné zlepšení farmakokinetického profilu hedgehog proteinu. Přítomnost hydrofobního uhlovodíkového řetězce umožňuje lokalizaci hedgehog proteinu na membránách cílových buněk. To usnadňuje jeho transport dovnitř buňky, ale také podstatně prodlužuje dobu jeho expozice na buněčném povrchu, což je pro farmakologickou účinnost optimální.

Konjugáty podle vynálezu nevyžadují ke svému pomalému uvolňování v těle vazbu na nosič. Hedgehog konjugáty podle vynálezu jsou dlouhodobě (několik dní) vysoce aktivní v místě svého působení v těle bez toho, aby bylo nutno je postupně uvolňovat z nějakého nosiče. Pro lokální aplikaci hedgehog konjugátů podle vynálezu je nicméně výhodné použít farmaceutický přípravek, který obsahuje konjugát podle vynálezu spolu s nosnou matricí. Nosná matrice slouží v podstatě k usnadnění lokální aplikace, zvláště tím, že dodává farmaceutickému přípravku vhodnou minimální viskozitu. Farmaceutický přípravek je pufrován v rozsahu pH nejlépe 4 až 9 a obsahuje jeden nebo více neionogenních detergentů jakými jsou například polyoxysorbáty nebo detergenty polyoxyethylénového typu (například Tween^s20, Tween^eO, Triton^X-lOO) , oktylglukosid nebo iontově aktivní detergenty jako například deoxycholát sodný, cholát sodný nebo taurocholát sodný.

Ve výhodném provedení je exprimovaný hh protein prodloužený o 10 až 30 zejména hydrofobních aminokyselin na svém Nkonci a/nebo C-konci, jelikož ty také bývají často začleněny do buněčných membrán (Webb a další, Biochemistry, 37: 673 až 679, 1998; Skolnick a další, Biol. Membranes, 536 až 554, 1996, editoři Merz a Roux). Hydrofobními aminokyselinami se

ve smyslu vynálezu rozumí aminokyseliny, které mají negativní volnou energii přechodu z vodné fáze do hydrofobní /organické fáze. Dále je pro zvýšení aktivity hh proteinů vhodné jako tyto N- nebo C-koncové extenze použít sekvence, o kterých je známo, že tvoří transmembránové helixy (například peptid M28) nebo takové sekvence, které ve formě helixu interaguji s povrchy membrán (například maginin 2; Skolnick a další 1996) .

V ještě výhodnějším provedení se N-konec a/nebo C-konec hedgehog proteinu modifikuje polypeptidovým zbytkem, který obsahuje 2 až 12 lysinů a/nebo argininů. V takovém případě je možné vynechat modifikaci uhlovodíkovým zbytkem.

Alifatický, nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek hydrofobní povahy o délce řetězce 8 až 24, lépe 10 až 24, nejlépe však 12 až 18 uhlíkových atomů, bývá nej častěji nasycený nebo mononenasycený až polynenasycený zbytek mastné kyseliny či alkylalkoholu, případně s vmezeřenými atomy kyslíku, síry nebo karbonylovou skupinou jako součástí řetězce. Zvlášť, preferované nasycené mastné kyseliny jsou kyselina kapronová, laurová, myristová, palmitová, stearová, arachidová a behenová. Preferované mononenasycené mastné kyseliny jsou kyselina myristová, palmitoleová a olejová. Zvlášť preferované polynenasycené mastné kyseliny jsou kyselina linolová, linolenová a arachidonová. Tyto zbytky masných kyselin se výhodně navazují jako estery, amidy kyselin, disulfidy nebo thioestery.

Počet hydrofobních uhlovodíkových řetězců navázaných na molekulu proteinu lze vhodně řídit reakčními podmínkami (např. zředěním) nebo tím, jaká konkrétní aminokyselina je modifikována. Například shh obsahuje tři cysteiny, z nichž N-koncový cystein je zvláště reaktivní. V tomto případě může být N-koncový cystein modifikován jedním nebo více uhlovodíkovými řetězci. Je rovněž možné statisticky modifikovat dva • · · ·

nebo dokonce všechny tři cysteiny. Při modifikaci jiných aminokyselin než cysteinu je výhodnější modifikovat definované aminokyseliny. Přesto je však možné k přípravě farmaceutických přípravků použít hedgehog proteiny, které mají počty modifikací uhlovodíkovými řetězci statisticky rozdělené od přibližně 1 do přibližně 4 řetězců na molekulu proteinu. Ačkoli je výhodné použít vyšší počet uhlovodíkových řetězců na molekulu, taková derivatizace může snížit rozpustnost farmaceutického přípravku, případně vést k deformacím ve trojrozměrné struktuře aktivního proteinu. Při derivatizaci alkylovými skupinami s dlouhým řetězcem (C₁₄ až C₂₄, nejlépe Ci₆ až C₂₄) se doporučuje navazovat pouze 1 až 2 uhlovodíkové řetězce. Naproti tomu při derivatizaci alkylovými skupinami s krátkým řetězcem se doporučuje navazovat 2 až 3 alkylové skupiny.

Ve výhodném provedení je rovněž možné derivátizovat jednu aminokyselinu dvěma hydrofobními uhlovodíkovými řetězci. Toho lze dosáhnout například připojením diglyceridu mastné kyseliny k jedné aminokyselině.

Jelikož jsou hedgehog proteiny velmi nestabilní, je výhodné při derivatizaci -SH skupinu N-koncového cysteinu chránit. Derivát této -SH skupiny je potom možno získat redukcí chráněné -SH skupiny těsně před nebo během derivátizačni procedury. Výhodně je možno -SH skupinu již zmíněného cysteinu chránit tvorbou homologního disulfidu hedgehog proteinu nebo tvorbou smíšeného disulfidu (například s glutathionem (GSH) nebo β-merkaptoethanolem).

Chránící skupiny pro thiolové skupiny jsou obecně známé a zahrnují například trifenylmethyl (trityl) a s-t-butyl, s-p-nitrobenzyl a s-p-methoxybenzyl (viz. například Greene a Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, druhé vydání, John Wiley & Sons, New York, 1991; a Atherton a další, The Peptides, editoři Gross a Meienhofer, Academie Press, New

York, díl 19: 1 až 38, 1983) . Hedgehog proteiny, které mají chráněnou thiolovou skupinu nebo jsou homodimerizované, jsou cennými meziprodukty při přípravě hedgehog proteinů modifikovaných na -SH skupině a spadají rovněž do rozsahu vynálezu.

Vynález dále popisuje přípravu hedgehog proteinů modifikovaných na -SH skupině s využitím hedgehog proteinů, které mají -SH skupinu N-koncového cysteinu chráněnou nebo jsou homodimerizované za vzniku stabilních meziproduktů. V tomto procesu je chránící skupina odštěpena nebo je rozštěpen homologní dimer a vzniklý produkt dále reaguje s aktivovaným derivatizačním činidlem.

Pro modifikaci hedgehog proteinů s chráněnou -SH skupinou je výhodné použití následujících metod:

I. Redukce disulfidové vazby nebo odštěpení chránící skupiny v reakční směsi. Toto je výhodné, když k vazbě dochází prostřednictvím imidazolidů nebo derivátů koenzymu A (CoA).

II. Redukce disulfidu, izolace nechráněných monomerů v kyselém prostředí a okamžitá derivatizační reakce v neutrálním prostředí za použití aktivovaného disulfidu (např. pyridyldisulfidu) jako spojovacího agens.

Ukázalo se, že při derivátizaci prostřednictvím imidazolidů nebo derivátů CoA dochází většinou k dvojnásobné acylaci N-koncového cysteinu (přibližně 60-70%) . V prvním případě je navázaná hydrofobní látka vázána jako amid kyseliny a ve druhém případě jako thioester. Selektivní odštěpení thioesterově vázané hydrofobní látky umožňuje přípravu monohydrofobizovaných hedgehog proteinů. Takovéhoto selektivního štěpení lze dosáhnout použitím redukčních agens jako jsou například DTE nebo hydroxylamin.

Vazbou prostřednictvím aktivovaného disulfidu, například derivátů pyridyldisulfidů, získáme monoalkylderiváty. Popsa8 ný způsob podle vynálezu umožňuje navázat na hedgehog proteiny celou řadu hydrofobních látek jako jsou například steroidy a uhlovodíkové řetězce (např. mastné kyseliny), které obsahují thiolové funkční skupiny.

Vynález dále popisuje postup přípravy hedgehog proteinů nebo jejich N-koncových fragmentů modifikovaných přes -SH skupiny. Nejvýhodnější je použít fragment obsahující v podstatě celou N-koncovou doménu, přičemž thiolová skupina N-koncového cysteinu je chráněna. Protein modifikovaný tímto způsobem je izolován a po odštěpení chránící skupiny je derivátizován na N-koncovém cysteinu, nejlépe kovalentní modifikací -SH skupiny hydrofobní sloučeninou, například mastnou kyselinou nebo steroidem. Takováto modifikace je pokud možno reversibilní a vlivem fyziologického redukčního prostředí v savčí buňce a in vivo může dojít k jejímu odstranění, čímž vznikne nehydrofobizovaný hedgehog protein.

Do rozsahu vynálezu dále spadá způsob navazováni hydrofobních látek na hedgehog proteiny nebo jejich N-koncové fragmenty přes -SH skupinu N-koncového cysteinu. Tento proces je charakterizován tím, že thiolová skupina N-koncového cysteinu hedgehog proteinu je nejprve ochráněna, potom je tato -SH skupina redukována a zmíněný hedgehog protein se nechá zreagovat s aktivovaným derivátem dané hydrofobní látky za vzniku disulfidové vazby mezi oběma reakčními partnery. V nejvýhodnějš£m uspořádání je možné k takto derivatizovanému hedgehog proteinu připojit prostřednictvím amidové vazby ještě další molekulu hydrofobní látky.

Jako aktivované hydrofobní látky je výhodné použít například imidazolidové deriváty nebo deriváty koenzymu A (CoA) . Tyto aktivované sloučeniny se dají s výhodou použít při aplikaci metody I (viz dříve).

Jako aktivované hydrofobní sloučeniny je možné rovněž použít pyridyldisulfidové deriváty hydrofobních sloučenin.

Tyto se s výhodou používají v aplikaci metody II (viz dříve) .

Pro acylaci hedgehog proteinů pomocí imidazolidů je výhodné použít steroidy nebo přirozené či nepřirozené nasycené, mononenasycené nebo polynenasycené mastné kyseliny, zvláště pak nasycené mastné kyseliny s délkou řetězce 4 až 18, lépe však 8 až 18 uhlíkových atomů. Tímto způsobem mohou být získány konjugáty, jejichž uhlovodíkové řetězce mají délku 8 až 24 uhlíkových atomů.

Pro připojování hydrofobních sloučenin k hedgehog proteinům pomocí pyridyldisulfidů je výhodné použít merkaptosteroidy, zvláště pak thiocholesterol, dále přirozené či nepřirozené nasycené, mononenasycené nebo polynenasycené merkaptoalkany, zvláště pak nasycené uhlovodíkové řetězce o délce 8 až 24 uhlíkových atomů obsahující thiolovou skupinu.

Při přípravě konjugátů podle vynálezu je výhodné používat hedgehog protein v koncentracích 0,01 až 10 mg/ml, zvlášú vhodná je koncentrace 3 mg/ml. Koncentraci solí, nejlépe chloridu sodného, je vhodné udržovat mezi 0 až 2 mol/1. Molární poměr derivatizačního agens k proteinu je výhodně 1:2 až 20:1. Mezi preferované pufry patří HEPES, fosfátový pufr a MES. Derivatizační reakce je vhodné provádět v rozsahu pH mezi 4,5 a 8,5, nejlépe však v pH 6,5 až 7,5. Čas potřebný k uskutečnění reakce závisí na použitých podmínkách a například v případě dipalmitoylovaného shh se pohybuje od 5 minut do 5 dní. Vhodné teplotní rozmezí pro průběh reakce je 0 až 40 °C, přičemž při nižších teplotách, zvláště pod 10°C (např. 4°C), vznikají vedlejší produkty reakce jen v malém množství.

Přídavek detergentů je nadmíru výhodný pro průběh reakce ve smyslu vynálezu. Takovými reakčními činidly mohou být například iontově aktivní nebo neionogenní detergenty, přičemž upřednostňovány jsou zwitterionické detergenty. Tyto látky je výhodné používat v koncentracích 0,5 až 3 objemová %.

K reaktivním skupinám proteinu, jež lze využít k navázání jednoho nebo více uhlovodíkových řetězců či molekul steroidů, patří zejména skupiny hydroxylové, thiolové, karboxylové nebo aminové. Při derivatizaci tak dochází ke vzniku amidové, esterové, disulfidové či thioesterové vazby. Tyto reakce j sou odborníkům v oboru dobře známé a j sou popsány například v publikaci Wong S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boča Raton, FL., USA, 1993. Například mastné kyseliny mohou být navazovány s využitím thioesterů s koenzymem A (například palmitoylkoenzymu A), sukcinimidesteru nebo N-maleinimidu (například N-hydroxysukcinimidester kyseliny palmitové), případně s využitím anhydridu či imidazolidu mastné kyseliny nebo acylchloridu.

Reakční postupy využívající palmitoyl-CoA, stearoyl-CoA nebo myristoyl-CoA popisují například Ross a další, J. Neurosci. Res., 21: 35 až 44, 1988; Bizzozero a další, J. Biol. Chem., 262: 2138 až 2145, 1987; nebo pro tubulin Ozols J. a další, Molec. Biol. of the Cell, 8: 637 až 645, 1997. Derivatizace anhydridy mastných kyselin byla například popsána pro ovalbumin (Segawa A. a další, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 66: 189 až 199, 1981) nebo pro peptidy (Yadav S. P. a další, Biochem. Biophys. Res. Comm., 205: 1688 až 1695, 1994) . Lze rovněž nalézt velké množství příkladů pro acylaci sukcinimidestery mastných kyselin, například pro kasein (Haque Z. a další, J. Agric. Food Chem., 31: 1225 až 1230, 1983; Haque Z. a další, Agric. Biol. Chem., 46: 597 až 599, 1982). Vazbu na N-koncový cystein lze také uskutečnit přes aldehydovou skupinu fúzního partnera (např. palmitoyl-CysCHO) (Liu a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 6584 až 6588, 1994) . Vazby přes N-koncový serin lze dosáhnout kon11

verzí na aldehydovou skupinu, reakcí s hydrazidem (například palmitoyl-Cys-hydrazid) a stabilizací vzniklého hydrazonu (například redukcí NaBH₃CN) (Gaertner a další, Bioconjugate Chem., 3: 262 až 268, 1992).

Hydrofobní uhlovodíkový řetězec může být k reaktivním aminokyselinám šeřinu, threoninu, kyselině glutamové, kyselině asparagové, cysteinu, argininu nebo lysinu vázán různě, a to v závislosti na chemických vlastnostech obou reakčních partnerů, například ve formě etheru, thioetheru, esteru, thioesteru, disulfidu nebo amidu. Metody derivatizace specifických aminokyselin jsou popsány v publikacích Wong S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press lne., Boča Raton, FL, USA, 1993; a Lundblad, Techniques in Protein Modification, 1995.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou hydrofobní sloučeniny rozpuštěny v organickém rozpouštědle nebo směsi organického rozpouštědla a vody s obsahem více než 10 % organického rozpouštědla. Mezi nejvhodnější organická rozpouštědla patří dioxan, tetrahydrofuran nebo isopropanol. Při derivatizační reakci je tento roztok hydrofobní sloučeniny smíchán s roztokem pokud možno ochráněného hedgehog proteinu obsahujícím detergent tak, aby výsledný roztok obsahoval nejvýš 10 % organického rozpouštědla. Bylo zjištěno, že koncentrace organického rozpouštědla vyšší než 10 % způsobují precipitaci a/nebo denaturaci hedgehog proteinu.

V ještě výhodnějším provedení je k thiolové skupině, zvláště N-koncového cysteinu, za přítomnosti solubilizačních detergentů, zejména deoxycholátu sodného, cholátu sodného, taurodeoxycholátu sodného, oktylglukosidu nebo detergentů Triton® X-100 připojen thiocholesterol, a to prostřednictvím oxidativně vytvořeného disulfidového můstku. Oproti přirozeně se vyskytujícímu N-koncovému fragmentu hh proteinu, který je modifikován cholesterolem na C-konci, lze výše uvedeným

9 postupem připravit formu hh proteinu, která obsahuje thiocholesterol na N-konci. Tato forma má vzhledem k přirozené formě jen mírně zvýšenou aktivitu, ale lze ji připravit daleko jednodušeji a ve větších množstvích. Tato forma hh proteinu má díky labilitě disulfidových můstků v cytoplasmě nulový nebo jen velmi malý imunogenní potenciál.

Kvůli zvýšení rozpustnosti lipofilizovaných hh proteinů je dále možné provádět derivatizaci a/nebo následující purifikaci či formulaci farmaceutického přípravku v přítomnosti rozpustného anionického polysacharidů jakými jsou například suramin nebo heparin.

Aktivitou se ve smyslu vynálezu rozumí aktivita alkalické fosfatázy, kterou je daný polypeptid schopen indukovat v savčích buňkách (aktivita v testu na alkalickou fosfatázu).

V provedení této metody je buněčná linie myších fibroblastů kultivována v médiu obsahujícím hovězí fetální sérum. Analyzované vzorky jsou po sterilaci filtrací přidány ke kultuře. Asi po 5 dnech kultivace jsou buňky lyžovány a na základě štěpení chromogenního substrátu (pNP, p-nitrofenol) se v buněčném lyzátu stanoví aktivita alkalické fosfatázy (Asahina J., Exp. Cell. Res., 222: 38 až 47, 1996; a Nakamura T., 1997) .

Hedgehog proteinem se ve smyslu vynálezu rozumí sekretovaný signální protein (s 19 kD N-koncovou signální doménou), který je zodpovědný za vznik četných tvarů a struktur během embryogeneze. Zvlášť, výhodné je použiti sonic, indián a desert hh (Fietz M. a další, Development (Suppl.): 43 až 51, 1994). Zvláště výhodné je použít hh protein, jehož sekvence je popsána v databázi EMBL pod číslem L38518. Proteiny hedgehog rodiny vykazují výraznou homologii aminokyselinových sekvencí, což je důvod, proč je výhodné exprimovat nukleové kyseliny kódující hedgehog proteiny, které vykazují více než 80 % podobnost s výše zmíněnou sekvencí sonic hedgehog proteinu (shh). Homologii proteinů lze analyzovat pomocí programů Gap nebo BestFit (University of Wisconsin; Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 až 453, 1970; a Smith a Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 až 489, 1981).

Prekurzor lidského sonic hedgehog proteinu sestává z aminokyselin 1 až 462 sekvence popsané v databázi EMBL pod číslem L38518. Aminokyseliny 1 až 23 představují signální peptid a aminokyseliny 24 až 197 maturní signální doménu. Aminokyseliny 32 až 197 reprezentují signální doménu zkrácenou o osm aminokyselin a aminokyseliny 198 až 462 představují autoprocessingovou C-koncovou doménu po autoproteolytickém štěpení. N-koncem nebo C-koncem hh proteinu, kde je výhodné uskutečnit modifikaci, jsou tedy míněny počáteční (N-konec) nebo koncové (C-konec) aminokyseliny N-koncové signální domény 24 až 197. Je výhodné derivatizovat jednu nebo více z počátečních nebo koncových deseti aminokyselin. Zvlášť, výhodné je modifikovat první nebo druhou aminokyselinu z N-konce N-koncové domény (aminokyseliny 24 nebo 25) nebo předposlední či poslední aminokyselinu z C-konce Nkoncové domény (aminokyseliny 196 nebo 197) . Konjugáty hedgehog proteinů ve smyslu vynálezu jsou s výhodou modifikovány lipofilními skupinami nebo uhlovodíkovými řetězci na svém N-konci. N-koncový cystein v pozici 24 je zvlášť výhodné modifikovat přes thioester nebo amid kyselinami laurovou, myristovou, palmitovou, palmitoleovou, stearovou, olejovou nebo steroidem, případně prostřednictvím disulfidových můstků thiocholesterolem či merkaptoalkanem/alkenem. Nemodifikované hedgehog proteiny je výhodné produkovat jako rekombinantní proteiny, nejlépe v prokaryotním systému (např. E.coli), metodami odborníkům dobře známými. Rekombinantní hedgehog protein je výhodné exprimovat v rozpustné formě jako fúzní protein. Pak následuje izolace proteinu z buněčného supernatantu nebo, po rozbití buněk, odštěpení « 9 999 fúzní části (nejlépe N-koncové) sekvenčně specifickou proteázou jakou je například enterokináza. Takto odkrytý Nkoncový cystein je v následujícím kroku ochráněn buď reakcí s činidlem chránícím thiolové skupiny nebo dimerizací hedgehog proteinu za vzniku disulfidových můstků mezi již zmíněnými cysteiny.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu obsahuje farmakologicky účinnou dávku hh konjugátu a lze jej aplikovat nejlépe lokálně. Konjugáty podle vynálezu je vhodné používat v kombinaci s jinými proteiny hedgehog rodiny nebo s růstovými faktory kostí, jako jsou například morfogenetické proteiny kostí (BMPs, z angl. bone morphogenetic proteins) (Wozney a další, Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and Their Gene Expression, 131 až 167, 1993, Academie Press lne.), paratyroidní hormony (Karablis a další, Genes and Development, 8: 277 až 289, 1994), růstové faktory podobné insulinu (IGF-I nebo II) nebo transformující růstové faktory (TGF-β).

V jiném výhodném provedení obsahuje farmaceutický přípravek hedgehog konjugátu podle vynálezu suramin.

Farmaceutický přípravek obsahuje hedgehog konjugát v koncentracích 0,01 až 10 mg/ml, lépe však 0,01 až 1 mg/ml.

Farmaceutický přípravek dále obsahuje farmaceuticky přijatelný pufr biokompatibilní v rozsahu pH 4 až 10, zvláště pak mezi pH 6 až 9, zvláště v pH 7. Hodnota pH farmaceutického přípravku by měla být vyšší než 4, aby se předešlo denaturaci hedgehog proteinu a případné disociaci zinku komplexovaného tímto hedgehog proteinem. Pufr je vhodné použít v koncentraci 1 až 500 mmol/1, lépe však 10 až 100 mmol/1. Jako pufr je tedy vhodné použít například fosforečnan draselný o koncentraci 20 mmol/1 a pH 7,2.

Dále je výhodné do farmaceutického přípravku zahrnout aditiva jako například cukry (manitol, sacharóza, laktóza, • · ·»·· ·· ·* glukóza, sacharóza, trehalóza, nejlépe v koncentraci 20 až 100 mg/ml) nebo aminokyseliny jako například glycin či arginin nebo antioxidanty jako například EDTA, citrát, polyethylenglykol (v koncentraci 1 až 10 hmotnostních %), kyselinu askorbovou, tokoferol, detergenty, zejména neionogenní (nejlépe 0,005 až 1 hmotnostní %) jako jsou polysorbáty nebo detergenty polyoxyethylenového typu (například Tween^e20, Tween^e80) nebo iontově aktivní detergenty jako jsou cholát sodný, deoxycholát sodný, taurodeoxycholát sodný, případně protizánětlivé látky, lokální anestetika, antibiotika a/nebo stabilizátory jako např. lipidy, mastné kyseliny a glycerol.

Konjugát podle vynálezu lze výhodně použít v osteoinduktivním farmaceutickém přípravku k indukci nebo stimulaci chondrocytů a osteocytů, nebo k indukci svalových či nervových buněk. Osteoinduktivní farmaceutické přípravky jsou známy například z přihlášek US 5364839, WO 97/35607 a WO 95/16035.

Aktivitu hedgehog konjugátů podle vynálezu lze in vivo stanovovat způsoby popsanými v publikacích Glansbeek H. L. a další, Laboratory Investigation, 78: 133 až 142, 1998; přihláška US 5270300; Toriumi D. M. a další, Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 117: 1101 až 1112, 1991; Cook S. D. a další, J. Bone and Joint Surgery, 76-A: 827 až 837, 1994; a Riley E. H. a další, Clin Orthopaed. and Related Research, 324: 39 až 46, 1996.

Pokud je konjugát podle vynálezu aplikován lokálně, je výhodné použít jej v kombinaci s vhodnou nosnou matricí a/nebo sekvestračnim agens. Taková matrice je vhodná k pomalému uvolňování proteinu v aktivní formě in vivo, zvláště v blízkosti kostní nebo chrupavkové tkáně. Sekvestrační agens je látka, která usnadňuje například injekční aplikaci a zabraňuje nebo zpomaluje migraci proteinu podle vynálezu pryč z místa aplikace.

···· · · · ···· • · ·· ·· · · · ·· · ·

Farmaceutický přípravek podle vynálezu výhodně obsahuje polymer, který má pro buňky adhezní funkci (strukturní látka) , například kolagen.

Jako materiál tvořící matrici je zvlášť výhodný biokompatibilní, degradovatelný materiál založený například na kolagenu nebo dalších polymerech založených na kyselině polymléčné, kyselině polyglykolové nebo kopolymerech kyselin mléčné a glykolové. Takovéto polymerní matrice jsou popsány například v přihlášce WO 93/00050.

Jako sekvestrační agens lze s výhodou použít celulózu a celulóze podobné materiály, například alkylcelulózu, karboxymethylcelulózu, kyselinu hyaluronovou, alginát sodný, polyethylenglykol a polyvinylalkohol. Použití kyseliny hyaluronové je zvlášť výhodné ve farmaceutickém přípravku bez nosné matrice.

Následující příklady provedení vynálezu, seznam sekvencí a obrázky dále osvětlují předkládanou přihlášku, jejíž nárokovaný rozsah vyplývá z patentových nároků. Popsané metody mají být chápány jako příklady, které i po případné modifikaci stále popisují předmět tohoto vynálezu.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje aktivitu rekombinantního lidského shh po derivatizaci palmitoyl-CoA.

Prázdný sloupec - 50 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mM ZnCl₂, 0,5% Triton X-100, pH 8,5; šrafovaný sloupec 100 mM MOPS-NaOH, 1 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml suramin, pH 7,4; plný sloupec - 100 mM MOPS-NaOH, 1 mM DTT, 0,1% Triton X-100, pH 7,4; * kontrolní pufr bez shh proteinu .

• ·

Obrázek 2 znázorňuje aktivitu rekombinantního lidského shh po derivatizaci thiocholesterolem. Prázdný sloupec 0,8% (w/v) deoxycholát sodný; šrafovaný sloupec -0,4% (w/v) cholát sodný; plný sloupec - 1,3% (w/v) n-oktylglukosid; tečkovaný sloupec - 0,3% Triton X-100.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

a) Klonování lidského sonic hedgehog proteinu s připojenou His-6 kotvou a štěpným místem pro enterokinázu; exprese v E.coli.

Následující postup lze použít k amplifikaci maturní Nkoncové části lidského sonic hedgehog proteinu (aminokyseliny Cys 24 až Gly 197) z jakéhokoli plazmidu či odpovídající cDNA, která kóduje sonic hedgehog protein.

Část genu ssh sahající od vnitřního restrikčního místa Rsrll až k sekvenci kódující aminokyselinu 198 byla amplifikována s využitím dvou primerů (344 a 345). Při této amplifikaci bylo na C-konec připojeno několik stop kodonů a rovněž restrikční místo Pstl.

SEK. ID. Č: 1

Primer 344: 5' - ca gaattc ttg cggaccg ggc agg gg 26-mer

EcoRI Rsrll

SEK. ID. Č: 2

Primer 345: 5' - ga ctgcag tta a tca tta gcc tcc ega ttt ggc ege 36-mer Pstl stop stop stop • ·

Fragment DNA amplifikovaný tímto způsobem může být štěpen pomocí Rsrll a Pstl a použit v následujících krocích (fragment 344/34 5) .

Linker, s jehož pomocí je na N-konec začleněno 6 histidinových zbytků a štěpící místo pro enterokinázu (EK), je vytvořen hybridizací jiných dvou primerů (346 a 347) :

SEK. ID. Č: 3:

primer 346:5'-aattc atg cat cat cac cac cac cac gat gac gac gac aaa tg cg | His6 Ek

EcoRI overhang

SEK. ID. Č: 4:

primer 347:5'-gtc cgc att tgt cgt cgt cat cgt ggt ggt ggt gat gat gca tg

Rsrll overhang

Adaptér (linker) po hybridizací primerů 346 a 347:

aattc atg cat cat cac cac cac cac gat gac gac gac aaa tgc g g tac gta gta gtg gtg gtg gtg cta ctg ctg ctg ttt acg c ctg

Za účelem exprese je PCR fragment 344/345 spolu s adaptérem 346/347 zaklonován do vektoru štěpeného restrikčními enzymy EcoRI/Pstl. Zmíněné klonování může být provedeno buď přímo nebo s využitím mezistupně, při kterém je fragment 344/345 zaklonován do jiného vektoru. Vektor štěpený restrikčními enzymy EcoRI/Pstl musí na konci EcoRI obsahovat promotor vhodný k řízení exprese v E. coli, ve výhodném provedení promotor T5, tac, lac a podobně. Za účelem exprese je expresívními plazmidy ssh transformován vhodný kmen E. coli. Zmíněný expresívní systém dále obsahuje

nukleové kyseliny kódující tRNAAGA/AGG pro arginin, nacházející se v prokaryotických buňkách (Brinkman a další, Gene, 85:109 až 114, 1989).

b) Fermentace

Fermentace klonu E. coli exprimujícího hedgehog protein (v objemu 10 litrů):

Počáteční kultury jsou připraveny z jednotlivých klonů (ve formě kolonií na miskách nebo ampulí skladovaných při 20°C) inkubací při teplotě 37°C za stálého třepání. Objem každého inokula je v intervalu 1 až 10% vzhledem k následně použitému objemu. Do média pro počáteční kulturu a média ve fermentoru je přidán ampicilin (v koncentraci 50 až 100 mg/litr), čímž je zabráněno růstu buněk, které ztratily expresívní plazmid.

Živiny, které mohou být použity při fermentaci, jsou enzymaticky štěpené proteiny a/nebo kvasničný autolyzát (jako zdroj dusíku a uhlíku) a rovněž glycerol a/nebo glukóza (jako přídavný zdroj uhlíku). pH média je upraveno na hodnotu 7 a fermentační proces může být stabilizován přídavkem solí kovů ve fyziologicky přijatelných koncentracích. Teplota fermentace je 25 až 37°C. Růst je sledován měřením absorbance (optické hustoty; OD) při vlnové délce 528 nm. Exprese je indukována přídavkem IPTG. Po fermentaci v délce přibližně 30 hodin je biomasa sklizena centrifugací (po dosažení neměnné hodnoty OD).

Příklad 2

a) Příprava dimerního rekombinantního lidského proteinu shh gramů biomasy připravené postupem popsaným v oddíle lb) bylo působením vysokého tlaku lyžováno, následně centrifugováno a získaný supernatant byl nanesen na 50 ml chela20

tační Sepharózy (Pharmacia Biotech), která byla již předem nasycena ionty zinku. Fúzní shh protein byl eluován gradientem 0 až 200 mM imidazolu v pufru o složení 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, pH 7,4. Frakce obsahující shh (identifikované pomocí SDS-PAGE) byly spojeny a naředěny jedním objemem pufru obsahujícího 50 mM HEPES, pH 7,4. Precipitát vzniklý při ředění byl odstraněn centrifugací a získaný supernatant byl při 4°C dialyzován proti pufru obsahujícím 50 mM HEPES, pH 7,4. K 500 mg fúzního shh proteinu byla přidána enterokináza (1:500; w/w; Boehringer Mannheim GmbH) a β-merkaptoethanol (10 mM) a celá směs byla inkubována ve vodní lázni při 35°C po dobu 16 hodin. Následně byl k tomuto roztoku přidán DDT na výslednou koncentraci 10 mM. Vzorek byl nanesen na 166 ml SP-Sepharózy (Pharmacia Biotech) a eluován gradientem 0 až 800 mM NaCl v pufru o složení 20 mM HEPES, pH 7,4. Po analýze frakcí, provedené metodou SDS-PAGE, byly hlavní frakce spojeny, a takto vzniklý vzorek byl rozdělen do několika částí, které byly do dalšího použití uskladněny při -80°C. Zmíněné hlavní frakce obsahují shh protein, který je v neredukujících podmínkách ve formě dimeru spojeného disulfidickým můstkem (který může být redukován), a má zdánlivou molekulovou hmotnost přibližně 38 kDa.

b) Modifikace provedená inkubací v redukujících podmínkách

Dimerní shh protein (1 mg/ml) byl 10 mM DTT (30 minut,

25°C) redukován a následně dialyzován přes noc proti PBS obsahujícím 0,5 mM DTT. Po odsolení provedeném HPLC na obrácené fázi (RP-HPLC) indikovalo hmotnostní spektrum dialyzátu skutečnost, že shh protein ve formě monomeru vykazuje, mimo jiné (tj. mimo jiné modifikace vedoucí k rozšíření píku hmotnostního spektra; tyto modifikace nejsou dále specifikovány) , adukty o molekulových hmotnostech 32 ± 4 Da (dvojná21 • · ···· · · · ···· ·· ·· ·· ··· · · ·· sobná oxidace N-koncového cysteinu) a 47 ± 4 Da. Formy shh proteinu modifikované tímto způsobem nemohou být zpětně dimerizovány oxidací. Tento fakt ukazuje, že -SH skupina koncového cysteinu byla modifikována stabilně. Důsledkem je, že tato -SH skupina se již nemůže účastnit dalších reakcí, například tvorby thioesterů, a výtěžek derivatizace hydrofobními sloučeninami je tudíž podstatně snížen. Z toho vyplývá, že pro acylaci N-koncového cysteinu in vitro, by doba, po kterou se redukovaný shh vyskytuje v roztoku, měla být minimalizována nebo, v případě kondenzační reakce, by tato měla probíhat v přítomnosti Tris(2-karboxyethyl)fosfan hydrochloridu (TCEP.HCl), jelikož tato sloučenina atakuje pouze disulfidické vazby a ne (aktivované) thioestery.

c) Kinetiky zpětné oxidace shh za tvorby dimeru v závislosti na hodnotě pH rozpouštědla

Přídavkem 2 mM TCEP (Tris(2-karboxyethyl)fosfan hydrochlorid) na dobu 15 minut při 25°C bylo 0,5 ml dimeru shh (c = 2,7 mg/ml) převedeno, redukcí intermolekulárních disulfidických můstků, na monomemí formu. Následně byl vzorek na koloně PD-10 (Pharmacia) převeden do PBS, pH 7,0, nebo PBS, pH 5,0, as využitím RP-HPLC byla provedena analýza spontánní dimerizace (při 25°C) v závislosti na době inkubace po odstranění redukčního činidla.

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2

	pH 7,0	pH 5,0
Čas (h)	monomer (%)	dimer (%)	monomer (%)	dimer (%)
0,1	85	15	91	9
0,75	60	40	82	18
2	n.d.	n.d.	52	48
3	7	93	n.d.	n.d.
20	7	93	6	94

Z této tabulky je patrné, že monomer shh spontánně dimeruje. Tato dimerizace je při pH 7,0 velmi rychlá, ale při pH 5,0 je kinetika dimerizace pomalejší.

Příklad 3

a) Příprava kondenzačních činidel pro selektivní acylaci -SH skupin v cysteinech (I) Metoda využívající imidazolidy

Výchozí materiál (imidazolidy) je připraven obecným postupy A, B nebo C analogickými způsobům popsaným v literatuře (Leksyzsyn J. a další, Synthesis, 478 až 479, 1978; Staab H. A., Angew. Chem., 74:407 až 423, 1962; Fahreholtz K. E. a další, J. Med. Chem., 17:337 až 342, 1974).

la) Obecný postup A mmol příslušné karboxylové kyseliny a 10 mmol 1,1'karbonylimidazolu je rozpuštěno v absolutním tetrahydrofuranu a mícháno 30 minut až 24 hodin při pokojové teplotě. Tato směs je odpařena pod vakuem a odparek je použit bez další purifikace.

lb) Obecný postup B mmol chloridu příslušné kyseliny a 20 mmol imidazolu je pod zpětným chladičem v absolutním toluenu (zamezení přístupu vlhkosti) zahříváno po dobu 1 až 24 hodin. Vzniklý hydrochlorid imidazolu je zfiltrován a filtrát je vakuově odpařen. Odparek je přečištěn chromatografií na silikagelu za použití směsi octan ethylnatý/heptan nebo rekrystalizaci.

···· ·· · · · · • · ·· ·· ··· · · · ·

Ib) Obecný postup C mmol příslušné karboxylové kyseliny je po dobu 1 až 48 hodin při pokojové teplotě mícháno s 10 mmol dicyklohexylkarbodiimidu a 10 mmol imidazolu v dichlormethanu. Po ochlazení na 0°C je vzniklá močovina odstraněna filtrací a filtrát je extrahován vodou, vysušen síranem sodným, vakuově odpařen a rekrystalizován.

Byla získány následující imidazolové deriváty mastných kyselin:

1-imidazol-l-yl-hexan-l-on (bezbarvý olej; výtěžek 66%) 1-imidazol-l-yl-oktan-l-on (bezbarvé krystaly; výtěžek 59%) 1-imidazol-l-yl-dekan-l-on (bezbarvé krystaly; výtěžek 79%) 1-imidazol-l-yl-dodekan-l-on (bezbarvé krystaly; výtěžek 86%)

1-imidazol-l-yl-tetradekan-l-on (bezbarvé krystaly; výtěžek 52%)

1-imidazol-l-yl-hexadekan-l-on (bezbarvé krystaly; výtěžek 70%)

17-(4-imidazol-1-yl-l-methyl-4-oxo-butyl)-10,13-dimethyldodekahydro-cyklopenta [a]fenantren-3,7,12-trion) (bezbarvé krystaly; výtěžek 56%)

4-(10,13-dimethyl-hexadekahydro-cyklopenta[a] fenantren-17yl)-1-imidazol-l-yl-pentan-l-on (bezbarvé krystaly; výtěžek 71%) (II) Metoda využívající pyridyldisulfid

Výchozí materiál (pyridyldisulfidy) je připraven obecným postupem A analogickým způsobu popsanému v literatuře (Lee S. a další, Bull. Chem. Soc. Jpn., 64:2019 až 2021, 1991).

Ve 30 ml absolutního dichlormethanu je rozpuštěno 10 mmol příslušného merkaptanu a 10 mmol 2,2'-dithiopyridinu a směs je míchána 6 až 24 hodin při pokojové teplotě. Rozpouštědlo

0 · · » · · 4 je vakuově odpařeno, k odparku je přidán diethylether a vzniklý roztok je zfiltrován. Filtrát je vakuově odpařen a přečištěn chromatografií na silikagelu za použití směsi octan ethylnatý/heptan.

Byly získány následující sloučeniny:

2-decyldisulfanylpyridin (bezbarvý olej; výtěžek 76%)

2-hexadecyldisulfanylpyridin (bezbarvé krystaly; výtěžek 64%)

2- {17-(1,5-dimethyl-hexy1)-10,13-dimethyl2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahydro-lHcyklopenta[a]-fenantren-3-yl-disulfanyl}-pyridin (bezbarvé krystaly; výtěžek 56%)

b) Příprava palmitoylovaného rekombinantního lidského shh s využitím imidazolidu kyseliny palmitové

Jako edukt byl použit nemodifikovaný rekombinantní lidský shh ve formě dimeru, připravený postupem uvedeným v příkladu 2. Tento protein byl ve formě roztoku v PBS (10 mM fosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH 7,4) v koncentraci 3 mg/ml. Ke 2 ml tohoto roztoku byl přidán detergent, ve výhodném provedení 200 μΐ 10% roztoku .Zwittergentu 3-14. Následně byl přidán Tris(2-karboxyethyl)fosfan hydrochlorid (TCEP) na výslednou koncentraci 2 mM. Po 15 minutové inkubaci při pokojové teplotě bylo k roztoku přidáno 50 μΐ 60 mM imidazolidu kyseliny palmitové (1-imidazol-l-yl-hexadekan-lon) v dioxanu. Vzniklý roztok byl za stálého třepání inkubován po dobu 1 až 3 dnů při teplotě (výhodně) 4°C.

Za těchto podmínek je hlavním produktem dipalmitoylovaný shh (70 až 75%). Tento byl identifikován, stejně jako v příkladu 6, pomocí RP-HPLC a hmotnostní spektrometrií. Shh modifikovaný tímto způsobem vykazoval v testu aktivity popsaném v příkladu 7, ve srovnání s nemodifikovaným shh, vyšší biologickou aktivitu. Poloviny maximální aktivity bylo dosaženo při koncentraci 70 ng/ml.

Druh použitého detergentů měl velký vliv na výtěžek dipalmitoylovaného shh a úroveň biologické aktivity (tabulka

1) .

Tabulka 1.

Vliv použitého detergentů na podíl dipalmitoylovaného shh v reakční směsi (prováděno při pokojové teplotě). Způsob kvantifikace: stejný jako v příkladu 6.

Detergent
žádný	0
Zwittergent 3-14 (0,1%)	15
Zwittergent 3-14 (0,5%)	52
Zwittergent 3-14 (1%)	70
Zwittergent 3-14 (2,5%)	50
Zwittergent 3-16 (0,5%)	45
Triton®X-100 (0,5%)	7,5
Tween® 80 (0,2%)	1,6
cholát sodný (0,4%)	0
Chaps (0,6%)	2,8
oktyl glukosid (0,5%)	0

c) Příprava alkylovaného rekombinantního lidského shh s využitím 2-hexadecyldisulfanylpyridinu

Jako edukt byl použit nemodifikovaný rekombinantní lidský shh ve formě dimeru, připravený postupem uvedeným v příkladu 2a. Tento protein byl ve formě roztoku v PBS (10 mM fosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH 7,4) v koncentraci 3 mg/ml. Za účelem vytvoření monomerů byl roztok po přídavku 2 mM TCEP inkubován po dobu 15 minut. Následně byl TCEP odstraněn na koloně PD-10 ekvilibrované v pufru o složení 5 mM fosforečnan draselný, 150 mM NaCl, pH 5,0. Alikvoty monomeru shh o objemu 200 μΐ připravené tímto způsobem byly použity při reakci (provedené dvěma způsoby) s 2hexadecyldisulfanylpyridinem.

• · · fc · · · • · · ♦

A) K monomeru shh bylo přidáno 20 μΐ 10% roztoku Zwittergentu 3-14, 20 μΐ 0,5 M HEPES, pH 7,0, a jedno- až dvacetinásobný molární nadbytek derivatizačního činidla (rozpuštěno v dioxanu, 60 mM).

Β) K monomeru shh byly přidány 2 μΐ 10% deoxycholátu sodného, 20 μΐ ÍM fosforečnanu draselného, pH 7,6, a dvouaž dvacetinásobný molární nadbytek derivatizačního činidla (rozpuštěno v methanolu, 60 mM).

V obou případech byla reakce ukončena po 15 minutách.

Při desetinásobném nadbytku derivatizačního činidla bylo v reakční směsi dosaženo 43% (varianta A) respektive 47% (varianta B) zastoupení monoalkylovaného shh. Při alkylaci postupem podle varianty A bylo dosaženo podstatného zvýšení biologické aktivity (ve srovnání s nemodifikovaným shh) a poloviny maximální aktivity bylo dosaženo při koncentraci shh 200 ng/ml. Při jednomolárním nadbytku 2hexadecyldisulfanylpyridinu bylo dosaženo pouze nepatrně nižších výtěžků. Alkylace postupem podle varianty B měla rovněž za následek zvýšení aktivity shh (ve srovnání s nemodifikovaným shh), ale v menší míře: při použití stejného množství proteinu bylo dosaženo pouze 30% biologické aktivity. Výhodnější je tudíž použití varianty A.

d) Purifikace alkylovaných derivátů shh

Produkt derivatizační reakce byl zředěn v poměru 1:4 v pufru o složení 50 mM HEPES, 0,1% Tween^S80, pH 7,4, a následně purifikován na nosiči SP-Sepharóza HP (Pharmacia).

Ekvilibrační pufr: 50 mM HEPES, 0,1% Tween^e80, pH 7,4; eluční pufr: 50 mM HEPES, 0,2% Tween^O, pH 7,4, obsahující ·· ···

0,8 Μ NaCl; eluce gradientem (2x6 objemů kolony) a diskontinuální eluce.

V případě dipalmitoylovaného shh bylo možné oddělit nadbytek palmitoylimidazolidu a částečně separovat nemodifikovaný shh. V případě modifikace provedené 2hexadecyldisulfanylpyridinem bylo dosaženo podstatného obohacení monopalmitoylovaným shh až na 76% zastoupení. Modifikovaný shh může být například dále přečištěn na heparin Sepharóze.

Příklad 4

a) Příprava palmitoylovaného rekombinantního lidského shh za použití palmitoyl-CoA.

ml vzorku purifikovaného dimerního shh o koncentraci 0,35 mg/ml bylo smícháno s DTE ve výsledné koncentraci 20 mM a inkubace probíhala 2 hodiny při 37°C. Následně byla provedena dialýza proti pufrům o složení:

a) 50 mM Tris/HCl, 1 mM DTE, 0,1 mM ZnCl₂, 0,5% Triton®X100, pH 8,5

b) 100 mM MOPS, 1 mM DTE, 0,1% Triton®X-100, 0,1 mg/ml suramin, pH 7,4

c) 100 mM MOPS, 1 mM DTE, 0,1% Triton®X-100, pH 7,4.

Poté byly k alikvotům (o objemu 0,5 ml) takto připravených vzorků přidány různé objemy roztoku palmitoyl-CoA (10 mg/ml v pufru o složení 100 mM MOPS, 1 mM DTT, 0,2% Triton®X-100, pH 7,6), čímž bylo dosaženo výsledných koncentrací palmitoyl-CoA ve směsi:

1) 0 μΜ

2) 50 μΜ

3) 500 μΜ, a inkubace probíhala 1 hodinu při 37°C. Před filtrací a zředěním 1/200 (pro provedení testů na buňkách) byly vzorky • · ···· · · · ·· ·· «· · ···· ···· ···· · · · · · · · ·· · · ·· ··· ·· ·· smíchány s BSA (výsledná koncentrace 1 mg/ml) a suraminem (výsledná koncentrace 0,1 mg/ml). Testy aktivity provedené s výše uvedenými vzorky shh postupem popsaným v příkladu 7 ukázaly, že vzorky shh inkubované v pufrech b) a c) a obsahujících 500 μΜ palmitoyl-CoA vykazovaly, ve srovnání se směsmi bez palmitoyl-CoA, podstatně zvýšenou biologickou aktivitu (obrázek 1). Shh palmitoylovaný tímto způsobem může být purifikován postupy popsanými pro purifikaci membránových proteinů, například v publikaci A Practical Guide to Membrane Protein Purification (1194; editoři Jagow a Schlagger; Academie Press) nebo v Evropské patentové přihlášce č. 98102095.1

b) Závislost acylace na koncentraci shh a molárním poměru mezi shh a palmitoyl-CoA (Pal-CoA).

Dimerní shh (v PBS) byl zředěn roztokem PBS na koncentrace c = 150 μΜ nebo 37,5 μΜ a k těmto roztokům byl přidán Tween^eO (výsledná koncentrace 0,05%), DTE (výsledná koncentrace 3 mM) a TCEP (výsledná koncentrace 1 mM). Následně byl v uvedených množstvích přidán Pal-CoA (20 mM ve vodě) a vzniklá směs byla inkubována přes noc při 25°C. Vzorky byly analyzovány RP-HPLC nebo, po zředění v roztoku o složení PBS, 1 mg/ml BSA, 0,05% Tween^s80, pH 7,3 a sterilizaci filtrací, testováním aktivity na buňkách. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

• · ···· ·· · · · · · ·· · · · · · ···· • · · · · · · · · · · • · ·· ·· · · · ·· ··

Tabulka 3

končen-	poměr	nemodi-	lx pal-	2x pal-	3x pal-	4x pal-	aktivi-
trace	Pal-CoA	fíková-	mitoy-	mitoy-	mitoy-	mitoy-	ta
shh	(M):shh	ný shh	1ováný	1ováný	1ováný	1ováný	EC50*
(mg/ml)	(M)	[%]	shh [%]	shh [%]	shh [%]	shh [%]	[ng/ml]
0,75	2,5:1	70	3	27	-	-	100
0,75	13 : 1	4	4	80	2	3	65
0,75	50:1	-	-	8	1	30	400
3	0,65:1	80	-	13	-	7	500
3	3,25:1	42	2,5	54	-	2	70
3	13 :1	3,5	2,4	65	5	12	70
3	0 :1	100	-	-	-	-	>50 000

EC50 je koncentrace shh, která musí být použita v testu na buňkách pro dosažení poloviny maximální indukce alkalické fosfatázy. Vzhledem k rozdílům v počtu pasáží buněk, a tudíž změnám v buněčné fyziologii, se tato hodnota může při stanoveních prováděných v různých obdobích poněkud lišit.

Při použití mírného nadbytku derivatizačního činidla (méně než 50-ti násobném) byl hlavním produktem derivát shh dvakrát acylovaný na N-koncovém cysteinu. Při vyšším poměru Pal-CoA ku shh dochází ve větší míře k tvorbě shh palmitoylovaného více než dvakrát. Palmitoylace více než dvěma řetězci mastných kyselin rovněž zvyšuje aktivitu shh. Při koncentraci shh 37,5 μΜ je vzhledem k výsledné aktivitě optimální použit přibližně desetinásobný nadbytek Pal-CoA. Při koncentraci shh 150 μΜ je již při trojnásobném nadbytku Pal-CoA dosaženo vysokého výtěžku dvojnásobně palmitoylovaného shh a vysoké aktivity.

c) Závislost acylace na typu a koncentraci použitého detergentu.

Roztok dimerního shh v PBS (pH 7,4) byl upraven na koncentraci 0,75 mg/ml, smíchán s uvedenými množstvími jednotlivých detergentů a v každé reakci ještě s 500 μΜ Pal-CoA a 3 mM DTE nebo 3 mM TCEP (výsledné koncentrace). Derivatizační reakce probíhaly při 25°C přes noc a následně byla prove30 • ·

děna analýza na RP-HPLC, nebo v různých ředěních v roztoku PBS obsahujícím 1 mg/ml BSA, 0,05% Tween* 80, pH 7,3 a sterilizaci filtrací, buněčný test.

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4

Detergent	Nemodifikovaný [%]	lx pal. [%]	2x pal. [%]	3 + 4x pal. [%]	Nezískáno zpět [%]	aktivita EC50 [ng/ml]
žádný Pal-CoA	100	-	-	-	-	<50 000
0,5% Tween 80	60	-	24	1	15	250
0,05% Tween 80	9	3	81	6	1	165
0,05% Tween 80	5	2	89	4	-	170
0,5% Zwittergent 3-14	86	5	7	2	-	1100
0,05% Zwittergent 3-14	21	37	35	2	5	195
0,5% n-oktyl glukosid	21	2	74	3	-	180
0,05% n-oktyl glukosid	4	2	62	20	12	230

pal. = palmitoylovaný * redukován 3 mM TCEP namísto 3 mM DTE

Ukázalo se, že je možné dosáhnout vysokého stupně palmiΦ toylace za použití 0,05% Tweenu 80 nebo 0,5% oktylglukosidu; rovněž palmitoylace v 0,05% Zwittergentu měla za následek podstatné zvýšení aktivity. Současná redukce pomocí TCEP vedla k podobným výsledkům jako redukce prováděná DTE.

d) Acylace redukovaného monomerního shh ve vztahu k hodnotě pH derivátizační směsi

Dimerní shh (c = 0,7 mg/ml) byl redukován 10 mM DTE a dialyzován přes noc proti roztoku PBS, 0,05% Tween 80, 0,5 mM DTE. Získaný dialyzát byl upraven na výslednou koncentraci c = 0,25 mg/ml a požadované pH roztokem PBS, 0,05% Tween° 80, 0,5 mM DTE a k těmto roztokům byl přidán 125 μΜ Pal-CoA.

• · · · · · · ···· • · ·· ·· ··· » · ··

Získané směsi byly inkubovány 2 hodiny při 37°C a následně byly v ředění 1:500 analyzovány v buněčném testu. Aktivita jednotlivých vzorků je shrnuta v tabulce 5 a je uvedena ve tvaru poměru aktivity AP k bazální aktivitě nestimulovaných buněk C3H10T1/2 (=100%).

Tabulka 5

pH	5,0	6,0	6,5	7,0	7,5	8,0
aktivita [%]	115	185	185	390	480	330

Maximální aktivace je tudíž pozorována v neutrálním nebo slabě alkalickém pH.

e) Navázání derivátů acyl-CoA obsahujících acylové skupiny s odlišnými délkami uhlovodíkových řetězců

Koncentrace dimerního shh byla roztokem PBS, 0,05%

Tween* 80, 3 mM DTE upravena na hodnotu 0,75 mg/ml a ke vzniklému roztoku byly přidány jednotlivé deriváty acyl-CoA na výslednou koncentraci 0,5 mM. Inkubace probíhala přes noc při 25°C. Vzorky byly analyzovány RP-HPLC nebo v různých ředěních (po zředění roztokem PBS, 1 mg/ml BSA, 0,05% Tween’ 80, pH 7,3 a sterilizaci filtrací ) použity při buněčných testech. Posun v retenci při RP-HPLC, jakož i výtěžky diacylovaných shh a aktivita při buněčných testech, jsou shrnuty v tabulce 6.

Tabulka 6

Acylový zbytek	Koncentrace acetonitrilu, při které je eluován diacylovaný shh (%)	Výtěžek diacylovaného shh (%)	Aktivita EC50 (ng/ml)
C-16(palmitoyl)	54	70	70
C-14(myristoyl)	51	68	60
C-14:1(myristoleyl)	48,5	63	140
C-12(lauroyl)	47,5	45	210

• · • · · · • · • ·

Získané výsledky ukazují, že s využitím metody využívající deriváty acyl-CoA mohou být na shh účinně přeneseny acylové skupiny o různých délkách řetězců. V závislosti na délce řetězce přenášeného acylového zbytku je nutné optimalizovat koncentraci a druh použitého detergentu. Zkrácení acylového zbytku nebo zvýšení počtu nenasycených vazeb mezi atomy uhlíku má za následek snížení specifické aktivity acylovaného derivátu shh.

Příklad 5

a) Derivatizace rekombinantního lidského shh thiocholesterolem

Za účelem derivatizace shh thiocholesterolem připojením k N-koncovému cysteinu disulfidickým můstkem, byl redukovaný monomerní shh v koncentraci 0,66 mg/ml v 0,5 mM DTT, pH 7,0, zředěn v poměru 1:3 v reakčním pufru o složení:

100 mM ethanolamin

100 mM NaCl μΜ CuCl₂

PH 9,5

0,8% (w/v) deoxycholát sodný nebo 0,4% (w/v) cholát sodný nebo 1,3% (w/v) n-oktylglukosid nebo 0,3% Triton® X-100.

Reakce byla odstartována přídavkem (výsledné koncentrace) :

5% (v/v) aceton nebo 100 μΜ thiocholesterol (z 10 mM roztoku v acetonu) nebo 500 μΜ thiocholesterol (z 10 mM roztoku v acetonu) a získaná směs byla za stálého třepání inkubována 30 minut při pokojové teplotě.

Vzorky byly (před sterilizací filtrací) zředěny devíti objemy roztoku o složení 20 mM fosforečnan sodný, 0,9% NaCl, 0,05% Tween®80, 1 mg/ml BSA, 0,1 mg/ml suramin, pH 7,2 a následně v ředění 1/20 analyzovány buněčným testem.

Jak je zřejmé z obrázku 2, byla pozorována zvýšená aktivita, která závisí na použité koncentraci thiocholesterolu a tato aktivita je nejúčinněji získána nebo stabilizována ve vzorcích obsahujících anionaktivní detergenty.

b) Derivatizace rekombinantního lidského shh pyridyldisulfidem thiocholesterolu

Za účelem derivatizace shh thiocholesterolem připojením k N-koncovému cysteinu disulfidickým můstkem, byl dimer shh kovalentně spojený disulfidickým můstkem přes N-koncové cysteiny po dobu 15 minut při pokojové teplotě redukován 2 mM TCEP a následně převeden do PBS, pH 5, a redukční činidlo bylo odděleno na sloupci PD10 (Pharmacia). Pro derivatizační reakci byla pomocí PBS, pH 5, koncentrace shh upravena na hodnotu c = 1 mg/ml. Přídavkem koncentrovaného roztoku pufru (například 40 objemových procent 0,4 M fosforečnanu sodného, pH 9,2) bylo pH upraveno na neutrální nebo mírně alkalickou hodnotu (například 7,6) a okamžitě byl nejprve přidán detergent a následně derivatizační činidlo (5 mM pyridyldisulfid thiocholesterolu) rozpuštěné v organickém rozpouštědle (například methanol, 40°C). Reakční směs byla inkubována několik hodin při pokojové teplotě a následně analyzována HPLC, hmotnostní spektrometrií nebo po zředění roztokem PBS, 1 mg/ml BSA, 0,05% Tween^e80, pH 7,3 a sterilizaci filtrací v různých ředěních buněčným testem.

Výsledky získané použitím některých reakčních směsí jsou shrnuty v tabulce 7.

Tabulka 7

Koncentrace shh v reakční směsi	Detergent [%(w/v)]	Koncentrace derivatizačního činidla	Výtěžek modifikovaného shh	Aktivita [EC50]
0,6 mg/ml	0,1% deoxycholát sodný	125 μΜ	0,17 mg/ml	1,2 μ9/ιη1
0,6 mg/ml	0,1% deoxycholát sodný	250 μΜ	0,32 mg/ml	0,7 μ9/πι1
0,6 mg/ml	0,4% deoxycholát sodný	250 μΜ	0,12 mg/ml	1,5 μg/ml
0,7 mg/ml	0,1% deoxycholát sodný	250 μΜ	0,33 mg/ml	1,1 μg/ml
0,7 mg/ml	0,8% cholát sodný	250 μΜ	0,40 mg/ml	0,7 μg/ml
0,7 mg/ml	1% n-oktyl glukosid	250 μΜ	0,24 mg/ml	1,4 μg/ml
0,7 mg/ml	0,2% Tween80	250 μΜ	0	-

Jak je vidět z tabulky 7, za vhodných podmínek může být připraven derivát shh s thiocholesterolem navázaným disulfidickou vazbou, a to s výtěžkem přes 50% a specifickou aktivitou (měřeno buněčným testem) dosahující přinejmenším 10% dipalmitoylovaného shh.

Příklad 6

Charakterizace reakčních produktů derivatizace shh pyridyldisulfidem thiocholesterolu pomocí RP-HPLC a hmotnostní spektrometrie

100 μΐ reakční směsi dialyzované proti roztoku o složení PBS, 0,05% Tween^e80 obsahujícím 0,7 mg/ml shh, 1% deoxycholát sodný, 250 μΜ pyridyldisulfid thiocholesterolu, pH 7,6, bylo naneseno na kolonu s butylem jako hydrofobní fází, o rozměrech 1 x 250 mm (Vydac™ 214TP5115) ekvilibrovanou v 18% acetonitrilu a 0,1% kyselině trifluoroctové (TFA). Eluce byla prováděna při 25°C gradientem 18 až 90% acetonitrilu v 0,1% TFA. Eluát byl současně analyzován měřením absorbance při vlnové délce 220 nm a na hmotnostním spektrometru s elektrorozprašováním vzorku (API100, Sciex; parametry nastavení: minimální hmotnost (m/z) 900 atomových hmotnostních jednotek (amu), maximální hmotnost (m/z) 1500 amu,

inkrement 0,3 amu, prodleva 0,5 ms, ústové napětí 30 V). Redukovaný monomerní shh a reoxidovaný dimerní shh o molekulových hmotnostech 19560 Da a 39120 Da byly eluovány v 18 minutě (42 až 44% acetonitril), shh spojený disulfidickým můstkem s thiocholesterolem (molekulová hmotnost 19962,7 Da) byl eluován ve 24,5 minutě (48,5% acetonitril).

Příklad 7

Indukce alkalické fosfatázy v buněčném testu (stanovení aktivity alkalické fosfatázy)

Do každé jamky na 96-ti jamkové mikrotitrační destičce bylo vyseto 5000 buněk myší mesenchymální pluripotentní linie C3H10T1/2 (ATCC CC1-226). Kultivační médium mělo složení 100 μΐ DMEM, 2 mM glutamin, penicilín 100 IU/ml, streptomycin 100 jiig/ml a 10% fetální telecí sérum (FCS) . Další den byly testované aktivní látky ve vhodných koncentracích v objemu 100 μΐ přidány do kultivačního média. Testování bylo ukončeno po pěti dnech. Supernatanty byly odstraněny a buňky byly jednou promyty v PBS. Následně byly buňky lyžovány v 50 μΐ 0,1% Tritonu^eX-100 a zamraženy při -20°C. Po rozmražení bylo 25 μΐ použito ke stanovení obsahu proteinů a zbylých 25 μΐ ke stanovení aktivity alkalické fosfatázy.

Stanovení proteinů podle návodu doporučeného výrobcem (Pierce) :

Ke směsi bylo nejprve přidáno 75 μΐ redestílované vody a poté 100 μΐ činidla BCA (Pierce Micro BCA, číslo 23225) . Po 60 minutách byla změřena absorbance při vlnové délce 550 nm.

Stanovení aktivity alkalické fosfatázy podle návodu doporučeného výrobcem (Sigma):

K testovanému vzorku bylo přidáno 100 μΐ reakčního pufru (Sigma 221). Kapsle substrátu (Sigma 104-40) byla rozpuštěna

v 10 ml redestilované vody a následně bylo pipetou 100 μΐ tohoto roztoku přidáno k testované směsi. Po vzniku žlutého zabarvení byla změřena absorbance při vlnové délce 405 nm.

V této reakci je činností alkalické fosfatázy přeměňován pnitrofenylfosfát na p-nitrofenol.

S využitím standardních křivek byly získané hodnoty absorbancí převedeny na nmoly nebo mikrogramy. Vyhodnocení bylo provedeno s využitím následujícího vzorce:

nmol PNP (měřený) za minutu na mg (buněčného) proteinu

SEZNAM SEKVENCI (1) OBECNE INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH (B) ULICE: Sandhofer Str. 116 (C) MĚSTO: Mannheim (E) STÁT: Německo (F) PSČ: D-68305 (G) TELEFON: 08856/60-3446 (H) TELEFAX: 08856/60-3451 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Konjugát hedgehog proteinu vyznačující se zvýšenou aktivitou, způsob jeho přípravy a jeho terapeutické využití.

(iii) POČET SEKVENCÍ: 4 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelář (B) ULICE: Národní 32 (C) MĚSTO: Praha 1 (D) STÁT: Česká Republika (E) PSČ: 116 66 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.3OB (EPO) (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = Primer 344 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:l:

CAGAATTCTT GCGGACCGGG CAGGGG

···· ·· · ··· ·· ·· · · · · · · · · · (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = Primer 345 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:2:

GACTGCAGTT AATCATTAGC CTCCCGATTT GGCCGC (2) INFORMACE O SEK. ID. C.:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = Primer 346 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:3:

AATTCATGCA TCATCACCAC CACCACGATG ACGACGACAA ATGCG (2) INFORMACE O SEK. ID. C.:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (c) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = Primer 347 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:4:

GTCCGCATTT GTCGTCGTCA TCGTGGTGGT GGTGATGATG CATG

Claims (13)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY fM1. Konjugát hedgehog proteinu, kde tento konjugát zahrnuje:

   a) polypeptid složený z 10 až 30 hydrofobních aminokyselin a/nebo aminokyselin, které vytvářejí transmembránové helixy a jsou kladně nabité,

   b) 1 až 4 alifatické, nasycené nebo nenasycené uhlovodíkové zbytky s řetězcem o délce 8 až 24 uhlíkových atomů a s hydrofobními vlastnostmi,

   c) hydrofobní thiosloučeninu kovalentně navázané na hedgehog protein.
2. 2. Konjugát hedgehog proteinu podle nároku 1, kde zmíněný polypeptid obsahuje 2 až 12 lysinu a/nebo argininů.
3. 3. Konjugát hedgehog proteinu podle nároku 1, kde zmíněnými uhlovodíkovými zbytky jsou mastná kyselina nebo alkylalkoholový zbytek navázané ve formě esteru, thioesteru, amidu kyseliny nebo disulfidu.
4. 4. Konjugát hedgehog proteinu podle nároku 3, kde zmíněnou mastnou kyselinou je kyselina laurová, myristová, palmitová, stearová, arachidová, behenová, palmitoleová, oleová, linoleová, linolenová nebo arachidonová.
5. 5. Konjugát hedgehog proteinu podle nároku 1, kde zmíněnou hydrofobní thiosloučeninou je thiocholesterol.
6. 6. Konjugát hedgehog proteinu podle nároků 1 až 5, kde jsou zmíněný uhlovodíkový zbytek, polypeptid nebo thiosloučenina navázány na C-konec a/nebo N-konec hedgehog proteinu.
7. 7. Způsob produkce konjugátu hedgehog proteinu podle nároků 3 nebo 4 a 6 vyznačující se tím, že zmíněný uhlovodíkový zbytek je kovalentně připojen k volné hydroxy-, merkapto-, karboxy- nebo amino- skupině daného hedgehog proteinu.
8. 8. Způsob produkce konjugátu hedgehog proteinu podle nároků 1 až 6 kovalentním navázáním uhlovodíkového zbytku nebo hydrofobní thiosloučeniny k hedgehog proteinu vyznačující se tím, že zmíněné kovalentní navázání uhlovodíkového zbytku, polypeptidu nebo hydrofobní thiosloučeniny a/nebo izolace jsou prováděny v přítomnosti suraminu, heparinu, anionického polysacharidu nebo detergentů.
9. 9. Způsob produkce konjugátu hedgehog proteinu podle nároků 1 až 6 kovalentním navázáním mastné kyseliny nebo hydrofobní thiosloučeniny k hedgehog proteinu vyznačující se tím, že derivatizačním činidlem použitým k navázání zbytku mastné kyseliny je palmitoyl-CoA nebo palmitoylimidazolid a derivatizačním činidlem použitým k navázání hydrofobní thiosloučeniny je thiocholesterol nebo uhlíkový řetězec nesoucí thiolovou skupinu.
10. 10. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje konjugát hedgehog proteinu podle nároků 1 až 6 ve farmaceuticky účinném množ41 ství spolu s pomocnými látkami, detergenty, stabilizátory, sloučeninami vytvářejícími matrix, suraminem, heparinem, anionickými polysacharidy a/nebo sekvestrujícími činidly.
11. 11. Způsob přípravy farmaceutického přípravku vyznačující se tím, že jako hlavní složka tohoto přípravku je použit konjugát hedgehog proteinu podle nároků 1 až 6.
12. 12. Hedgehog protein vyznačující se tím, že na thiolovou skupinu N-koncového cysteinu je navázána chránící skupina, nebo že zmíněný hedgehog protein se nachází ve formě homodimeru, kde jsou N-koncové cysteiny spojeny disulfidickým můstkem.
13. 13. Použití hedgehog proteinu podle nároku 12 při přípravě konjugátu hedgehog proteinu, kde tento konjugát obsahuje:

    a) polypeptid složený z 10 až 30 hydrofobních aminokyselin a/nebo aminokyselin, které vytvářejí transmembránové helixy a jsou kladně nabité,

    b) 1 až 4 alifatické, nasycené nebo nenasycené uhlovodíkové zbytky s řetězcem o délce 8 až 24 uhlíkových atomů a s hydrofobními vlastnostmi,

    c) hydrofobní thiosloučeninu kovalentně navázané na hedgehog protein.