CZ170399A3

CZ170399A3 - Rekombinantní bicistronový adenovirus vhodný pro léčení dyslipoproteinémií, jeho použití a farmaceutický přípravek obsahující takový virus

Info

Publication number: CZ170399A3
Application number: CZ991703A
Authority: CZ
Inventors: Patrick Benoit; Nicolas Duverger; Didier Rouy; Sandrine Seguret
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 1999-08-11
Also published as: CA2271437A1; NO992260L; ZA9710271B; WO1998022606A1; KR20000053320A; SK63499A3; AU5125298A; IL129823A0; BR9712957A; FR2755975B1; JP2001506488A; FR2755975A1; NO992260D0; HUP9904500A3; EP0941355A1; HUP9904500A2; AU721654B2

Description

Předkládaný vynález se týká nových rekombinantnich virů, jejich přípravy a jejich použití v genové terapii, pro in vivo přenos, a expresi požadovaných genů. Přesněji se týká rekombinantnich virů obsahujících alespoň dva vložené geny, jejichž expresní produkty jsou zapojeny do reverzního transportu cholesterolu. Týká se také kyvadlových plazmidů použitelných pro produkci adenovirů podle vynálezu. Konkrétněji se předkládaný vynález týká defektních rekombinantnich adenovirů a jejich použití pro prevenci nebo léčbu patologických stavů spojených s dyslipoproteinémiemi, které jsou známy pro své vážné následky na kardiovaskulární a neurologické úrovni..

Dosavadní stav techniky

Dyslipoproteinémie jsou poruchy metabolismu lipoproteinů, které odpovídají za transport lipidů, jako je cholesterol a triglyceridy, v krvi a periferních' tekutinách. Mají za následek vážné patologické stavy, spojené s hypercholesterolémií nebo hypertriglyceridémií, jako je zejména ateroskleróza.

Ateroskleróza je polygenní komplexní nemoc, které je z histologického hlediska definována depozity (lipidové nebo fibrolipidové .pláty) lipidů a dalších krevních derivátů ve stěně velkých arterií (aorta, koronární arterie, karotidy). Tyto pláty, které jsou do větší či menší míry kalcifikovány • *· ·· ···· ·· ··········· • · · · '· · · « ·· · • ···· ········ • · · · · « · ··· ···· ·· «·· ·· «φ _? podle progrese nemoci, mohou být sdruženy s lézemi, a jsou spojeny s akumulací tukových depozit v arteriích, které se skládají zásadně z esterů cholesterolu. Tyto pláty jsou doprovázeny ztluštěním arteriální stěny s hypertrofií hladkého svalstva, výskytem pěnových buněk a akumulací fibrózní tkáně. Ateromatózní plát je umístěn zcela jasně do reliéfu stěny, čímž je zodpovědný za zúžení při vaskulárních okluzích způsobených ateromem, trombózou nebo embolií, které se objevují u nejvíce postižených pacientů.

Hypercholesterolémie může mít proto za následek velmi vážné kardiovaskulární patologické stavy, jako je infarkt, náhlá smrt, srdeční selhání, cerebrovaskulární příhody apod.

Je proto obzvláště důležité zajistit dostupnou léčbu, která umožní v určitých patologických situacích snížit plazmatickou hladinu cholesterolu nebo dokonce stimulovat eflux cholesterolu (reverzní transport cholesterolu) v periferních tkáních, aby se vyprázdnily buňky, které mají akumulovaný cholesterol, a to vše v souvislosti s vytvářením ' ateromatózního plátu. Cholesterol je' přenášen v krvi různými lipoproteiny včetně lipoproteinů o nízké hustotě (low density lipoproteins” - LDL) a lipoproteinů o vysoké hustotě (high density lipoproteins - HDL). LDL se syntetizují v játrech a umožňují zásobování periferních tkání cholesterolem. Na rozdíl od toho HDL vychytávají cholesterol v periferních tkáních a přenášejí ho do jater, kde ¹je ukládán a/nebo degradován.

Mezi nejběžnější dyslipémie patří ty, které jsou charakterizovány vysokou hladinou LDL (low density lipoprotein) cholesterolu a hypoalfalipoproteinémií. Pro tu je charakteristická hladina HDL (high density lipoprotein) cholesterolu menší než 0,35 mg/1 (35 mg/dlj a představuje 40 % případů dyslipémie (Genest et al., ,1992).

• ft ·* ···· • ft ftft ft ftft · • · · • · · · ·

Hypoalfalipoproteinémie se zdá být spojena s genetickým deficitem jednoho nebo více proteinů zapojených do syntézy, zráni a rozpadu HDL částic a jejím důsledkem je často časný výskyt kardiovaskulárních onemocnění (Dammermann et al., 1995). Obecně je opačná korelace mezi incidencí uvedených onemocnění a hladinami HDL částic (Miller et al. , 1987) .

Protektivní účinek HDL proti ' kardiovaskulárním onemocněním byl dokázán pokusy s přenosem genů irc vivo u kmenů myší s pravděpodobným rozvojem aterosklerotických lézí, u kterých zvýšení počtu HDL částic inhibuje rozvoj těchto lé.zí (Rubín et al., 1991; Plump et al., 1994) . Uvažuje se o tom, že protektivní účinek HDL částic může být způsobený jejich úlohou v reverzním transportu cholesterolu (Reiche et al., 1989). Reverzní transport j.e proces, kterým se přenáší nadbytečný cholesterol z periferních tkání do jater a je odstraněn (obrázek 1). Skládá se z řady stupňů zahrnujících vychytávání a esterifikaci cholesterolu do HDL částic, a také jeho přenos do částic lipoproteinů o nízké hustotě, které jsou pak opět vychytávány játry a tento proces ovšem také zahrnuje účast celé řady proteinů, jako je CETP, enzymů včetně cholesterolacyltransferázy a jaterní lipázy (a/nebo jejich kofaktorů, jako jsou apolipoproteiny AI a AIV).

Zatímco pro snižování hladin LDL cholesterolu a triglyceridů existuje účinná léčba založená na hypolipidemických a antihypertenzivních lécích, .je léčení hypoalfalipoproteinémie v současnosti účinné pouze omezeně.

Předkládaný vynález se konkrétně týká léčení patologických stavů spojených s hypoalfalipoproteiném.ií, a sice genovou terapií.

Terapeutický přístup navrhovaný v předkládaném vynálezu směřuje ke zvýšení kinetiky reverzního transportu cholesterolu, aby se vyvolala regrese aterosklerotických· lézí »· *· ··«·

• · · · • · · · • · · · · · nebo aby se alternativně zabránilo jejich tvorbě. Tohoto cíle se podle vynálezu výhodně dosáhne prostřednictvím simultánní a účinné exprese alespoň dvou proteinů, enzymů nebo kofaktorů zapojených do reverzního transportu cholesterolu v buňkách, které mají být léčeny.

Pro účely vynálezu, je protein, enzym a/nebo jeden z jejich kofaktorů považován za zapojený do reverzního transportu cholesterolu, pokud jakákoliv porucha úrovně jeho buněčné koncentrace automaticky ovlivní reverzní proces cholesterolu.

Jako představitel takových enzymů- může být zmíněna konkrétně lecitincholesterolacýltransferáza a jaterní lipáza.

Lecitincholesterolacyltransferáza (LCAT) je glykoprotein o velikosti 67 kD, syntetizovaný v játrech, který katalyzuje přenos acylové skupiny z lecitinu na cholesterol, a tím tvoří lysofosfatidylcholin a estery cholesterolu (Glomset, 1968). Kofaktorem pro tento enzym je apolipoprotein AI, který je vázán na povrch HDL částic. Tím, žé udržuje koncentrační gradient cholesterolu mezi periferními buňkami a HDL, má základní úlohu v prvním stadiu reverzního transportu cholesterolu

Lidská jaterní lipáza (HL) je glykoprotein o velikosti 66 kD s aktivitou triglyceridhydrolázy a fosfolipázy, který je syntetizován a secernován hepatocyty. Navázán na povrch hepatických buněk se prostřednictvím proteoglykanů heparinsulfátu účastní metabolismu chylomikronů IDL (intermediate density lipoproteins - lipoproteiny o střední hustotě) a HDL. HL má obzvláštní afinitu pro velké HDL částice, jejichž fosfolipidy a triglyceridy štěpí, a tím tvoří ' diskoidní částice HDL, které mají tu vlastnost, že přijímají buněčný cholesterol. Deficit HL u člověka je charakterizován velkým množstvím LDL bohatých na • 4 44·· • 4 4 · · • .4 4444 • * · 4 • 4 4

444 4 44 444

44

4 4 4 • 4 4 4 • 4 444 444

4 4

44 triglyceridy, velké HDL ' částice aterosklerózy (Hegele et al., 1993)'.

Co se týče proteinů, pro časným rozvojem účely vynálezu jsou nej výhodnějšími protein přenášející estery cholesterolu (CETP), apolipoproteiny AI a AIV nebo jedna z jejich variant.

Protein přenášející estery cholesterolu (CETP) je glykoprotein o velikosti 74 kD syntetizovaný v tukové tkáni a játrech. V plazmě je spojený hlavně s HDL. Zde katalyzuje přenos esterů cholesterolu z HDL na lipoproteiny o nízké' hustotě. Tento přenos je následován přechodem triglyceridů z lipoproteinů o nízké hustotě na HDL. Nadměrná exprese CETP u transgenních' hypertriglyceridemických myši inhibuje rozvoj aterosklerotických lézá (Hayek et al., 1995). Tento .pokus je v souladu s pozorováním, že u jedinců deficitních v CETP se časně rozvíjí kardiovaskulární onemocnění (Zhong et al., 1996) .

Apolipoprotein AI je protein skládající se z 243 aminokyselin, který je syntetizován ve formě pre-propeptidu S 267 zbytky, který má molekulovou hmotnost 28 000 D. U člověka je syntetizován specificky v játrech a. ve střevě a tvoří základní protein HDL částic (70 % jejich hmotnosti proteinů). V plazmě je hojný (1.0-1.2 g/1) . Jeho nejlépebiochemicky charakterizovaná aktivita je aktivace lecitincholesterolacyltransferázy (LCAT), ale připisují se mu další, četné aktivity, zejména stimulace efluxu buněčného cholesterolu. Apolipoprotein AI má hlavní úlohu v odolnosti k ateroskleróze, spojenou s reverzním cholesterolu.

a sekvencován 3917, 1984).

Jeho gen, dlouhý transportem byl klonován

1863 bp, (Sharpe et al., Nucleic Acids Res., 12(9),

Mezi proteinovými produkty s aktivitou typu apolipoproteinu AI mohou být zmíněny' zejména přirozené varianty popsané v dosavadním stavu techniky.

• 44 44 4444 44 44 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 « 4 444 4 4 4 4 • 444 4 44 444444

4 4 4 · 4 4

444 4444 44 444 44 44

Apolipoprotein AIV (apoAIV) je protein skládající se z 376 aminokyselin, který je specificky syntetizován ve střevě ve formě prekurzoru s 396' zbytky. Co se týče jeho fyziologické aktivity, je známo, že může aktivovat in vitro lecitincholesterolacyltransferázu (LCAT) (Steinmetz et al., J. Biol. Chem., 260: 2258-2264, 1985) a že může, jako apolipoprotein AI, ' interferovat s vazbou HDL . částic na endotelové buňky hovězí aorty (Savion et al., Eur. J. Biochem., 257: 4171-4178, 1987). Tyto dvě aktivity naznačují, že apoAIV velmi pravděpodobně působí jako mediátor reverzního transportu cholesterolu. Gen apoAIV byl klonován a popsán v dosavadním stavu techniky (viz zejména WO 92/05253). Mezi proteinovými produkty s aktivitou typu apolipoproteinu AIV se mohou uvést zejména fragmenty a deriváty popsané v patentové přihlášce FR 92 00806.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je, přesněji řečeno, založen na použití rekombinantnich virů, které umožňují přenos a expresi alespoň dvou nukleových kyselin kódujících .enzymy, proteiny a/nebo kofaktory zapojené do reverzního transportu cholesterolu.

Přihlašovatel neočekávaně prokázal, že je možné účinně zajistit přenos a expresi alespoň dvou nukleových kyselin téhož rekombinantního viru, a to tak, že se integrují tyto nukleové kyseliny do uvedeného viru ve formě bicistronové jednotky. Je jasné, že použití jednoho viru místo dvou, má z léčebného hlediska četné výhody.

Především je výhodnější konstruovat jeden rekombinantni virus inkorporácí dvou genů, než dva příslušné rekombinantni viry.

- · · · , • · * · • · • «· <

• · • t ···· • · · • · ··· • * '· · • · · ·· ··· ·· • · • · ·· · ·· • · • · ··· ··

Podobně z léčebného hlediska použití vektoru, jak je uvedeno v patentových nárocích, umožňuje snížit množství rekombinantního viru nezbytné pro expresi uvedených genů na' polovinu. To je nejvíce prospěšné zejména ve světle imunitní odpovědi obvykle se projevující proti buňkám infikovaným rekombinantními viry. Táto imunitní odpověď má normálně za následek zničení infikovaných buněk a/nebo závažnou zánětlivou odpověď. Je jasné, -že tyto dva projevy jsou na úrovni trvání exprese' terapeutických genů, a tudíž očekávaného léčebného účinku, velmi škodlivé.

Konečně, účinný přenos a vyrovnaná koncentrace dvou rozdílných rekombinantních virů je nejistý jev, který je proto nutné kontrolovat dalšími způsoby. V případě použití rekombinantního viru podle vynálezu je možné se bez tohoto typu kontroly výhodně obejít.

Viry podle předkládaného vynálezu jsou výhodně, schopné přenosu a účinné exprese, po dlouhou dobu a bez jakéhokoliv cytopatologického působení, dvou nukleových kyselin kódujících proteiny, enzymy a/nebo kofaktory zapojené do reverzního transportu cholesterolu.

První předmět vynálezu proto je defektní rekombinantní virus obsahující alespoň dvě nukleové kyseliny kódující enzymy,, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné a jsou zapojeny do reverzního transportu, cholesterolu, uvedené, nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny jedna od druhé sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES).

Nukleové kyseliny jsou výhodně vybrány z genů kódujících celou nebo část · lecitincholesterolacyltransferázy (LCAT), proteinu přenášejícího estery cholesterolu (CETP), jaterní lipázy (HL), apolipoproteinů AI a AIV nebo jedné z jejich variant.

• 4 4444 > 4 · » 4 444 »44 » 4 4

444

44

4 4 4

444 444

4

44

Vložené' nukleové kyseliny mohou být fragmenty komplementární DNA (cDNA), genomové DNA (gDNA) nebo hybridní konstrukty skládající se například' z cDNA, do které bylo vloženo jeden nebo více intronů. To mohou být syntetické nebo semisyntetické sekvence. Jak je uvedeno výše, tyto sekvence mohou být gen kódující celý nebo část. jednoho z enzymů, proteinů a/nebo kofaktorů zapojených do reverzního transportu cholesterolu, nebo jejich varianty. Pro účely vynálezu označuje termín varianta každou mutantu, fragment nebo peptid mající alespoň jednu biologickou vlastnost uvažovaného proteinového produktu, a také, kde je to vhodné, jejich příslušné přirozené varianty.

Tyto fragmenty a varianty mohou být získány každou technikou odborníkovi známou a zejména genetickými a/nebo chemickými a/nebo enzymatickými modifikacemi. Genetické modifikace zahrnují suprese, -delece, mutace apod.

Vložené nukleové kyseliny pro účely vynálezu jsou výhodně geny kódující celé nebo části odpovídajících lidských enzymů, proteinů a/nebo kofaktorů. Výhodněji to jsou cDNA nebo gDNA.

Každá vložená nukleové kyselina může také obsahovat aktivační nebo regulační sekvence -nebo podobně. Kromě toho obecně obsahuje v protisměru (upstream) od kódující sekvence signální sekvenci , řídící polypeptid syntetizovaný v sekrečních drahách cílové buňky. Tato signální sekvence může být jeho přirozená signální sekvence, ale může to být také jakákoliv další funkční signální sekvence nebo umělá signální sekvence.

Podle specifického provedení vynálezu obsahují rekombinantní viry podle vynálezu alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující LLGAT·. Výhodněji druhá, vložená nukleové kyselina kóduje HL, CETP nebo ApoAI.

• 9 AAAA AAA ·· A A ► A A · » A A A

AAA AAA • A

AA A A

Jak je jednoznačně uvedeno výše, společná exprese (koexprese) dvou uvažovaných nukleových kyselin je předběžně zajištěna prostřednictvím tvorby jedné RNA, která je poté translatována za vzniku dvou příslušných enzymů. Z těchto důvodů rekombinantní virus inkorporuje kromě dvou sekvencí nukleových kyselin alespoň jeden transkripční promotor, polyadenylační místo a sekvenci IRES.

^: Transkripční promotor je operativně spojen s kódujícími nukleovými kyselinami tak, že tvoří bicistronovou mRNA'a vede k expresi dvou příslušných enzymů z uvedené mRNA. Podle výhodného provedení vynálezu je umístěn přímo v protisměru (upstream) od první nukleové kyseliny.

Tento transkripční promotor může být vybrán zejména ze sekvencí, které jsou přirozeně zodpovědné za expresi uvedených nukleových kyselin, ve vztahu, ke které je umístěn v protisměru, ovšem za předpokladu, že tyto sekvence jsou schopné činnosti v infikované buňce. Mohou to být také sekvence různého původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů, nebo dokonce syntetické). Zejména to mohou být sekvence z eukaryotických nebo virových nukleových kyselin nebo odvozené sekvence, stimulující nebo potlačující transkripci genu specifickým' a indukovatelným způsobem nebo jinak. Jako příklad to mohou být promotorové sekvence pocházející z genomu buňky, kterou je žádoucí infikovat, nebo z genomu viru, zejména promotory adenovirových genů MLP a EIA promotor CMV, RSV-LTR, MT-1 a SV40 apod. Mezi eukaryotickými promotory mohou být zmíněny také všeobecně . se vyskytující promotory (HPRT, vimentin, α-aktin, tubulin apod.), promotory pro intérmediární filamenta (dezmin, neurofilamenta, keratin, GFAP apod.), promotory terapeutických genů (typu MDR, CFTR, faktor VIII apod.), tkáňově specifické promotory (pyruvátkináza, villin,· promotor pro střevní „protein vázající • 4 44 4

4444 • · 4 • 4 4 4 4 • · 4 4 • 4 4 • 4 444 • 4 • 4

4 • 44 . 4 ·

mastné kyseliny, promotor pro α-aktin buněk hladkého svalstva, promotory specifické pro. játra: ApoAI, ApoAII, lidský albumin apod.) nebo alternativně promotory, které odpovídají na stimul (receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové apod.). Kromě toho tyto expresní sekvence mohou být modifikovány přidáním aktivačních a regulačních sekvencí apod.

Co se týče sekvence IRES, pochází výhodně z pikorna-viru. Přesněji je tato’pikorna-virová'sekvence IRES derivována buď z viru encephalomyokarditidy nebo z' polio-viru. Výhodněji je fragment derivovaný z viru encephalomyokarditidy přítomný ve vektoru pCITE-2a+ od firmy NOVAGEN.

V zájmu ujasnění bude konstrukt definovaný transkripčním promotorem, dvěma nukleovými kyselinami, polyadenylačním -místem a sekvencí IRES, která je mezi dvěma nukleovými kyselinami, dále v textu označovaný názvem bicistronová kazeta.

Viry podle předkládaného vynálezu jsou defektní, jinými slovy jsou neschopné autonomní replikace v cílové buňce. Obecně je genom defektních’ virů použit v rámci předkládaného vynálezu, a proto postrádá přinejmenším sekvence nezbytné pro replikaci uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď odstraněny (úplně nebo částečně), nebo učiněny nefunkčními, nebo substituovány jinými sekvencemi a zejména bicictronovou kazetou definovanou výše. Výhodně má defektní virus nicméně uchované sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.

Virus podle předkládaného vynálezu může být odvozen z adenoviru, viru přidruženého k adenovirům (AAV) nebo z retroviru. Podle výhodného provedení to je adenovirus.

Jsou různé sérotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Mezi těmito sérotypy jsou typy • ·* ·· «··· ·· ·· *· * · ··· · · · · • ······ · ·· · • ······ ·'· · · · · • · · · · · · ······· ·· ··· ·· ·· . 11 nebo 5 lidských adenovirů· (Ad. 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (viz přihláška WO94/26914) výhodně použité v rámci předkládaného vynálezu. Mezi adenoviry. zvířecího původu, které mohou být použity v rámci předkládaného vynálezu, mohou být zmíněny adenoviry původu psího, hovězího, myšího (příklad: Mávl, Beard et al., Virology, 75, 81, 1990), ovčího, prasečího, ptačího nebo alternativně opičího (příklad: SAV) . Výhodně adenovirus zvířecího původu je psí adenovirus, výhodněji adenovirus CAV2 [například kmen Manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)]. Výhodně jsou v rámci vynálezu použity adenoviry lidské nebo psí nebo smíšeného původu.

Výhodně je v genomu adenovirů vynálezu alespoň jedna oblast El učiněna nefunkční. Uvažovaný virový gen může být učiněn nefunkčním jakoukoliv technikou odborníkovi známou, zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo přidáním jedné nebo více baží k uvažovaným genům. Takové modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, například prostřednictvím technik, genetického inženýrství, nebo alternativně ošetřením mutagenními agens.

Další oblasti mohou být také modifikovány, zejména oblast E3 (WO95/02697) , E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649,

WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podle výhodného provedení obsahuje adenovirus . podle vynálezu alespoň jednu deleci v oblasti El a deleci v oblasti E3. Ve virech podle vynálezu ‘ výhodně delece v oblasti El sahá od nukleotidů 455 do · 3329 adenovirové sekvence Ad5. Podle dalšího výhodného provedení je bicistronová kazeta vložena na úrovni delece v oblasti El..

Předkládaný vynález se proto specificky týká defektního rekombinantního adenovirů charakterizovaného tím, že obsahuje alespoň dvě nukleové kyseliny kódující enzymy, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné a zapojené do • 4 4 • 44 444444 44

444 4 4 44 4 44

4 4 4444 4 44

4 444 44 444

4 4 4 4 4 4

4,« 44 4 4 '44 444 44 44 reverzního transportu cholesterolu, uvedené nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny jedna od druhé sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRESj .

Jako výhodné rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být zmíněny konkrétněji defektní rekombinantní adenoviry obsahující alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující LCAT a jednu nukleovou kyselinu kódující buď HL, CETP nebo ApoAI, přičemž uvedené nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním'¹ promotorem a odděleny jedna od druhé sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES).

Jako představitel těchto adenovirů mohou být zmíněny ty, které jsou uvedeny na obrázku 2, obsahující geny kódující LCAT a CETP, a pocházející ž homologní rekombinace mezi pXL2974 and pXL2822.

Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny jakoukoliv technikou odborníkovi známou (Levrero et al., Gene, 101, 195, 1991, EP 185 573; Graham, EMBO J., 3, 2917, 1984). Mohou být připraveny, zejména homologní rekombinací mezi adenovirem plazmidem nesoucím inter alia nastává · po adenovirů a bicistronovou kazetu. Homologní rekombinace společné transfekci (kotransfekci) uvedených plazmidu do příslušné buněčné linie. Použitá buněčná linie ,by měla být uvedenými prvky, a ii) výhodně i) transformovatelná zahrnovat sekvence . schopné komplementace genomové části defektního · adenovirů, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo, riziku rekombinace. Jako příklad linie může být zmíněna linie 293 lidských embryonálních ledvin (Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59,

1977), která konkrétně obsahuje, integrovanou do svého genomu, levou část genomu adenovirů· Ad-5 (12 %) nebo linie • · * 4 4 4 4 4 4 Η 4 « • 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4·4 4 4 4 » • 4 44 4 44 444444

4 4 4 4 4 4

444 4444 «4 444 44 44 schopné .komplementace funkcí El a E4, jak je popsáno obzvláště v přihláškách č. WO94/269.14 a WO95/02697. Dále adenoviry, které se. pomnožily, jsou získány zpět a purifikovány obvyklými technikami molekulární biologie, jak je ukázáno v příkladech.

Ale podle výhodného provedení vynálezu jsou adenoviry podle vynálezu připraveny podle nového postupu popsaného v patentové přihlášce WO96/25506, kde se používá ve funkci kyvadlového plazmidu prokaryotický plazmid obsahující genom rekombinantního adenoviru ohraničený jedním nebo více restrikčními místy nevyskytujícími se v uvedeném genomu. Tento protokol je schematicky uveden na obrázku 2. Tento postup je obzvláště výhodný, protože umožňuje obejít se bez použití druhého konstruktu poskytujícího další část virového genomu, s krokem rekombinace v'transkomplementační linii.

Druhý předmět předkládaného vynálezu se přesněji týká specifických prokaryotických plazmidů použitých pro produkci adenoviru podle vynálezu.

Podle výhodného provedení vynálezu tyto prokaryotické plazmidy integrují bicistronovou kazetu popsanou výše.

Přesněji řečeno je předmětem předkládaného vynálezu také prokaryotický plazmid obsahující genom adenoviru a alespoň dvě nukleové kyseliny kódující enzymy, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné a které jsou zapojené do reverzního transportu cholesterolu, přičemž tyto dvě nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny jedna od druhé sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo, IRES.

Prokaryotické plazmidy podle vynálezu výhodně obsahují první oblast umožňující replikaci v prokaryotických. buňkách a druhou oblast obsahující adenovirový genom ohraničený jedním nebo dvěma restrikčními místy nevyskytujícími se • 4

4444

4 4

4 444

4 4

444

4· 4 4 '4 4 4 ·

4 4 4

444 444

4

4 44 v uvedeném genonu, a ve které se vyskytují alespoň dvě nukleové kyseliny kódující enzymy, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné a které jsou. zapojené· do reverzního transportu cholesterolu, přičemž tyto dvě nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním’promotorem a odděleny jedna od druhé sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo, IRES.

Co se týče definic enzymů, proteinů a/nebo kofaktorů, které jsou rozdílné a které jsou zapojené do reverzního transportu cholesterolu, transkripčního 'promotoru, polyadenylačního místa, sekvence IRES, a také toho, co ovlivňuje jejich organizaci v uvedené kazetě, odkazuje se na to, co bylo popsáno výše.

Oblast umožňující replikaci v prokaryotických. buňkách, která je použita v patentovaných plazmidech, může být každý počátek replikace,, který je funkční ve vybraných buňkách. Může to být počátek replikace odvozený z plazmidu ze skupiny inkompatibility P (příklad = pRK290) , který umožní replikaci ve kmenech E. coli pol A. Obecněji to může být každý počátek replikace pocházející z plazmidu, který se replikuje v prokaryotických buňkách. Tento plazmid může být derivát RK2,· pBR322 (Bolivar et al., 1977), derivát pUC (Viera and Messing, 1982), nebo jiných 'plazmidů, které pocházejí’ ze stejné skupiny inkompatibility, tj . například z ColEl nebo z pMBl. Tyto plazmidy mohou být kromě toho vybrány z jiných skupin inkompatibility replikujících se v Escherichia coli. Mohou to být plazmidy pocházející z plazmidů patřících ke skupinám inkompatibility například A, B, FI, FII, Fill, FIV, Hl, Hll, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z nebo 9. Mohou být použity také jiné plazmidy, kromě jiných plazmidy, které se nereplikují v E. coli, ale v jiných hostitelích, jako jsou B. subtilis, Streptomyces, P. putida, ·· ···· > · · ·· ·· » · · 4 » · · 4 • · · · · 4

P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium nebo Clostridium. Výhodně jsou použity počátky replikace odvozené z plazmidů replikujících se v E. coli.

Jak bylo uvedeno výše, adenovirový genom. přítomný v pla.zmidech podle vynálezu je výhodně kompletní nebo funkční genom, tj. nevyžadující poskytnutí jiných oblastí, rekombinací nebo ligací, ke tvorbě virových zásobních kmenů ve vybraných enkapsidačních liniích.

Rekombinantní adenovirový genom výhodně obsahuje alespoň sekvence ITR nebo sekvenci umožňující . enkapsidaci. Ve výhodném provedení vynálezu postrádá tento použitý adenovirový genom celou nebo část oblasti El. Použitý adenovirový genom výhodně postrádá část oblasti El mezi nukleotidy 454 až 3328 (fragment PvuII-BglII) nebo 382 až 3446 (fragment Hinf I I-Sau3A).

Podle obzvláště výhodného provedení použitý adenovirový genom postrádá také celou nebo část oblasti Έ3 a/nebo E4. Podle specifického provedení vynálezu to je adenovirový genom postrádající oblasti El' a E3.

Patentované prokaryotické plazmidy přesněji obsahují v orientaci 5'-3' alespoň jeden počátek replikace funkční v pro.karyotických buňkách, první část adenovirového genomu obsahující virové ITR a ψ sekvence, transkripční promotor, první nukleovou kyselinu kódující enzym, protein a/nebo kofaktor zapojený do reverzního transportu cholesterolu, sekvenci IRES, druhou nukleovou kyselinu kódující' druhý enzym, protein a/nebo kofaktor zapojený do reverzního transportu cholesterolu, polyadenylační místo a, druhou, část adenovirového genomu obsahující oblast pIX-IVA2.

• · · · » « · ·

II · · · • · · · · ·

Prokaryotické plazmidy.podle vynálezu výhodně obsahují také oblast umožňující selekci . prokaryotických buněk obsahujících uvedený plazmid. Tato oblast se konkrétně může skládat z jakéhokoliv genu propůjčujícího produktu rezistenci, zejména na antibiotika. Tak mohou být zmíněny sekvence nukleových kyselin propůjčující rezistenci na kanamycin (Kan^c) , na ampicilin (Amp^r) , na tetracyklin (teť) nebo na spektinomycin, například, které jsóu v molekulární biologii všeobecně používány (Maniatis et al., 1989). Selekce plazmidů se může provádět se sekvencemi nukleových kyselin jinými než genů kódujících markéry pro rezistenci na antibiotika. Obecně to zahrnuje gen, který dává bakterii funkci, kterou již nemá (může shodovat s genem, který byl z chromozomu odstraněn nebo inaktivován) , t j.. gen v plazmidů obnovující tuto funkci. Jako příklad to může být gen pro transferovou RNA, který obnovuje defektní chromozomovou funkci (Somoes et al., 1991) .

Podle výhodného provedení vynálezu prokaryotický plazmid obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu, kódující LCAT, druhá nukleová kyselina se vybírá z kyselin kódujících CETP, HL nebo ApoAI.

Jako představitelé těchto prokaryotických plazmidů mohou být zmíněny zejména plazmidy pXL2974 a pXL3058, ukázané na obrázcích 4 a 6. Plazmid pXL2974 obsahuje v orientaci 5'-3' počátek replikace, gen pro rezistenci na spektinomycin, gen Sac B pro senzitivitu na sacharózu, virové ITR a ψ sekvence, promotor RSV, dva transgeny LCAT a CETP oddělené prostřednictvím IRES, polyadenylační místo a virové sekvence pIX a IVA2. Plazmid pXL3058 obsahuje v orientaci 5'-3' počátek replikace, gen pro rezistenci. na kanamycin, virové ITR a ψ sekvence, promotor RSV, dva transgeny LCAT a „intron+ApoAI oddělené prostřednictvím IRES, polyadenylační ··

I · > A • · · místo, virové sekvence pXI a IVA2 a gen Sac B pro senzitivitu na sacharózu.

Předkládaný vynález' se také vztahuje na plazmidové konstrukty použité pro konstrukci plazmidů a které také obsahují definovanou podle vynálezu.

Prokaryotické plazmidy podle těchto prokaryotických bicistronovou kazetu vynálezu mohou . být konkrétně získány transformací počátečního kyvadlového plazmidů obsahujícího bicistronovou kazetu definovanou podle vynálezu, jmenovitě obsahující sekvenci kódující transkripční promotor operativně spojený s dvěma nukleovými kyselinami kódujícími dva enzymy, proteiny - a/nebo. kofaktory, které j sou rozdílné a které jsou zapojené do reverzního transportu cholesterolu, polyadenylační místo, sekvenci IRES situovanou mezi uvedenými nukleovými kyselinami.

Jako představitelé těchto kyvadlových plazmidů mohou' být zmíněny' zejména plazmidy pXL2970 a pXL2984 .popsané na obrázcích 3 a 5. ·

Co se týče definic enzymů zapojených do reverzního transportu cholesterolu, transkripční promotor a sekvence IRES, a také toho, co ovlivňuje jejich organizaci v uvedené kazetě, odkazujeme se na to, co již bylo popsáno výše v textu.

Další předmět předkládaného vynálezu se týká jakékoliv prokaryotické buňky obsahující prokaryotický plazmid, jak je definován výše. Může to být konkrétně každá bakterie, pro kterou existuje vektorový systém, do kterého může být zavedena rekombinantní DNA. Například mohou být zmíněny Eschezichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti nebo bakterie rodu

ΒΒ ΒΒΒΒ

Β· ΒΒ Β Β Β Β ΒΒΒ Β

Β ΒΒΒ ΒΒΒ Β Β

ΒΒ ΒΒ léčení nebo spojených

Streptomyces. Tyto buňky se výhodně získají transformací podle technik odborníkům známým.

Předkládaný vynález se také týká použití rekombinantního viru, defektního rekombinantního viru nebo konstruktu kyvadlového plazmidu, jak je definován výše, pro přípravu farmaceutického přípravku zamýšleného -pro prevenci. patologických stavů s hypoalfalipoproteinémií včetně zejména ateřosklerózy a/nebo restenózy.

Předkládaný' vynález se také týká farmaceutického přípravku obsahujícímu jeden nebo více defektních rekombinantních- virů včetně adenovirů, jak je popsáno výše. Takové přípravky mohou být formulovány pro podávání místně, perorálně, parenterálně, ,intranazálně, intravenózně, intramuskulárně, subkutánně nebo intraokulárně apod.

Přípravek podle vynálezu výhodně obsahuje farmaceuticky přijatelná vehikula pro prostředek pro injekce. Mohou to být zejména izotonické sterilní solné roztoky (hydrogenfosfořečnan nebo dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý apod., nebo směsi těchto solí) nebo suché, zejména , lyofilizované přípravky, které umožní rekonstituci roztoků pro injekce po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku v závislosti na konkrétním léčeném případu.

Dávky virů použité pro injekci mohou být upraveny podle různých parametrů, konkrétně podle použitého způsobu podání, příslušného patologického stavu nebo požadované délky trvání léčby. Obecně jsou rekombinantní viry podle vynálezu formulovány a podávány ve formě dávek mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml. Termín pfu (plaque forming unit - jednotka tvořící plak) odpovídá infekčnosti suspenze virionů, a určuje se infekcí příslušné buněčné kultury a měřením, obecně po 48 hodinách, ·« ····

* ·· • · ·· ·· • · · • ο · ·· · · · · • · • · · · počtu plaků infikovaných buněk. Techniky pro určování titru pfu virového roztoku jsou v literatuře dobře popsány.

Předkládaný vynález poskytuje nový, velmi účinný přípravek ' pro léčení nebo prevenci patologických stavů spojených s hypoalfalipoproteinémií, zejména v oblasti kardiovaskulárních stavů, jako j.e infarkt myokardu, angína pectoris, náhlá smrt, srdeční selhání, cerebrovaskulární příhody, ateroskleróza nebo restenóza.

Kromě toho může být tato léčba aplikována jak na člověka tak na jakékoliv zvíře, jako jsou např. ovce, hovězí dobytek, domácí zvířata (psi, kočky apod.), koně, ryby apod.

Předkládaný vynález je podrobněji popsán pomocí následujících příkladů, které je třeba považovat za ilustrativní a neomezující.

Popis obrázků

Obrázek 1: schematické znázornění předpokládaného mechanismu reverzního transportu cholesterolu.

Obrázek 2: Znázornění protokolu pro produkci adenovirů homologní rekombínací v E. coli.

Obrázek 3: Protokol pro -konstrukci bicistronového kyvadlového plazmidů pXL2970 obsahujícího RSV-LCAT-IRES-CETP.

Obrázek 4: Protokol pro konstrukci prokaryotického plazmidů pXL2974 obsahujícího RSV-LCAT-IRES-CETP.

Obrázek 5: Protokol pro konstrukci plazmidů pXL2984 obsahujícího RSV-LCAT-IRES-HL.

Obrázek 6: Znázornění prokaryotického plazmidů pXL3058 obsahujícího RSV-ApoAI-IRES-LCAT.

444 4

«· ·· · · ·

4 4 4

444 444

4 «4 4 4

Příklady provedení vynálezu

I. MATERIÁL A METODY

1-1. MATERIÁL

1) Plazmidy použité pro konstrukci bicistronových rekombinantních adenovirů LCAT-IRES-CETP, LCAT-IRES-HL aLCAT-IRES-ApoAI jsou:

- pSK IRES (dodávaný firmou NOVAGEN)

- pXL2616 LCAT cDNA (Séguret-Macé et al., Circulation, 94 (9), 2177-21841, 1996)

- pCRII (dodávaný firmou INVITROGEN)

- pXL2794 (WO96/25506)

- pXL2757 (W096/25506) ,

2) Celková RNA získaná' z hepatocytů a buněk HepG2

3) Buňky 293, buňky lidské ledviny, obsahující gen kódující adenovirový protein El (Graham et al., 1977)

4) Bakterie Esch.eríchia coli: subtyp DH5a genotypu EndAl,recAl,hsdR17, supE44,I-,thy-1, gyrA,rel Al,lačZD M15,deoR⁺, F⁺,dam⁺,dcm⁺ (Woodcock et al., 1989)

5) Enzymy a restrikční pufry,byly od firmy New England Biolabs.

METODY

Obecné techniky molekulární biologie

Metody obvykle používané v molekulární biologii, jako jsou preparativní extrakce plazmidové DNA, centrifugace plazmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza v agarózovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, fenolová nebo fenol-chloroformová extrakce proteinů, etanolová nebo isopropanolová precipitace DNA

4444 44 44 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 44 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4

4444444 44444 4444 v solném médiu, transformace E. coli apod., jsou odborníkům dobře známy a jsou v literatuře podrobně popsány [Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spr.ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Ύ., 1982; Ausubel

F.M, et al. (vyd.), Current Protocols in Molecular Biology,

John Wiley & Sons, New York, 1987).

Plazmidy typu pBR322 a pUC. a fágy řady M13 jsou , komerčního původu (Bethesda Research Laboratories).

Pro ligace mohou být fragmenty DNA separovány podle své velikosti elektroforézou v agarózovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenol/chloroform, precipitovány etanolem, a poté inkubovány . za přítomnosti fágové T4 DNA ligázy (Biolabs) podle .doporučení dodavatele.

Doplnění přečnívajících 5' konců se může provádět Klenowovým fragmentem E. coli DNA polymerázy I (Biolabs) podle instrukcí dodavatele. Odstranění přečnívajících 3' konců se provádí za přítomnosti fágové T4 DNA polymerázy (Biolabs) použité podle doporučení dodavatele. Odstranění přečnívajících 5' konců se provádí kontrolovaným ošetřením s SI nukleázou.

Místně cílená mutag.eneze in vitro pomocí syntetických oligodeoxynukleotidů se může provádět podle metody vyvinuté Taylorem et al. (Nucleic Acids Res, 13, 8749-8764, 1985) za použití soupravy dodávaného firmou Amersham.

Enzymová amplifikace DNA fragmentů takzvanou technikou PCR (polymerázová řetězová reakce - Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science, 230, 1350-1354,

1985; Mullis K.B. a Faloona F.A., Meth. Enzym., .155, 335-350,

1987) se může provádět za použití DNA tepelného cyklovače (Perkin Elmer Cetus) podle doporučení výrobce.

Verifikace nukleotidových sekvencí . se může provádět metodou vyvinutou Sangerem et.al. (Proč... Nati. Acad. Sci.

4· ·· 4444 44 44 • · 4 4 4 44 4 44 4

4 · 4 4 4 4 · 44 4

4 44 4 44 444444

4 4 4 4 4 4

444.4 444 44 444 44 44

USA, 74, 5463-5467, 1977) za použití soupravy dodávané firmou Amersham.

Techniky buněčné kultury

a) Kultivace buněk

Buňky 293 se.pěstovaly na živném médiu Eagle (MEM, Gibco BRL) doplněném 10% fetálním telecím sérem (FCS, Gibco BRL) v .37°C a v 5% CO₂

b) Transfekce kultivovaných buněk

Buňky 293 pěstované na miskách o průměru 100 mm na médiu MEM doplněném 10% fetálním telecím sérem jsou transfekovány 1 mg DNA za.použití lipofektaminu (Gibco BRL). O šest hodin později je médium odstraněno a buňky se inkubují v kompletním médiu (MEM + 10% FCS) .. Supernatanty pěstovaných buněk transfekovaných rekombinantnimi plazmidy RSV LCAT-IRES-CETP, RSV LCAT-IRES-ApoAI a RSV LCAT-IRES-HL, a také kontrol s β-galaktosidázou, a supernatant netransfekovaných buněk,, se získaly 72 hodin po transfekci a uskladnily ve 4 °C. -Testy na aktivitu enzymů LCAT, CETP, ApoAI a HL se prováděly na 10 až 30 ml frakcích buněčného supernatantu za · použití lidské plazmy jako kontroly. ,

c) Produkce a purifikace rekombinantních adenovirů

Bicistronováá adenovirová DNA se získá homologní rekombinací v E. coli. Pak se linearizuje s PacI a virus se tvoří po transfekci buněk 293 . Buňky 293, tj . buňky transkomplementační v proteinu El, jsou transfekovány, za použití lipofektaminu, s 10 mg linearizované adenovirové DNA. Po té se na agaru s buňkami 293 v médiu MEM doplněném s 4% ♦4 4444 » 4 4 · » 4 4 4

444 444 • 4 444

FCS a po inkubaci 8 dnů v 37°C vyhodnotí plaky obsahující rekombínantní virus a analyzuje se jejich restrikční profil.

d) Infekce kultivovaných buněk

Infekce s 0.25, 0.5, a 1 ml supernatantu obsahujícího bicistronový rekombínantní adenovirus se provádí na 12jamkové destičce obsahující přibližně 4 x 10⁵ buněk 293. Po inkubaci 72 h ve 2 ml MEM doplněném 2% FCS se z infikovaných buněk sebral supernatant a testovaly se enzymatické aktivity.

Biochemické ověření výsledků in vitrc aj Test aktivity LCAT

Aktivita LCAT se určuje měřením konverze volného ¹⁴C-cholesterolu na esterifikovaný ¹⁴C-cholesterol za použití proteolipozomů jako substrátu způsobem popsaným Chenem et al. (1982). Proteolipozomy se připraví z fosfatidylcholinů, cholesterolu, ¹⁴C-choles terolu a apolipcproteinu AI a inkubuji se s 20 ml supernatantu transfek.ční kultury, která se testuje. Produkty (volný ¹⁴C-choles terol a esterifikovaný ¹⁴C-cholesterol) reakce se oddělí díky rozdílné rozpustnosti v organickém rozpouštědle chromatografii na tenké vrstvě a. detekují se autoradiografií na přístroji Instant Imager (Packard). ' Aktivita LCAT je vyjádřena jako procento esterifikovaného ¹⁴C-c.holesterolu na hodinu a na 20' ml testovaného supernatantu.

b) Test aktivity CETP

Aktivita CETP se určuje měřením kapacity tohoto enzymu přenášet estery cholesterolu z HDL částice (dárce) na částici LDL (příjemce). Substráty pro tuto reakci poskytla souprava firmy Wak-Chemie, Medical GmbH. Fluorescence cholesterol ···· ft · · ftft ftft ft • ft ··· • ft • · ftft linoleátu obsaženého v donorových částicích je zhášena v nativním stavu linoelátu a pouze v přítomnosti aktivního CETP, který katalyzuje transfer fluorescenční molekuly na akceptorovou částici,' a tato fluorescence může'být detekována v 535 nm. Aktivita CETP je vyjádřena jako hodnota intenzity fluorescence emitované v 535 nm na ' 30 ml testovaného tkáňového supernatantu a na hodinu.

c) Test aktivity HL i

Aktivita jaterní lipázy se stanovuje za použití syntetického triglyceridového substrátu ze soupravy Progen Biotechnik GmbH. Tento substrát obsahuje fluorescenční pyrenovou skupinu, která je v nativním stavu molekuly maskována trini.trof enolem a výsledek hydrolýzy trinitrofenolu je emise fluorescence ve 400 nm. Množství HL .(v pmol/1) obsažené ve 20 ml supernatantu se určí měřením intenzity fluorescence emitované ve 400 nm po inkubaci substrátu s testovaným vzorkem a za použití standardní plazmy ze soupravy..

d) Test apolipoproteinu AI '

Aktivita ApoAI se určuje za použití monoklonální protilátky anti-ApoAI. Destičky Immulon II (Dynatech) se povlečou monoklonální protilátkou' anti-ApoAI (10 mg/ml v uhličitanovém pufru pH 9, 6) , přes' noc se inkubují ve 4, °C,

a poté	' se saturuj i	s 2% BSA v PBS	pH	7.4	jednu hodinu ve
37 °C.	Buněčné supernatanty se pak	inkubuj i	jednu hodinu ve
37 °C,	volitelně ' po	naředění v PBS	2%	BSA.	Detekce se pak
provádí	inkubací	jednu hodinu	ve	37	°C se směsí

monoklonálních protilátek anti-ApoAI značených peroxidázou a naředěných 1/5000. Vazba .peroxidizovaných protilátek se • φ φφφφ ·· φφφφ φφ φφ • φ » φ · · φ φ φφφφ φ φφ φ « φ φ φ φ φφφ φφφ φφ φφφ

ΦΦ ΦΦ nakonec detekuje inkubací s 250 μΐ TMB (KPL) a odečtením destiček v 630 nm.

Shoda sekvencí vyšetřuje analýzou

Technika konstrukce kyvadlových plazmidú

Konstrukce bicistronových plazmidú jsou ukázány detailně na obrázcích 3 až 5. Získané bicistronové plazmidy jsou zároveň kyvadlové plazmidy, protože obsahují adenovirové sekvence pIX-IVa2 nezbytné pro rekombinaci. s virovým genomem. Tato · rekombinace nastává buď společnou transfekcí (kotransfekcí) s naštěpeným genomem pocházejícím z virové β-galaktosidázy (konvenční kyvadlový vektor) nebo dvojitou rekombinaci v E. coli (coli kyvadlový vektor).

různých plazmidových ' struktur se jejich restrikčního profilu. Toto vyšetření umožňuje vybrat rekombinantni klony, které budou sloužit pro následné klonování, a také pro ověření výsledků klonování. Restrikční enzymy jsou vybrány tak, aby podaly co nejvíce kompletní informaci o celé klonované cDNA a počtu .strategických míst pro klonování. Avšak tato kontrola neumožňuje vyloučit existenci určitých mutací, jako non-sense nebo substituční bodové mutace, které se mohou ohjevit v každém stadiu klonování. Takové mutace mohou být detekovány pouze kompletním sekvencováním příslušné cDNA. Konečná kontrola validity získaných konstruktů se dělá biochemickými testy enzymatických aktivit ACAT, CETP a HL in vitro, nebo detekcí přítomnosti ApoAI.

• 4 4 • 4 444 · · 4

4 4

444

4444

44 • 4 4 4 • 4 4 4

444 444

4

44

Příklad 1

Konstrukce kyvadlových plazmidů LCAT-IRES-CETP ' ’

1) Konstrukce konvenčního kyvadlového vektoru pXL2970

Expresní vektor pXL2968 RSV LCAT polyA bGH se získal na jedné straně štěpením plazmidů pXL2616, obsahujícího LCAT cDNA, a na druhé . straně .plazmidů pXL LPL, pod kontrolou promotoru RSV a v protisměru od polyadenylačního signálu bovinního růstového hormonu, restrikčními enzymy Sáli a Clal, a ligací výsledných fragmentů s T4 DNA ligázou.

Pro získání vektoru bylo provedeno:

Každý z plazmidů pXL RSV LPL (2 pg) a pXL2616 (2 pg) se štěpil 10 jednotkami (U) Clal, v pufru 4 (20 mM Tris acetát, 10 mM Mg-acetát,. 50 mM K-acetát a 1 mM- DTT). doplněném o 100 pg/ml acetylovaného BSA, po 90' ve 37 °C. Přidal še 100 mM NaCl a 10 U Sáli a reakční směs se opět inkubovala ve 37 °C dalších 90'. Po elektroforetickém rozdělení produktů štěpení na 0,7% agarózovém gelu byly pásy o velikosti 6,5 a 1,7 kb odpovídající pXLRSV a LCAT cDNA z gelu vyřezány a extrahovány pomocí kitu Qiaquick. Tyto dva pásy byly ligovány se 400 U T4 DNA ligázy po inkubaci př.es noc ve 14 °C.

Rekombinantní plazmid pXL2969 IRES-CETP vznikl z plazmidů Bluescript, který má CETP cDNA modifikovanou na jejím 5' konci zavedením místa Ncol za použití primeru pro PCR 5' GCCTGA-TAAC CATGGTGGCT GCCACAG 3' (sekvence id. č. 1). Plazmid takto modifikovaný byl štěpen s Ncol a Sal a klonován po směru od adenovirové sekvence IRES obsažené v plazmidů pSKIRES, který byl štěpen stejnými restrikčními enzymy následujícím způsobem:

• 44 44 4444 44 44 • 44 4 4 4 4 4 · 4 4 « 4 · · 4·4 · 4 4 4

4 4 · 4 4 · 444 444

4 4 4 4 4 4

444 4444 44 ··· 44 ·♦

2,5 pg plazmidu CETP a 2,5 pg plazmidu pSKIRES se štěpilo 10 U Ncol po 90' ve 37 °C v pufru 3 (50 mM Tris-HCl, mM MgO, 100 mM NaCl a 1 mM DTT) a bylo následováno štěpením 10 U Sáli po 90' ve 37 °C. Produkty štěpení byly podrobeny elek.trof oret ickému rozdělení a pásy 1,5 kb (CETP cDNA) a 3,5 kb se. extrahovaly a ligovaly za stejných podmínek, jaké jsou popsány v odstavci výše.

Aby se získal plazmid pXL2970, provedl se následující postup:

pg plazmidu pXL2968 se linearizovalo 10 U Sáli (pufr 3+BSA, 90' ve 37 °C) . DNA se poté extrahovala za použití soupravy Qiaquick a získala se v 50 pl vody předem zahřáté na 50 °C. Kohezivní konce vyplývající ze štěpení Sáli se zatupily inkubací s 5 U Klenowovy polymerázy po 15' ve 25 °C. DNA se . znovu extrahovala pomocí soupravy Qiaquick a defosfory.lovala se 2 U telecí intestinální fosfatázy (CIP) po 60' ve 37 °C. Plazmid pXL2969 (4 pg) se nejdříve štěpil

U Smál (pufr 4, 90' v 25 °C) , a poté 5 U HincII (pufr

3+BSA, 100 mM NaCl, 90' ve 37 °C) . Produkty štěpení dvou plazmidů se podrobily elektroforetickému rozdělení na 0,7% agarózovém gelu a pásy DNA o velikosti .8,5 kb (pXL2968) a 2,2 kb (IRES CETP cDNA) se extrahovaly soupravou Qiaquick a ligovaly se 400 U T4 DNA ligázy (obrázek 3).

Aktivity LCAT' a CETP plazmidu' pXL2970 se testovaly v supernatantu ' buněčné kultury buněk 293 tři dny po transfekci.

Aktivita LCAT tohoto plazmidu odpovídá 3,5 % esterů cholesterolu tvořených za hodinu a aktivitě CETP 120 % (tabulka 1 níže). Tyto hodnoty aktivity ukazují, že plazmid pXL2970 vskutku syntetizuje LCAT ' a CETP, které jsou katalyticky aktivní.

• A

A A A A

AAA AAA

A Ά

A A AA

2),coli kyvadlový plazmid LCAT-IRES-CETP

Při této technologii by měl kyvadlový vektor obsahovat:

- sekvence ITR (inverted terminál repeat - invertovaná terminální repetice) a ψ enkapsidační sekvence, které jsou nezbytné pro homologní rekombinaci v E'. coli, obklopující sekvenci LCAT-IRES-CETP,

- počátek replikace col El, který činí plazmid neschopný replikace ve kmeni C2110 E. coli, a tudíž umožňuje klonalitu rekombinantního plazmidu,

- sebevražedný gen sacharóza B (letální pro bakterie kultivované na sacharóze) a gen pro rezistenci na spektinomycin, který umožní selekci rekombinantního klonu.

Aby se vektor získal, byl bicistronový kyvadlový plazmid pXL2970 RSV LCAT-IRES-CETP štěpen s BstEII a Spěl tak, aby se zavedly sekvence ITR a ψ adenovirového genomu, a získal se tak coli kyvadlový plazmid·. Sekvence ITR a ψ se izolovaly štěpením plazmidu pXL2794 s BstEII a Xbal. Fragment , s tupým koncem obsahující kazetu spektiňomycin-sacharóza B získanou štěpením pXL2757 s EcoRV a Smál byl zaveden do kyvadlového plazmidu pXL2970 + '2794 linearizovaného s bFspI (obrázek 4) .

Experimetnálně se postup prováděl podle následujícího protokolu:

qg plazmidu pXL2970 se štěpilo 20 U BstEII (pufr 2: 10 mM Tris HCI, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM DTT; 90' v 60 °C), a pak 10 U Spěl (90' ve 37 °C) .

Výsledný fragment DNA se Extrahoval soupravou Qiaquick a defosforyloval 2 U CIP (60' ve 37 °C) . Plazmid pXL2794 se štěpil 20 U BstEII (pufr 2, 90' ve ' 60 °C) , pak následovalo 20 U Xbal (90' ve 37 °C). Pásy 6,5 kb (pXL2970) a 2,9 kb (ITR ψ a Kan^r z pXL2794), extrahované po elektroforetickém rozdělení, se ligovaly za použití T4 DNA ligázy (40 U) .

• *♦ ·· ···· ·· ·· ······· · · · · • · * · · · · · ·· · • · · · · · · ··· · ·· • · · · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ··

Výsledný plazmid pXL297.0+2794 (1,5 pg) se štěpil 5 U

FspI (pufr .4, 60' ve 37 °C) , extrahoval se pomocí soupravy

Qiaquick a ligoval ¹ (T4 DNA ligáza, 400 U) s fragmentem DNA velikosti 3,, 8 kb extrahovaným z gelu, který obsahuje kazetu sacB-spect^r pocházející ze štěpení plazmidu pXL2757 s 10 U Smál (pufr 4, 90' ve 25 °C), následovalo 10 U EcoRV (90' ve °C) .

Kyvadlový plazmid pXL2974 LCAT-IRES-CETP byl podroben první selekci na médiu se 'spektinomycinem a na médiu spektinomycin+sacharóza. Výsledky štěpení s Ncol (6,2 + 3 + 2,2 + 2 kb), Notl (13,5 kb) a EcoRV (1 + 3 + 9,5 kb) jsou v souladu's restrikční mapou uvedeného plazmidu.

Aktivita LCAT plazmidu pXL2974 odpovídá 2 % esterů cholesterolu tvořených za hodinu a aktivitě CETP 114 % (tabulka 1). Aktivity LCAT a CETP byly zjištěny na úrovni coli kyvadlového plazmidu LCAT-IRES-CETP.

Tabulka 1

	Aktivita LCAT	Aktivita CTEP
kyvadlový plazmid LCAT-IRES-CETP	3,5 +/- 0,2%	120 +/- 2 %
Coli kyvadlový plazmid LCAT-IRES- CETP	2 +/- 0,2 %	114 +/- 2 %

44 ·· 4444 ·· ··

4 4 4 · 4 '4 *4 4 · 4 **** * *4 *

4 4 44 4**44 *44 * * 4 4 4 4 4

444 444* 44 4*4 4* 44

Příklad 2

Konstrukce kyvadlového plazmidu RSV LCAT-IRES-HL

HL cDNA se klonovala za IRES ve vektoru Bluescript a fragment IRES-HL byl poté vložen způsobem podobným vektoru LCAT-IRES-CETP podle následujícího protokolu:

Plazmid pXL2971 (4 pg) ' se štěpil tak, aby se odstranilo místo Ncol, se 40 U BglII (pufr 3, 90' ve 37 °C) , a pak se 40 U Sáli po 90' ve 37 °C. DNA fragment o velikosti 2,5 kb (přibližná hmotnost 0,5 pg) , pocházející z těchto štěpení, byl po migraci a extrakci na gelu podroben kontrolovanému štěpení s Ncol (0,1-1 U Ncol/pg DNA) v pufru 4 po 60' ve 37 °C. Produkty štěpení se analyzují dělením na 0,7% agarózovém gelu a pás o velikosti 1,5 kb obsahující HL cDNA ABC, získaný s 0,5 U Ncol, je llgován (T4 DNA ligáza, 400 U) s fragmentem pSK IRES (1,3 pg) pocházejícím ze štěpení Ncol a Sáli (1 U každého enzymu, pufr 3, 37 °C) .

Konečný vektor je ukázán na obrázku 5. Odpovídající bicistronový kyvadlový plazmid LCAT-IRES-HL byl nazván pXL2984.

Tabulka 2

	Aktivita LCAT	Aktivita HL
Kyvadlový plazmid LCAT-IRES-HL	1,2 +/- 0,2 %	46 +/- 2 %

·« r··· • · · · • · ·«· . ·

4' ' 4 • 4 4

4 4 4 4

4 4 • 4 44*

4*44

Příklad 3

Konstrukce kyvadlového plazmidu ApoAI-IRES-LCAT

Obecný princip pro tuto konstrukci je totožný s předešlými. LCAT byl mutován pomocí PCR, včetně dalšího místa Ncol, umožňujícího jeho ligaci na správné místo za IRES. Jeho sekvence byla kompletně zkontrolována. Fragment IRES-LCAT byl poté ligován za ApoAI. Výsledný vektor je odvozen přímo z coli technologie a je nazván pXL3058 (obrázek

6). Po obvyklé dvojité rekombinaci byl výsledný virový vektor kontrolován na aktivitu. ApoAI byl detekován Westernovým přenosem a aktivita LCAT vyhodnocena na 1,3 % (šum pozadí • ·« ·· ··· · ·· 9· ·« · · 4» · ♦ * · · ♦

Β · · · ♦·· · · · · • · * · · · · ··· ··· • · · · · · · ·«· ···· ··- ··· ·· *»·

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 27 párů baží
	' (B)	TYP: nukleotid
	(C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: cDNA .

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

GCCTGATAAC CATGGTGGCT GCCACAG 27

Claims

Defektní. rekombinantní virus, který obsahuje alespoň dvě enzymy, proteiny a/nebo jsou' zapojeny do přičemž uvedené nukleové kyseliny kódující kofaktory, které jsou rozdílné ' a reverzního transportu - cholesterolu, nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny navzájem sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES)
2. Defektní rekombinantní virus podle nároku 1, kde nukleové kyseliny jsou vybrány z genů kódujících celý protein nebo, jeho část, a sice lecitincholesterolacyltransferázú (LCAT), protein přenášející estery cholesterolu (CETP), jaterní lipázu (HL) , apolipoproteiny AI a· AIV nebo jednu z jejich variant.
3. Defektní rekombinantní virus podle nároku 1 nebo 2, kde nukleové kyseliny jsou výhodně geny kódující celý nebo část z odpovídajících lidských enzymů, proteinů a/nebo kofaktorů.
4. Defektní rekombinantní virus podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde nukleové kyseliny jsou výhodně cDNA nebo gDNA.

Defektní rekombinantní virus z předchozích nároků, kde jedna kóduje LCAT.

podle kteréhokoliv z nukleových kyselin
6. Defektní rekombinantní virus podle nároku 5, kde , druhá nukleová kyselina kóduje CETP, HL nebo ApoAI.

«ί· · • · · ··
7. Defektní rekombinantní virus podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde transkripční promotor je výhodně vybrán z promotorů adenovirových sekvencí nukleových kyselin MLP a E1A a promotorů GMV, RSV-LTR, MT-1 a SV40.

Defektní rekombinantní ,virus podle z předchozích nároků, kde sekvence IRES z picorna-virů.

kteréhokoliv je odvozena
9. Defektní rekombinantní virus podle nároku 8, kde picornavirová ' sekvence IRES je odvozena z viru encefalomyokarditidy nebo z polioviru.
10. Defektní rekombinantní virus podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který postrádá alespoň ty úseky svého genomu, které jsou nezbytné pro jeho replikaci v infikované buňce.
11. Defektní rekombinantní virus podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který je výhodně adenovirus, výhodně lidský adenovirus typu Ad5 nebo Ad2 nebo adenovirus zvířecího původu.
12. Defektní rekombinantní adenovirus,. který obsahuje alespoň dvě nukleové kyseliny kódující enzymy, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné a jsou zapojeny do reverzního transportu cholesterolu, přičemž uvedené nukleové,kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny navzájem sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES).

4*4 4 ♦ 4 4 4 4 ··. 4 4

4 4 4 4 4 44 4 44 · • 4 4 · · · · · 4 4 4

9 ¢44 4 44 444444

4 4 4 · 4 4 4

444 4444 44 4 4 4. 44 44
13. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 12, který obsahuje alespoň jeden gen kódující LCAT a jeden gen kódující HL, přičemž uvedené geny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny navzájem sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo'(IRES).
14. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 12, který Obsahuje ' alespoň jeden gen kódující LCAT a jeden gen kódující apoA-I, přičemž uvedené geny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny' navzájem sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES) .
15. Defektní rekombinantní adenovirus, podle nároku 12, který obsahuje alespoň jeden gen kódující LCAT a jeden gen kódující CETP, přičemž uvedené geny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny .navzájem sekvencí · kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES).
16. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 15, který je odvozen z homologní rekombinace mezi pXL2974 a pXL2822.

I ,
17. Defektní rekombinantní adenovirus podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16, který obsahuje alespoň jednu deleci v úseku El a jednu deleci v úseku E3.
18 . Prokaryotický plazmid, který obsahuje adenovirový genom ,a alespoň dvě nukleové kyseliny kódující enzymy, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné a jsou zapojeny do reverzního transportu cholesterolu, přičemž uvedené nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním • ·· ·· ···· ·· ·· ··· · · · * · · · · • · ♦ · · · · · ·· · • · ·· · · · ······ • · · · · · · ······· *· ··· ·· ·· promotorem a odděleny navzájem sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES).
19. Prokaryotický plazmid, který obsahuje první úsek dovolující replikaci v prokaryotických buňkách a druhý úsek obsahující adenovirový genorn -ohraničený dvěma restrikčními místy, která nejsou přítomna v daném genomu, a který obsahuje alespoň dvě nukleové kyseliny kódující enzymy, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné, a jsou zapojeny do reverzního transportu cholesterolu-, přičemž uvedené nukleové kyseliny jsou operativně spojeny s transkripčním promotorem a odděleny navzájem sekvencí kódující vnitřní ribozomální vstupní místo (IRES).
20. Prokaryotický plazmid podle nároku 18 nebo 19, kde z adenovirového genomu jsou- odstraněny jeho úseky El-a E3.
21. Prokaryotický plazmid podle kteréhokoliv z nároků 18 až

20, který obsahuje virové sekvence ITR a ψ.
22. Prokaryotický plazmid podle kteréhokoliv z nároků 18 až

21, kde replikační počátek pochází z bakteriálního plazmidů vybraného ze skupiny obsahující RK2, pBR322 a pUC.
23. Prokaryotický plazmid, který obsahuje, v orientaci 5'- 3', alespoň jeden replikační počátek funkční v prokaryotických buňkách, první část, adenovirového genomu obsahující virové sekvence ITR a ψ, transkripční promotor, první nukleovou kyselinu kódující enzym, protein a/nebo kofaktor, které jsou , zapojeny do reverzního transportu cholesterolu, sekvenci IRES, druhou nukleovou kyselinu kódující enzym, • ·· ·····« ·· ·· • · · · · ·· · ·· · • * · · · · · · ·· · • · · · · ·· ······ • » · · · ♦ · ··· ···· ·· ··· ·* ·· protein a/nebo kofaktor, které jsou zapojeny do reverzního transportu cholesterolu, polyadenylační místo a druhou část adenovirového genomu obsahující úsek pIX-IVa2.
24 . Prokaryotický plazmid podle kteréhokoliv z nároků 18 až

23, který navíc obsahuje úsek- dovolující selekci prokaryotických buněk obsahujících uvedený plazmid.
25. Prokaryotický plazmid podle kteréhokoliv z nároků 18 až

24, kde alespoň jedna nukleová kyselina kóduje LCAT a druhá nukleová kyselina je vybrána, z nukleových kyselin kódujících HL, ApoAI nebo CETP.
26. Prokaryotický plazmid podle nároku 25, který je plazmid pXL2974 obsahující dvě. nukleové kyseliny kódující LCAT a CETP.
27. Prokaryotický plazmid podle nároku 25, který je plazmid pXL3058 obsahující dvě nukleové kyseliny kódující LCAT a ApoAI.

cholesterolu, operativně polyadenylační
28 . Kyvadlový plazmid, který obsahuje alespoň dvě nukleové kyseliny kódující'enzymy, proteiny a/nebo kofaktory, které jsou rozdílné a jsou zapojeny do reverzního transportu přičemž uvedené nukleové kyseliny jsou spojeny s transkripčním promotorem, místo a sekvenci kódující vnitřní ribozomální vstupní- místo (IRES), umístěnou mezi dvěma uvedenými, nukleovými kyselinami.

• 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 ·· i··» * 4 4 4 4 4 4 · • · 4 4444 · « · 4

4 4444 44444444

4 4 4 4 4 4 4

44 4 4444 4 4 44 4 4 4 44
29. Kyvadlový plazmid podle nároku 28, který je plazmid pXL2984 obsahující dvě nukleové kyseliny kódující HL a LCAT...
30. Kyvadlový plazmid podle nároku pX.L2970 obsahující dvě nukleové a CETP.

28, který je kyseliny kóduj plazmid ící LCAT
31. Prokaryotická . buňka . transformovaná prokaryotickým plazmidem podle kteréhokoliv· z nároků 18 až 27.

kteréhokoliv kteréhokoliv
32. Použití defektního rekombinantního viru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, rekombinantního adenoviru podle z nároků 12 až 17 nebo plazmidu podle z nároků 28 až 30 pro přípravu farmaceutického přípravku určeného . pro léčení nebo prevenci patologických stavů spojených s hypoalfalipoproteinémií.
33. Použití podle nároku 32 pro přípravu farmaceutického přípravku určeného pro léčení nebo prevenci ateroskierózy a/nebo restenózy.
34. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo několik defektních rekombinantních virů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, adenovirus podle kteréhokoliv z nároků 12 až 17 nebo plazmid podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30.
35. Farmaceutický přípravek vyznačuj ící podle t i . m, nároku 34 že je připraven

A A . AAAA

A A A

A AAAA • · A • A A

A A A Ά A

A A · A A A A A

A A A A

AAA AAA

A A

A A A A v inj ikovatelné formě a obsahuje 10⁴ až 10¹⁴ pfu/ml adenoviru.